黑曲霉N25植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母中高效表达的研究

菌物系统20（4）：486~493, 2001Mycosystema黑曲霉N25植酸酶phyA基因在巴斯德毕赤酵母中高效表达的研究∗王红宁１，２ 马孟根１ 吴　琦１ 刘世贵２ 罗　燕１　(1四川农业大学动物科技学院四川・雅安 625014)(2四川大学生命科学学院成都 610041)摘要：从黑曲霉N25（A.niger China strain）中提取出染色体DNA，根据已经测定出的植酸酶phyA基因全序列设计了一对引物，采用高保真度的聚合酶Advangage-HF扩增到了去除信号肽和内含子后约 1.4kb片段，对该片段进行了克隆及序列测定。

将该序列与植酸酶phyA基因全序列进行了比较。

以此片段构建成功了pPIC9K-phyA载体（命名为pPNP-1），并转化毕赤巴斯德酵母。

经G418抗性筛选、酶活性测定、Southern印迹和Western印迹，获得了高效表达的转化子PP-NP-1（23869.4u/ml）、PP-NP-2（20533.0u/ml）、PP-NP-3（35646.7u/ml），其酶活性分别是出发菌株的酶活（513.4u/ml）的46.46倍、39.99倍和69.46倍，且转化子具有很好的遗传稳定性。

关键词：黑曲霉，植酸酶，phyA基因，毕赤酵母，高效表达中图分类号：Q939.96 文献标识码：A 文章编号：1007-3515（2001）04-0486-0493植酸酶是催化植酸（肌醇六磷酸）及植酸盐水解成肌醇与磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称。

大量研究表明，在猪、禽日粮中添加植酸酶，可使饲料中磷的利用率提高40%~60%，粪便中磷的排出量减少30%~50%（武素平，1996）。

植酸酶能使动物分解吸收饲料中的有机磷,提高整个饲料的利用率，因此，以能减少磷的排出和保护生态环境而得到世界公认（王红宁等，1999）。

自然界中产植酸酶的菌株有真菌、大肠杆菌、酵母等多种微生物，但它们的产量都很低,难以在生产中应用。

国外对植酸酶基因及表达的研究已有成功的报道（Van Hartingsveldt W et al , 1993；Piddongton C S et al, 1993； Pasamontes, L et al, 1997；Randy M Berka et al, 1998）。

Yanming 等（1999）将植酸酶phyA基因导入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中进行了表达，接着又将其重组到了表达载体pPICZaA中，再导入毕赤巴斯德酵母Pichia pastoris得到了高效表达（1999）。

姚斌等(1998)将植酸酶phyA基因连接到表达载体pPIC9，表达出了有活性的植酸酶。

但以上三个试验所采用的载体都难以获得高拷贝数的插入片段。

而有试验证实外源基因的拷贝数与表达产量直接相关(Clare, et al,1991；Clare, et al,1991a；Scorer, et∗获国家科技部“九五”国家重点科技攻关计划资助，专题编号99-009-02-02收原稿日期：2000-08-28，收修改稿日期：2001-05-184期王红宁等：黑曲霉Ｎ２５植酸酶ｐｈｙＡ基因在毕赤巴斯德酵母中高效表达的研究　487al,1994)。

本研究以自行分离的天然植酸酶高产菌株黑曲霉N25（China strain）为出发菌株，在进行了植酸酶phyA基因全序列测定及注册（王红宁，2001）的基础上，设计引物扩增去除信号肽和内含子后的phyA基因表达片段，选择了可获得高拷贝数表达片段的毕赤巴斯德酵母表达载体pPIC9K作为载体，构建了植酸酶的表达载体pPNP-1，并转化毕赤巴斯德酵母，获得了高效表达的转化子。

现将结果报道如下。

1材料与方法1.1 黑曲霉Ｎ２５植酸酶ｐｈｙＡ基因表达片段的扩增、克隆及序列测定1.1.1黑曲霉N25植酸酶phyA基因表达片段的扩增：黑曲霉N25（Aspergillus niger China strain）：本研究者从我国自行分离鉴定的产植酸酶黑曲霉菌株。

黑曲霉染色体DNA的提取：按Ehrlich等（1995）的方法并加以改进后进行。

根据用Taq酶测定出的黑曲霉N25植酸酶phyA基因的全序列（GenBank Accession No. AF218813），参照Yanming（1999）和姚斌等(1998)的报道设计一对引物（扩增产物中不含信号肽和内含子）（上游引物-5’cggaattcctggcagtccccgcctc3’，下游引物-5’gcggtaccgcggccgcctaagcaaaacactcc3’）；按以下参数进行扩增反应：水 75ìl, 10×buffer 10ìl, dNTP 8ìl, 模板DNA 500ng, 引物各80pmol/L, 聚合酶（Advantage-HF PCR扩增试剂盒，Clontech公司）2ìl （10u）, 总体积100ìl，上面覆盖10ìl石蜡油；循环参数为：94℃5min， 94℃1min、62℃1min、72℃2min，30个循环后72℃延伸10min。

1.1.2黑曲霉N25植酸酶phyA基因表达片段的克隆、序列测定及分析：从凝胶上回收纯化1.4kb 左右的条带。

将纯化的DNA和pUC18质粒DNA分别用Eco RⅠ和KpnⅠ进行双酶切。

按《分子克隆实验指南》（第二版）（金冬雁，黎孟枫等译，1998）进行连接、转化、阳性克隆菌株的筛选及电泳鉴定。

从已经鉴定的阳性克隆菌株中抽提出质粒，送宝生物工程（大连）有限公司进行DNA序列测定。

参照本研究前期工作已完成的用Taq酶扩增出的黑曲霉N25植酸酶phyA基因的全序列（GenBank Accession No. AF218813），对表达片段进行分析、比较。

