基因工程3. 目的基因的分离 - 基因文库
基因工程的操作步骤
利用PCR技术扩增目的基因
原理: DNA双链复制 前提: 要有一段已知 目的基因的脱 氧核苷酸序列, 以便合成引物。
过程
预变性 增加DNA变性的概率
高温变性 解旋为单链
低温退火 引物与单链互补结合 适温延伸 在Taq酶的作用下合成
与模板互补的DNA双链 重复循环
归纳: 基因工程的基本操作程序. 构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法、显微注射法
4. 目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻译
基因操作的基本步骤
基因操作的基本步骤
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断,它能阻碍RNA聚合酶的移动, 并使其从DNA模板链上脱离下来,使转录终止。
RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质. 以模板转录 然后脱落
非编码区 编码区上游 启动子
编码区
非编码区 编码区下游 终止子
原核 细胞 的基 因结
构
编码区 能转录相应的信使RNA,能编码蛋白质
知识点二.基因工程基本操作的四个步骤
1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细 胞
4、目的基因的检测与鉴定
一、获取目的基因
目的基因主要是__编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因__
1.获取目的基因的途径
A.从自然界已有的物种中分离
B.人工合成
2.获取目的基因的方法
四、目的基因的检测与鉴定
检测:
是否插入目的基因 DNA分子杂交技术 是否转录 mRNA分子杂交技术 是否翻译 抗原—抗体杂交技术
第讲 目的基因的克隆与分离
第讲目的基因的克隆与分离引言目的基因是指在一项研究中，具有研究意义或实际应用价值的基因。
目的基因克隆和分离是分子生物学研究的重要环节，它们为后续研究提供了基础和保障。
本文将介绍目的基因克隆和分离的方法和技术。
一、目的基因的克隆1. PCR扩增PCR是聚合酶链反应的简称，是一种利用DNA聚合酶酶作用、在体外增加DNA序列数量的技术。
PCR扩增可以在保证目的基因序列一致性的前提下，扩增出足够的DNA量，用于后续实验。
PCR扩增的步骤一般包括模板DNA的选择、引物的设计和勘误、PCR反应体系的搭建等。
2. 基因文库筛选基因文库指的是将一个或多个组织的基因在体外克隆并构建而成的基因库。
基因文库筛选是一种在文库中选取目的基因的方法。
其中最常用的是基于杆菌的蛋白表达文库、细胞质体DNA文库和DNA合成文库。
基因文库筛选的步骤一般包括构建文库、传统筛选和高通量筛选。
3. 限制性内切酶切割限制性内切酶切割是指利用特定的酶切位点将DNA分割成碎片，然后选取目标DNA寻找需要的限制酶切片段的方法。
这种方法可以快速而准确地寻找目的基因，并进行克隆。
限制酶切割的步骤一般包括DNA提取、DNA质量检测、选取限制酶和体外反应等。
二、目的基因的分离1. 分子杂交分子杂交是指在体外或体内使某一脱氧核糖核酸（DNA）与另一种DNA或核酸杂交而形成方法的过程。
它的作用是寻找与目的基因DNA互补的DNA序列，并在该序列中分离目的基因。
分子杂交的步骤主要包括细胞培养和DNA序列的寻找和筛选等。
2. 化学合成化学合成是指通过化学方法合成目的基因的方法。
这种方法可以直接合成目的基因，只要知道目的基因的序列就可以了，不需要进行PCR扩增、克隆等操作。
化学合成的步骤主要包括碱基合成、链延伸、中间产物合成和连接、滤液等。
3. 通量基因测序通量基因测序也称为高通量测序，是一种快速且准确测定DNA或RNA序列的方法。
通过对目的基因进行测序，可以快速分离目的基因。
基因工程基本原理
基因工程基本原理
基因工程是通过改变生物体的基因组来实现对其性状的调控的技术。
其基本原理包括以下几个步骤：
1. 基因选择：从目标生物体中选择具有所需性状的基因。
2. 基因克隆：将目标基因从生物体中分离出来，通常通过
PCR等方法进行基因扩增。
3. 基因构建：将目标基因插入到载体DNA中，构建重组DNA。
载体可以是细菌、酵母或其他生物的染色体片段，一
般被称为质粒。
4. 基因转导：将重组DNA导入到宿主生物体中。
这通常使用
基因枪、电穿孔和细菌介导等技术来实现。
5. 检验与筛选：对转导后的宿主生物进行筛选，确认目标基因达到预期效果。
这可能需要对基因表达进行检测，例如通过PCR、基因表达测定等方法。
6. 基因表达：在宿主生物中，目标基因会被表达为蛋白质，进而影响其性状。
这可能需要使用特定的启动子、RBS和终止
子等元件来调控基因表达水平。
基因工程的基本原理就是通过这些步骤来实现对基因组的改造，从而达到人为调控生物性状的目的。
这项技术在农业、医学和
生物工程等领域有广泛应用，例如改良植物品种、生产特定药物和生物材料等。
