现代色谱分析-HPLC1
hplc原理及操作
hplc原理及操作高效液相色谱分析法(HPLC）是一种以溶剂梯度对样品进行分离和测定的方法。
系一种以压力作为体系内物质运动活动的发动力，以色谱柱为分离器件，以固定及或变量流速溶液作为流动介质的技术。
HPLC的工作原理：样品以溶剂梯度的方式从高压柱头处潜入并向柱底流动，溶质在～20MPa的高压力下正常行驶。
溶质有一定的分馏程度，有分子大小及分子形状的分离和鉴定，其中含有高度纯化的物质结构体，具有极高的灵敏度和准确性，因此常用于检测化学品、药物、农药、食品等样品。
结合柱色谱技术进行分离分析，以溶剂分馏样品中多种物质，基于它们在色谱柱中的不同以及相同的拖动力，从而实现分离和测定。
被分离的分子是从色谱柱进入注入支路的溶质的部分种类，当经过偏光器后，各种物质会被它们所产生的信号鉴定出来，这样就实现找出溶质的分子类型，同时还测定它们出现的百分比以及分析速度等工作。
HPLC仪器由4个基本构成部分：检测器、泵系统、色谱柱和控制系统组成。
1. 检测器：配合色谱柱，根据每个溶质所产生信号进行检测；2. 泵：将溶剂柱体内的样品系流动；3. 色谱柱：负责充当样品分离器；4. 控制系统：控制泵的运转，优化溶剂梯度；并计算并显示每个溶质的信号强度及分离程度等。
HPLC操作：1. 把样品溶于洗涤液中，常用的洗涤液为醇型或水型溶剂。
2. 向色谱柱中倒入洗涤液，使用含具有良好紫外将固定流出，色谱柱中的柱管把不同溶质分开，当柱管中的溶质流出到气体室后，可以改变溶质流量，调节溶质含量或检查特定溶质含量。
3. 启动泵，通过泵向色谱柱内加入溶剂，洗洗涤液渗入样品柱体，梯度洗液流动在柱体内，也可以用不同比例的液体梯度来分离多种溶质；4. 启动检测器，可以看到溶质的表象，根据每个溶质产生信号的特征及强度，确定物质含量以及分析速度等参数，最终得出相应结果；5. 用计算机系统分析数据，根据植测所需，进行图象与数据处理，以及报告和图表的生成等。
HPLC分析法是一种表征分子大小及它们的特征的分离技术，是一种灵敏、用于样品分析的高精度的技术手段。
高效液相色谱和超高效液相色谱
高效液相色谱和超高效液相色谱高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）和超高效液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC），是现代分析化学中常用的分离技术。
它们可以对复杂的混合物进行分离和定量分析，广泛应用于药物分析、食品分析、环境分析、生物分析等领域。
本文将从原理、仪器、方法和应用等方面，介绍高效液相色谱和超高效液相色谱的基本知识。
一、原理高效液相色谱和超高效液相色谱的原理基本相同，都是利用样品在流动相中的分配系数差异，通过固定相和流动相的作用，将混合物中的化合物分离出来。
不同的是，超高效液相色谱采用了更小的颗粒固定相，使得流动相可以更快地通过固定相，从而提高了分离效率和分离速度。
在高效液相色谱和超高效液相色谱中，样品首先被注入流动相中，然后通过固定相的柱子。
固定相通常是一种多孔的固体材料，如硅胶、C18等。
样品中的化合物在流动相中的分配系数不同，因此在通过固定相时，会被分离出来。
分离出来的化合物，会在检测器中被检测到，从而实现分离和定量分析。
二、仪器高效液相色谱和超高效液相色谱的仪器基本相同，主要由注射器、流动相泵、柱子、检测器和计算机控制系统等组成。
（一）注射器注射器是将样品引入流动相中的关键部分。
常用的注射器有手动注射器和自动进样器。
手动注射器通常用于小样品量的分析，而自动进样器可以实现高精度、高效率的样品进样。
（二）流动相泵流动相泵是将流动相送入柱子中的装置。
其主要功能是控制流动相的流速和流量，并确保流动相的稳定性。
常用的流动相泵有恒压流量泵和梯度流量泵。
恒压流量泵可以保持恒定的流量，适用于等浓度的流动相。
梯度流量泵可以实现不同浓度的流动相混合，从而实现更好的分离效果。
（三）柱子柱子是高效液相色谱和超高效液相色谱的核心部分，用于固定相的分离。
常用的柱子材料有硅胶、C18、C8等。
色谱分析方法
色谱分析方法色谱分析是一种重要的分离和检测技术，广泛应用于化学、生物、环境等领域。
色谱分析方法主要包括气相色谱、液相色谱、超临界流体色谱等，每种方法都有其特定的应用领域和优势。
本文将就色谱分析方法进行介绍，希望能对读者有所帮助。