1.2黑曲霉Ｎ２５植酸酶ｐｈｙＡ基因酵母表达载体的构建pPIC9K载体：Invitrogen公司；DH5α：GIBCO BRL公司。

从克隆菌株JM109中抽提出含有N25植酸酶基因phyA表达片段的重组pUC18质粒。

用Eco R I和Not I两种酶对重组质粒进行双酶切，从凝胶上回收纯化与PCR产物一样大小的片段。

用Eco R I和Not I两种酶双酶切pPIC9K质粒。

按《分子克隆实验指南》（第二版）（金冬雁等译，1998）进行表达片段的连接和转化。

采用原位杂交法进行阳性克隆的筛选（孙士勇等译，1992；彭秀玲等编著，1997）。

并进行酶切鉴定。

1.3黑曲霉Ｎ２５植酸酶ｐｈｙＡ基因在毕赤巴斯德酵母中的高效表达1.3.1重组表达载体的线性化处理、电击转化及筛选：将构建的重组表达载体pPIC9K-phyA 质粒，经Bgl II内切酶线性化处理，进行回收纯化。

接种酵母菌株P. pastoris GS115于500ml YPD液体培养基（1%酵母提取物， 2%蛋白胨，2%葡萄糖）中，28℃，200r/min培养至OD600=1.5，1500×g离心收集菌体，用500ml，250ml预冷的无菌去离子水洗涤菌体，离心收集菌体后，用20ml预冷的1mol/L山梨醇重悬菌体，离心后菌体重悬于1ml预冷的1mol/L 山梨醇中。

等分细胞悬液80ìl/管，备用。

在80ìl制备好的细胞悬液中加入10ug线性化处理488 菌物系统20卷好的重组质粒，冰浴5min，用BTX Electro Cell Manipulator 600电击仪电击转化，参数为：1.0kV, 50uF。

电击结束后立即加入1ml预冷的1mol/L山梨醇，取200ìl在每个MD平板（1.34%YNB，4×10-5%生物素，2%葡萄糖，2%琼脂糖）上均匀涂布，30℃培养直到菌落出现。

吸取2ml无菌去离子水到每个含有His+转化子的MD平板上，用涂布器重悬菌体合并所有菌体后转移到50mL离心管中，涡旋5-10s，用分光光度计测定菌体浓度（1 OD600=5×107个/mL）。

在每个不同浓度G418（0，0.25mg/mL，0.50 mg/mL，0.75 mg/mL，1.00 mg/mL，1.50 mg/mL，1.75 mg/mL，2.00 mg/mL，3.00 mg/mL，4.00 mg/mL）的YPD平板上涂布1×105个菌。

30℃培养2~5d，每天检查菌落生长情况。

挑取具有G418抗性的所有菌落，进行纯化处理。

再将纯化的菌落分别点种到MM平板和MD平板，并设阳性对照GS115 Albumin （His+Mut s）和阴性对照GS115 β-gal（His+Mut+），30℃培养2d或更长时间，找出在MD 上生长正常，在MM上生长缓慢或不生长的菌落。

这些菌落即为阳性菌落。

1.3.2重组酵母的Southern印迹: 重组酵母于BMGY中培养达OD600=10后提取基因组DNA。

用光生物素标记好的植酸酶基因探针进行Southern印迹杂交检测（《分子克隆实验指南》（第二版），金冬雁等译，1998；孙士勇等译，1992；彭秀玲等编著，1997）。

1.3.3重组酵母的诱导表达: 将上面筛选到了阳性菌落接种于10mlBMGY（1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，4×10-5%生物素，1%甘油）中，30℃剧烈振荡培养至OD600=10~20，离心收集菌体，加入10ml诱导培养基（用0.5%甲醇代替BMGY中的甘油），30℃下继续诱导培养5~7d，从诱导开始记时，每隔12h进行酶活性测定，直到120h。

植酸酶酶活性单位（u）定义为：在一定条件下，每分钟释放出1nmol/L无机磷所需要的酶量为1u。

1.3.4表达产物的SDS-PAGE分析及Western印迹: 于50 ìl酶液中加入50ìl SDS-PAGE凝胶载样缓冲液，取20ìl加入凝胶中进行SDS-PAGE分析及Western印迹。

1.4转化子的遗传稳定性在转化子生长、诱导表达一个周期后，取1ml作为下一次生长、诱导表达的种子液继续培养，每次测定酶活性，共进行10轮。

另外，从第10轮的菌体中提取DNA进行phyA基因的杂交检测和酶活测定。

2结果2.1 黑曲霉Ｎ２５植酸酶ｐｈｙＡ基因表达片段的ＰＣＲ扩增反应结果见图1。

根据黑曲霉N25植酸酶phyA基因全序列分析，去除内含子和信号肽后的长度为1347bp。

从图1可以看出，获得的扩增片段长约1.4kb，与预计大小一致。

2.2黑曲霉Ｎ２５植酸酶ｐｈｙＡ基因表达片段的克隆、筛选及鉴定经酶切反应、连接反应和转化反应在含有x-gal和Amp的LB培养基上从白色菌落中筛选出阳性菌落。