第三章基因工程目的基因的获取分离
用氢氧化钠消化杂合双链 中的 mRNA 链
解离的第一链 cDNA 的 3‘末端就会形成一个发夹环 （发夹环的产生是第一链 cDNA 合成时的特性，原因 至今未知，据推测可能是 由帽子的特殊结构相关）
引导 DNA 聚合酶复制出第 二链，此时形成的双链之 间是连接在一起的
再利用 S1 核酸酶将连接处 （仅该位点处为单链结构） 切断形成平通过几种限制性内切酶切
割，所产生的基因组DNA片段与载体重组并克 隆，由此产N=ln（1DNA片段的出现概率。 f：是插入片段的大小与全基因组大小的比值。
第一：细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；
mRNA
总RNA
tRNA 第二：第一链 cDNA 合成；
rRNA 第三：第二链 cDNA 合成；
2 合成cDNA第一条链 第四：双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体
（1）随机引物引导法
并导入宿主中繁殖。
（2）oligo（dT）引导法
（1）随机引物引导法 5´
链 cDNA 为模板合成一段段互补的序列。同时，大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 3'--5'
cDNA 片段。这些 cDNA 片段进而核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链 cDNA 的
在 DNA 连接酶的作用下连接成一 3'-端部分消化掉，形成平端或差不多的平端。这
条链，即 cDNA 的第二链
种方法合成的 cDNA 在 5'-端存在几个核苷酸缺失， 但一般不影响编码区的完整。
查阅资料自学！
如何找回两膜或硝酸 纤维素滤膜之后，就可以同特异性
的核酸探针进行菌落或噬菌班杂交，
A 应用核酸探针分离克隆的目的基因 以便筛选出具有目的基因的阳性克 隆。这个过程叫做克隆基因的分离
目的基因的分离方法
目的基因的分离方法摘要：介绍了基因工程中分离所需目的基因的主要策略和最新进展。
总结了基因分离中的各种方法，主要有：直接酶切分离法，化学合成法，序列克隆法，功能克隆法，作图克隆法，表型差异克隆法，计算机辅助分离法等，并对其特点和适用范围进行了简单评述。
关键词：目的基因分离方法基因的分离方法都是根据基因的基本特性创建的，包括基因核苷酸顺序的特异性、基因在染色体上的位置特异性、基因编码的mRNA的特性和基因的差异表达等。
每种方法运用这些特性的一种或者多种，产生了各种各样的分离方法。
这些方法又相互之间组合，从而产生了可以在不同条件下有效分离目的基因的分离策略。
1 直接提取纯化此法只适用于分离多拷贝基因，而不适用于单拷贝基因。
并且所得到的目的基因纯度较低。
但是操作简单，对设备的依赖性很低，即使在很简陋的实验室里也能完成操作。
2 在体外用化学合成或酶促合成的方法取得目的基因通过对表达产物的分析和测序，可以预测目的基因的核苷酸序列，然后按照DNA碱基序列顺序，先合成DNA短片段，再通过DNA连接酶作用，将这些短片段依次连接成一个完整的基因。
人工合成基因的最大优点是能够根据需要合成突变基因，而且，所合成的是单基因，无其它有害基因，比较完整；缺点是只适用于较短的基因，操作比较难，费用也比较大。
目前这种方法主要用于PCR引物的合成，一些突变基因的合成等。
3 序列克隆——根据已知基因的序列克隆基因3．1 PCR扩增克隆当已知目的基因的序列时，通常采用PCR的方法来克隆基因。
基本原理和方法是：利用已知目的基因的序列，设计并合成一对寡核苷酸引物，提取所要从中分离基因的染色体DNA(RNA需要在逆转录酶的作用下合成cDNA的第1条链)，然后通过PCR反应来扩增特定的DNA片段。
扩增的片段经过纯化后，连接到合适的载体上，用酶切分析和序列分析测定所得到的重组子，并与已知基因的序列进行比较，来进行鉴定。
鉴定之后的DNA可以用于基因的表达。
基因工程复习资料
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因堆叠技术和dna重组技术，就是以分子遗传学为理论基为础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种dna分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内乌核酸酶就是一类能够辨识双链dna中特定核苷酸序列（辨识序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内乌核酸酶通常就是以第一次抽取至这类酶的生物的种名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字ⅰ、ⅱ、ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.dna连接酶：定义：dna连接酶也称dna黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接dna链3‘-oh末端和，另一dna链的5’-p末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的dna链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌dna连接酶、t4dna连接酶、tscdna连接酶、真核生物细胞辨认出的连接酶，例如酶ⅰ、酶ⅱ、酶ⅲ等多种类型。
