体内药物分析

739（四）其它：乳汁、动物脏器组织匀浆等。

二、样品储存和稳定性考察：取样后最好立即进行分析，冷藏(4℃)、冰冻(-20℃)有时也不能完全保证样品不起变化。

尿液是很好的细菌生长液，若需收集24小时或更长时间的样品或不能立即测定的，应置冰箱冷藏或加防腐剂（1%甲苯、过饱和氯仿）保存。

分析样品贮存时应考虑：储存条件；样品在贮存中会对分析结果产生什么影响；评述样品稳定性时会发生什么问题；如何预防或校正不稳定样品的分析结果。

测定前样品的制备除少数体液经简单处理后直接测定外，通常在最后一步测定前要采取适当的样品制备，即进行分离、净化、浓集、必要时尚需对待测组分进行化学改性，为测定创造良好条件。

一、样品的制备要考虑：药物的理化性质、待测物的浓度范围、药物测定的目的、选用的生物体液和组织的类型、样品制备与分析技术的关系。

二、蛋白质的处理：是测定血浆、血清、全血及组织匀浆等样品中药物时的最先处理步骤。

（一）加入沉淀剂和变性试剂：硫酸铵是经典的蛋白质沉淀剂，它与蛋白质分子竞争系统中水分子，而使蛋白质析出。

阴离子型沉淀剂（三氯醋酸、高氯酸、钨酸、焦磷酸）与带电荷的蛋白质在氏于等电点的pH时形成不溶性盐；反之，阳离子型沉淀剂（含锌盐、铜盐）与蛋白质分子中带阴电荷的羧基，在高于蛋白质等电点时，形成不溶性盐。

有关机制不十分清楚。

（二）加入可与水混合的有机溶剂：乙醇过量存在时，能使与蛋白结合状态的药物释放可将混合物离心，取上清液（含药），但这不能解决样品的净化问题。

蛋白沉淀法对于与蛋白结合力强的药物的回收率较差。

也有采用酸消化法(Acid digestion)使药物自蛋白结合处释出，但常导致药物的分解。

（三）组织的酶消化法：蛋白水解酶(Proteolytic enzyme)中的枯草菌溶素(Subtilisin Carlsberg)不仅可使组织酶解，且可使药物析出。

优点：1、因是在平稳条件下进行的，可避免某些药物在酸中水解及较高温度时降解；2、可显著改善对蛋白结合率强的药物的回收率；3、可用有机溶剂直接提取消化液而无乳化生成的危险；4、在用HPLC时，无需再进行过多的净化操作。