4.dna片段的相连接方法：①具互补黏性末端dna片段之间的连接：可用e?colidna连接酶，也可用t4dna连接酶。
②尼奥罗末端dna片段之间的相连接：就可以用t4dna连接酶，并且必须减少酶的用量。
③dna片段末端修饰后进行连接：dna片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；dna片段5′端脱磷酸化后进行连接；dna片段加连杆或衔接头后连接。
5.dna聚合酶：①定义：dna聚合酶就是指用dna单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化剂制备一条与模板链序列优势互补的dna新链的酶。
基因工程概论(3)
5’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3’ … C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A… 5’
Zn2+
T-G-G-A-G-T… 3’
A-C-C-T-C-A… 5’
gap
核酸修饰酶 末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）：
TdT的基本特性：来自小牛胸腺
不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs 5’ p 3’ HO
3’ HO
TdT
5’ p 3’ HO AAAAAAAAAAA
Co2+
dATP AAAAAAAAAAAAAA OH 3’
p 5’
3 基因工程的基本条件
B 用于基因克隆的载体
载体的功能及特征
质粒（plasmid） 噬菌体或病毒DNA
考斯质粒（cosmid）
载体的功能及特征 载体的功能：
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
DNA pol I
5’ ppp dN Mg2+
3’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’
5’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ） ：
Klenow 酶的基本性质：
大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得C端三分之二的大 肽段，即为Klenow酶。 Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，
5’ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH
3’ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
… 3’
… 5’
基因重组技术
④ 转化
⑤ 筛选
5
⑥ 表达
3 基因重组技术 2 基因重组技术的工具酶 2.1 限制性核酸内切酶(Restriction endonuclease)——分子剪刀
定义
是一类以环状或线性双链DNA为底物，能识别 DNA中特定核苷酸序列，并在合适反应条件下使 每条链的一个磷酸二酯键断开，产生具3’-OH和 5’-P基团DNA片段的内脱氧核苷酸酶(endodeoxyribonuclease)。
17
寡核苷酸片段组装基因的方式 基因的组装：按设计要求用许多寡核苷酸片段装 配成完整基因的过程。 第一种方法是先将寡核苷酸 激活，带上必要的5’-P基团， 然后再与相应的互补寡核苷 酸片段退火，形成带有粘性 末端的双链寡核苷酸片段。 把这些双链寡核苷酸片段混 合在一个试管中，加上T4 DNA连接酶，使它们彼此连 接组成一个完整的基因或者 是基因的一个片段。
在识别序列内部或 附近特异切割
十分有用
距识别序列下游 2426bp处切割
有用
8
识别序列
定义
限制性核酸内切酶在双链DNA分子上能识别的 特定核苷酸序列。又称为识别位点、靶位点或切割 位点。
长度
4、5、6或7个核苷酸。
结构特点
具有双重旋转对称结构，即：回文结构 （palindromic sequence）。
简称 限制性内切酶、限制酶、内切酶。
6
种类
目前，已从近300种不同的微生物分
离出约500种限制性核酸内切酶。 类型（ 三种类型）
型酶、 型酶和 型酶。
若无说明，通常的限制性核酸内切 酶就是指 型酶。
7
三种核酸限制性内切酶的主要特性比较
特 性
酶分子的结构与功能 辅助因子 识别序列
基因工程习题答案
基因工程习题答案基因工程，又称DNA重组技术，是一种按照人们的意愿，将不同来源的基因按预先设计好的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品的技术。
基因工程在医学、农业、工业等领域都有着广泛的应用。
1. 基因工程的基本步骤：- 目的基因的获取：从生物体中提取出所需的基因。
- 基因载体的构建：将目的基因插入到载体DNA中，常用的载体有质粒、病毒等。
- 转化：将重组DNA分子导入宿主细胞。
- 筛选：通过特定的标记基因筛选出含有重组DNA的细胞。
- 表达：在宿主细胞中表达目的基因，产生所需的蛋白质或性状。
2. 基因工程的应用：- 农业：通过基因工程改良作物，提高作物的抗病性、抗旱性、产量等。
- 医学：生产重组蛋白药物，如胰岛素、干扰素等。
- 工业：利用基因工程生产特定的工业酶，提高生产效率。
3. 基因工程的伦理和安全性问题：- 伦理问题：基因工程可能涉及到对生物的改造，需要考虑其对自然生态的影响。
- 安全性问题：基因工程产品可能对人体健康和环境安全造成影响，需要严格的安全性评估。
4. 基因工程的前景：- 随着技术的进步，基因工程在疾病治疗、生物制药、环境保护等方面将有更大的发展空间。
- 同时，也需要加强相关法律法规的建设，确保基因工程的健康发展。
5. 习题答案：- 习题一：基因工程中常用的载体有哪些？答案：常用的载体包括质粒、噬菌体、人工染色体等。
- 习题二：基因工程在医学上的应用有哪些？答案：基因工程在医学上的应用包括生产重组蛋白药物、基因治疗、疾病诊断等。
通过以上内容的学习，可以对基因工程有一个基本的了解，同时认识到其在社会和科学发展中的重要性。
在实际应用中，需要综合考虑技术、伦理和安全等多方面因素，以确保基因工程的可持续发展。
基因工程
名词解释：1.启动子：启动子（promoter）是基因表达调控的重要顺式元件，是DNA链一段能被RNA聚合酶识别和结合并能起始mRNA合成的DNA序列，位于结构基因转录起始点上游。
2.基因工程：基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因在体外进行剪切和组合，然后与载体拼接，并通过载体转入到另一种生物体（受体）内，使其按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。
3.表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件，使目的基因能够表达的载体。
4.转化：DNA分子通过与细胞膜结合进入受体细胞并在细胞内稳定维持和表达的过程。
5.插入失活：外源DNA片段插入到载体的选择标记基因中而使此基因失活，丧失其原有的表性特征。
：酵母人工染色体，是进行大片段克隆的线状载体。
7.退火：当温度突然降低时，反应体系中寡核苷酸引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。
文库：是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA与适当的载体连接后转化受体菌形成的重组DNA克隆群。
：多个限制酶的单一切点，即多克隆位点。
10.同尾酶：有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但产生出相同的粘性末端，这类限制酶称为同尾酶。
质粒：考斯质粒是一类人工构建的含有λDNA cos序列和质粒复制子特殊类型的载体。
12穿梭载体：是指能在两种不同的生物中复制的载体。
载体：利用土壤根癌农杆菌中存在着一种诱导瘤细胞的质粒构建成的载体。
14.基因文库：从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。
15.融合型表达蛋白：蛋白质的N未端由原核 DNA 序列或其他 DNA 序列编码，C端由真核 DNA 的完整序列编码，蛋白质由一条短的原核多肽或具其他功能的多肽和真核蛋白质结合在一起，故称融合蛋白。
16.反转录酶：是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。
17.末端转移酶：一种能将脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)加到某DNA片段上3′-OH基上的酶。
基因工程目的基因获得的方法
基因工程目的基因获得的方法1. 引言基因工程是一种通过改变生物体的基因组来实现特定目的的科学技术。
基因工程的目的包括但不限于改善农作物品质、开发新药物、治疗遗传性疾病等。
在基因工程中，获得目的基因是关键步骤之一，本文将介绍几种常用的方法来获取目的基因。
2. 目的基因获得方法2.1 基因克隆基因克隆是最常用且经典的获得目的基因的方法之一。
该方法利用DNA重组技术，将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA上，形成重组DNA。