缺点是不适用于一些在高pH时易水解的药物。

三、提取：（一）溶液的pH调节：最佳pH选择主要与药物的pKa值有关。

pH与pKa相当时，50%的药物以非电离形式存在。

碱性药物最佳pH值要高于pKa值1～2个pH单位；反之，则低1～2个单位。

可使90%药物以非电离开形式存在，易为溶剂提取。

而对于碱性很强的药物往往采用“离子对”技术进行提取和定量。

体内酸性物质较多，在碱性条件下不会被萃取出来，故在pH值偏高的情况下进行提取较好。

（二）提取溶剂的极性：选好第一个提取溶剂可减少以后的净化操作，在液-液提取中多采用极性小的溶剂。

加入少量醇类可克服极性小溶剂提取能力弱和减小药物在容器表面的吸附损失的不足。

也有利用不同极性的混合溶剂来提取药物和净化脂肪酸类。

（三）提取技术：由于体液样品量少且药物含量低，一次分析的样品数量较多。

与常量和微量分析相比，提取时通常不采用反复提取的方法，多半进行一次（至多二次）提取，在改变pH后，从有机相回提至水相也只进行一次。

一般并不考虑“提尽药物”，测定含量时则应精确加入提取溶剂，提取液也要定量分出。

为避免进样时带来的误差，多采用提取前加入等量内标，以待测组分峰高（或峰面积）与内标峰高（或峰面积）之比对浓度作标准曲线。

这样，即使在一系列操作过程中有微量损失，对比值影响也较小。

混合时可在密塞情况下将试管平置于振荡器内振荡，振荡时间与强度视情况而定。

可采用以“药物转入溶剂中量”与“混合时间”作图法，选取理想和符合实际的提取方式和时间。

（四）提取溶剂的蒸发：提取液常为数ml，往往不能直接供GC或HPLC测定，需采取浓集办法，常用真空蒸发（注意暴沸）或吹氮气流使溶剂挥散。

四、固相分离：以固相分离方法进行样品预处理，从水相中分离出所需测定的组份，通常以柱分离方式进行操作，故有时这种方法又称为固相提取柱(Solid-phase extraction column)法。

这类柱分两类：一种是阻留全部样品在柱上；一种则仅阻留药物及其相关物质。

常用于填充柱的固相分离物质有氧化铝、活性碳、硅藻土、离子交换树脂及非离子型的树脂及凝胶等。

在第一类柱中，常使用亲水性装填物，如硅藻土，可捕集全部样品。

样品全部吸附在固相颗粒表面，形成一薄层，即使样品中含水也能如此。

采用一种与水不相混溶的有机溶剂如氯乙烷倾入柱中，即可洗提药物。

第二类柱则较有选择性，可装填疏水物或离子交换树脂，对药物及其相关物质进行滞留。

常用的疏水物有活性碳、聚苯乙烯或C18化学键合硅胶。

这种疏水柱可从样品中吸附亲脂性药物，然后用有机溶剂将药物洗提分离。

离子交换柱适用于高极性、可电离的药物。

五、利用分子大小进行分离—供血浆中游离药物的测定：采用超速离心、平衡透析、限外过滤（超滤）以及凝胶过滤方法等。

以上方法也可用于药物蛋白结合率的测定。

六、导致待测物损失的因素：（一）吸附：玻璃表面或橡胶塞会吸附药物，特别是脂肪胺类及含硫化合物。

可采用硅烷化减少玻璃表面的吸附性，非极性提取溶剂中加入少量极性溶剂可减少器皿对药物的吸附。

血样中红血球和纤维蛋白元凝块的形成，常能引起待测物的共沉淀。

所以宜将全血样品加入缓冲液后再行提取。

这样血球散开，药物可从血球表面解吸，以减少共沉淀的损失。

缓冲液的一定离子强度，可蛋白质变性时形成疏松的絮状物，这样可减少药物的物理性滞留和共沉淀的损失。

（二）化学降解：药物的化学和生物学不稳定性常引起化学分解；光化学及热稳定性（尤其在净化步骤中强酸、强碱的中和所产生的热）引起的损失，也应加注意。

应尽量采用温和条件制备样品，经免引起药物的部分分解、开环等情况发生，有的药物尚需避光操作。

（三）衍生化反应：由于不完全反应，待测药物仅部分转化为所需的产物或形成副产物。

有时在蒸发除去过量衍生化试剂时，使得衍生物与溶剂形成共沸混合物而导致损失。

（四）络合：某些药物会与重金属离子络合或与内源必性大分子相互作用，这种情况虽较少遇到，但往往是某些样品制备中药物损失的一个因素。

（五）蒸发：有的是药物本身的挥发性（如苯丙胺）或因蒸发所得残渣未能完全溶于所加的小体积溶剂中；或因减压浓缩引起溶液暴沸而导致损失；或在吹氮过程中使药物以气溶胶形式逸出。

七、样品沾污：（一）增塑剂(Plasticizers)：测定发现某些塑料血样采集管含有3-(2-丁羟乙基)磷酸酯等，可使溶剂提取步骤中药物分配系数变化、方法变异系数增大（从5%增至20%）。