通过转化等手段将重组DNA导入宿主细胞中，使其复制和表达。
具体步骤如下：2.1.1 DNA片段获取首先需要从源生物体中获取所需DNA片段。
可以通过PCR扩增、限制性内切酶切割、合成等方式获得。
2.1.2 载体构建选择适当的载体，如质粒或噬菌体，并进行线性化处理。
然后将待克隆的DNA片段与载体进行连接，形成重组DNA。
2.1.3 转化将重组DNA导入宿主细胞中。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法、化学法等。
转化后，通过筛选和鉴定，获得含有目的基因的克隆。
2.2 基因合成基因合成是一种直接合成目的基因序列的方法。
该方法适用于无法通过其他方式获取目的基因序列的情况，或者需要对基因序列进行修改和优化时使用。
具体步骤如下：2.2.1 设计和优化根据所需功能和特定要求，设计目标基因序列。
可以根据已有序列进行修改和优化，如引入特定限制性内切酶切位点、调整密码子使用频率等。
2.2.2 合成将设计好的目标基因序列提交给合成公司进行合成。
合成公司通常采用化学方法或PCR扩增方法来合成目标基因。
2.2.3 克隆将合成好的目标基因插入到载体中，并进行转化过程，获得含有目的基因的克隆。
2.3 基因编辑基因编辑是一种通过直接修改生物体基因组来实现目的基因获取的方法。
常用的基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFN等。
具体步骤如下：2.3.1 设计和构建编辑工具根据目的基因序列，设计适当的编辑工具。
基因工程中的目的基因获得的方法
基因工程中的目的基因获得的方法
基因工程中获得目的基因的方法有以下几种：
1. PCR扩增法：利用聚合酶链反应（PCR）从一个已知源
DNA扩增目的基因的特定片段。
这种方法需要已知目的基因
的序列或者已知相关基因的序列来设计引物，通过PCR扩增
特定片段。
2. 基因合成法：利用化学合成技术合成目的基因的DNA序列。
这种方法可以通过合成多个片段，再进行连接而合成完整的目的基因。
3. DNA文库筛选法：构建基因文库，将源DNA片段插入载体中形成DNA文库。
然后利用对目的基因编码的蛋白质进行筛选，找出含有目的基因的载体。
4. 基因克隆法：将目的基因从一个生物体中剪切出来，然后将其插入到另一个载体中，形成重组DNA。
这种方法通常使用
限制酶切和连接酶进行DNA分割和连接。
5. 基因编辑法：利用CRISPR-Cas9、TALENs或ZFNs等基因
编辑技术，直接对细胞或生物体进行基因编辑，将目的基因插入到细胞或生物体的基因组中。
这些方法可以根据具体的实验需求和技术可行性来选择合适的方法来获得目的基因。
目的基因的分离
第十章目的基因的分离吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所第十章目的基因的分离一、引言1．基因分离技术发展简介2．基因分离技术迅猛发展的客观要求3．目的基因的分离二、分离克隆基因的若干主要方法1．应用核酸探针分离克隆的目的基因2．应用差别杂交法或扣除杂交法分离克隆的目的基因3．低丰度mRNA之cDNA末端的快速扩增RACE法4．根据蛋白质家族的保守序列鉴定新的相关基因5．通过表达载体分离特异的cDNA三、应用mRNA差别显示技术分离目的基因1．引言2．mRNA差别显示原理3．mRNA差别显示实验过程及其局限性四、DNA标签法分离目的基因1．原理2．转位子标签法3．T-DNA标签法五、酵终双杂交与单杂交体系1．酵母双杂交体系2．酵母单杂交体系3．酵母三杂交体系第十章目的基因的分离一、引言1．基因分离技术发展简介*1.在上个世纪70年代中期已经具备了分离基因的能力这主要是取决于当时重组DNA技术的发展水平，特别是发展出了安全的寄主菌株和克隆载体：第一个安全的大肠杆菌寄主菌株——X1776品系的诞生第一批安全适用的克隆载体pM19和pBR322的问世在上述这两个条件的基础上，分子生物学家成功地克隆出第一批基因。
*2.在上个世纪70年代末期克隆基因分离的能力明显提高这主要应归功于基因克隆策略的改变。
由于发展出了改良的寄主菌株和克隆载体，人们提出了先克隆cDNA再分离目的基因的新策略。
*3.在上世纪80年代克隆基因分离技术得到了进一步的提高20世纪80年代之后，由于如下技术的进步，使人们分离克隆基因的能力得到进一步提高，这些技术主要有如下几项：a.寡核苷酸合成技术的改良；b.操作RNA和DNA的酶学方法的进步；c.PCR技术的发展与应用；*4.目前科学家们已经掌握了先进的分离克隆基因的能力就目前的能力而言，可以说几乎任何期望克隆和分离的目的基因都是有可能被分离出来的。
其主要原因是：a.技术的进一步发展；b.基因组全测序工作的迅速进展与成功；c.未知产物的发育调节基因分离技术的发明，例如mRNA差别显示技术基因定位克隆技术DNA标签技术等2．基因分离技术迅猛发展的客观要求近年来基因分离技术的迅猛发展，特别是产物未知的发育调节基因分离技术的发展尤为迅速，已发展出了基因定位克隆技术、mRNA差别显示技术、DNA标签法分离目的基因的技术(包括T-DNA标签法和转座子标签法)、以及酵母双杂交和单杂交技术。