（二）脂肪酸及酯类：血样中浓度约为350μg/ml（10-3mol/L），较待测药物高102～103倍以上,易被提入。

常出现在色谱图中。

（三）溶剂中杂质：由于溶剂体积其它试剂为大，即使原来杂质浓度较低，浓集时或通过色谱柱时，浓度显著增大而干扰测定。

更严重的是干扰物在每批溶剂或试剂中有所不同，而影响不同实验室间、各分析人员间的实验结果。

解决办法是采用高纯度溶剂（价贵）、有时在使用前重新应用全玻璃仪器重蒸馏。

其次是采用专属的检测方法。

（四）化学衍生化带来的杂质：由于试剂未经纯化致使色谱分析中往往呈现额外的杂质峰。

（五）实验环境和器皿、材料的污染：实验室的去污剂、润滑油、滤纸、玻璃器皿不够洁净，蒸馏水纯度不够等。

体内药物分析方法的设计与评价一、分析方法的设定依据：（一）重视并做好文献总结、整理工作；（二）充分了解待测药物的特性及体内存在状况；（三）明确测定的目的要求；（四）实验室条件。

二、方法建立的一般实验步骤：（一）以纯品进行测定：以一定量纯品按拟定方法进行测定。

求得浓度与测定响应值之间（如吸收度、色谱峰高或面积等）的关系，浓度线性范围，最适测定浓度，检测灵敏度，测定的最适条件（pH、温度、反应时间）等等。

（二）以经过纯化处理过的空白样品进行测定；（三）空白样品添加标准后的测定：血样等样品中添加一定量标准品后进行测定，求得样品回收率数据，检验生物样品对测定有无干扰等。

（四）体内实际样品测定：有时用体外建立的方法去测定体内取得的实样时，会得出错误的结论。

故要强调对药物体内过程有一定程度的了解。

有时也采用专属性强、已证明适用于体内实样测定的步骤和方法作为对照测定，并以此来检验所建立的方法的实际可行性。

三、方法的评价：（一）准确度(Accuracy)：测定结果与真值的符合程度。

常用回收率(Recovery)数值间接反映测定的准确程度；也可通过与其他已建立的方法进行比较的办法（参比方法）来加以反映。

回收率100%当然好，但很难达到。

重要的是每次测定要保持稳定。

（二）精密度(Precision)：测定结果与平均值的偏离程度。

测定间偏差越小，对测定的要求也越高（花费大）；浓度与RSD值间存在反比关系，RSD在10%以内的方法可认为是可接受的。

（三）灵敏度(Sensitivity)：“一种方法可以检测出有关化合物的最小量”。

常用最低检测限(Limit of detection,LOD)或最低检测量(Limit of quantifi cation;LOQ)来表示。

LOD范围在ng(10-9g)～10-18g。

（四）专属性或选择性(Specificity or Selectivity)：是指测定的信号（响应）是属于被测药物所特有的。

若有干扰就需改进测定方法或改用具有分离能力（如色谱法的专属性较吸收光度法为高）的方法或专属性较强的方法进行。

（五）不同方法测得结果的相关程度(Degree of correlation)的比较：用一有相当专属性和可靠性的方法与新建方法同量测定，以相关系数γ(Corr elation coefficient)表示相关程度。

γ一般要求在0。

95以上。

此外，还应从方法的可靠性、每个样品测定耗时多少、操作的难易及技术要求及仪器、设备要求、费用多少等等方面加以考虑。

分析质量管理（A.Q.C.—Analytical Quality Control）及质量保证（Quality Assurance）已成为体内药物分析的一项重要的计划内容。

对仪器、试剂、方法、操作技术等进行系统的分析质量管理，可监督分析质量所处的状况，引起警觉并推动人们去改善分析工作的各个环节。

即，分析质量管理的近期目的是通过对测定结果的分析，对该次测定结果作出评价，并按照设定指标决定结果的取舍，以保证测定结果的质量。

远期目的是通过质量管理可以发现和分析造成“分析质量差”的原因，以便改进实验设计，提高测定质量。

A.Q.C.可分为内部质量管理(Internal QC)和外部质量管理(External QC)两种计划。

内部QC是指实验室内部的质量检验，它也是保证实验室间结果（外部QC）有可比性的基础。