基因工程基本操作四个步骤
PCR技术—聚合酶链式反应
概念：
是一项在生物体外复制特定 DNA片段的核酸合成技术
原理：
DNA双链复制的基本原理
PCR扩增仪
前提：
一段已知目的基因的核苷酸序列
条件： 模板DNA
(含有目的基因)
四种脱氧核苷酸dNTP 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） 一对引物 温度控制
指数 方式扩增，即____ ④方式：以_____ 2n （n为扩增循 环的次数）
⑤结果：
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
⑥过程： a、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板 氢键 断裂，形成___________ 单链DNA 在热作用下，_____ b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 双链 。 物与DNA模板结合，形成局部________ c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 DNA链 。 的________
基因工程基本操作的四个步骤
1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
请阅读P9第一和二两段
编码蛋白质的结构基因 1、目的基因主要是指______________________
2、获取目的基多dna片断导入到受体菌的群体中各个取2基因表达载体的构建3将目的基因导入受体细胞4目的基因的检测与鉴定一目的基因的获取1目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因2获取目的基因的常用方法有哪些
利用PCR技术扩增目的基因
(二)利用PCR技术扩增目的基因 选修1 P60
多聚酶链式反应 ，是一项 ① 概念：PCR全称为_______________ 体外复制特定 DNA片段的核酸合成技术 在生物____ ___________ DNA双链复制 ②原理：__________ 已知基因的核苷酸序列 、 ③条件：_______________________ 四种脱氧核苷酸 、___________ 一对引物 (做启动子)、 _______________ DNA聚合酶 前提条件： ___________. 指数 方式扩增，即____ ④方式：以_____ 2n （n为扩增循 环的次数） ⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增(一)从基因中获取目的基因1.基因
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克隆总数不宜过大
载体的装载量应大于绝大数基因的长度
相邻基因片段之间必须具有部分重叠
克隆片段易于从载体分子上完整卸下来，
且不带有载体序列。
5.
重组克隆应能NA并片段化
物理方法： 搅拌超声波 生物化学方法： 酶
2.
DNA片段与载体重组连接
富集处理：一定大小范围的DNA
3.
逆转录
不同的发育阶段mRNA表达不同
不包含内库的保存
载体增殖
难保证重组分子均等增殖
蛋白产物已知 抗原－抗体检测
需要使用表达载体
筛选方并按等级进行样本池进行 分组
对样本池进行PCR扩增 依据电泳结果确定某样本池中是否含有阳性克隆 对含有阳性克隆的样本池分组
……….
直至获得单独的阳性克隆
噬菌体表面显示
制备PCR样本池分组筛选
利用噬菌体表面显示技术
菌落原位杂交
目的基因或其同源序列已知 编码的蛋白序列已知
推测核苷酸序列
1. 影印平板到滤膜 2. 破坏噬菌体外壳，并使噬菌体DNA结合在滤膜 3. 与含有放射性标记的探针杂交 4. 洗去膜上的非结合探针 5. 显示
免疫杂交筛选
使目的基因表达产物显示在噬菌体、细
菌或细胞的表面，然后根据产物的某些 生物化学性质检测筛选。
与外壳蛋白组成融合蛋白 抗体亲和纯化，分离出含有目的基因的噬菌
体
Thank You!
冷冻保存
分装，添加二甲基亚砜，-80摄氏度CDNA与基因组的比较 cDNA
cDNA 复杂性低，筛选容易。 能在细菌中表达
基因组包含所有遗传信息 可用于分析非编菌落原位杂交） 制备抗体进行免疫杂交筛选基因组2. 筛选所需的克隆子
Βιβλιοθήκη 3. 扩增4. 分离得到 f: 克隆片段的长度与生物单倍体基因组总长的比理想基因应具备的特点目的基因的分离
生物与食品工程学院基因组筛选目的基因 某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载
体贮存在一个受体菌的群体库
gene library
gene pool
群体中所有个体的基因型的集合