首先，气相色谱是一种以气体为载气相的色谱分离技术。
它适用于挥发性较好的化合物的分离和检测，如石油化工、食品安全等领域。
气相色谱的分离原理是通过化合物在固定相和流动相之间的分配来实现，固定相通常是一种涂覆在毛细管或填充在管柱中的吸附剂，而流动相则是惰性气体。
气相色谱具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高等优点，因此在实际应用中得到了广泛的应用。
其次，液相色谱是一种以液体为流动相的色谱分离技术。
它适用于挥发性较差的化合物的分离和检测，如生物药品、环境监测等领域。
液相色谱的分离原理是通过化合物在固定相和流动相之间的分配来实现，固定相通常是一种涂覆在填充柱或固定在固定相支持物上的吸附剂，而流动相则是液体。
液相色谱具有分离能力强、适用范围广、分析准确等优点，因此在实际应用中也得到了广泛的应用。
此外，超临界流体色谱是一种以超临界流体为流动相的色谱分离技术。
它适用于疏水性化合物的分离和检测，如天然产物提取、药物分析等领域。
超临界流体色谱的分离原理是通过化合物在固定相和流动相之间的分配来实现，固定相通常是一种涂覆在填充柱或固定在固定相支持物上的吸附剂，而流动相则是超临界流体。
超临界流体色谱具有分离速度快、溶解度大、环保性好等优点，因此在实际应用中也得到了广泛的应用。
综上所述，色谱分析方法是一种重要的分离和检测技术，不同的色谱方法有着各自的特点和应用领域。
在实际应用中，我们可以根据样品的性质和分析要求选择合适的色谱方法，以达到最佳的分离和检测效果。
希望本文对读者对色谱分析方法有所帮助，谢谢阅读！。
hplc高效液相色谱仪使用方法
hplc高效液相色谱仪使用方法HPLC高效液相色谱仪是一种常用的色谱分析仪器，广泛应用于药物、环境、食品、化妆品等领域。
下面将详细介绍HPLC高效液相色谱仪的使用方法。
一、仪器准备：1.检查仪器的状态，确认各个部件是否正常运行，如高压泵、进样器、检测器等。
2.开机预热：打开主机电源，按照仪器操作手册上的指示，进行仪器的预热操作。
一般要求预热时间为30分钟到1小时。
二、工作站设置：1.打开工作站软件，点击新建分析方法。
根据分析需求选择不同的方法类型，如梯度洗脱、等温洗脱等。
2.设置流动相组成：根据分析物的性质和目标，选择合适的流动相，并设置其浓度和比例。
可以通过试错法或者文献参考来确定最佳流动相组成。
3.设置进样器参数：选择合适的进样方式，如全自动进样、微量进样等。
设置进样量和进样速度，根据分析物的浓度、检测器灵敏度等因素进行调整。
4.设置检测器参数：选择合适的检测器类型和波长。
一般情况下，紫外检测器是最常用的检测器，波长选择通常在200-400nm之间。
5.设置柱温：根据分析物的性质和目标，选择合适的柱温。
柱温对分离性能和分析速度有着明显的影响。
三、样品处理：1.样品制备：根据分析目标和方法要求，对样品进行处理，包括固相萃取、溶解、过滤等。
2.进样器设置：将样品注入进样器，确保进样量与方法要求相符。
3.进样：点击工作站软件上的进样按钮，开始进行进样。
进样过程中要确保无气泡进入柱。
四、开展分析：1.开始分析：点击工作站软件上的开始按钮，运行分析方法。
监控色谱图，观察峰的形状和分离度。
根据需要可以对分析方法进行优化，如调整流速、洗脱程序等。
2.数据处理：完成分析后，保存并导出色谱图和数据。
进行数据处理和结果分析。
五、仪器维护：1.使用完毕后，关闭泵和检测器，将柱中流动相完全排空，以免柱内残留物引起污染。
2.保养柱：每次使用后，要清洗柱和重新平衡柱。
柱的清洗和保养要根据具体的柱类型和使用情况进行。
3.保持仪器干燥和清洁：定期清洁仪器，尤其是注射器、透射比色噪声汇丰牌等易受污染的部件，以保证仪器的正常运行。
现代色谱分析技术发展及应用
现代色谱分析技术发展及应用色谱分析技术是一种重要的分离和分析方法，在各个领域具有广泛的应用。
随着科学技术的发展，色谱分析技术也不断地得到改进和完善。
本文将就现代色谱分析技术的发展历程以及应用领域进行探讨。
一、色谱分析技术的发展历程色谱分析技术起源于20世纪初，最早的色谱法是在液体中通过旋塞柱进行分离的，被称为“旋转色谱法”。
随后，固定相柱的发明推动了色谱分析技术的进一步发展。
20世纪50年代，气相色谱技术的诞生使得色谱分析技术得到了重大突破。
然而，早期的色谱分析技术存在着许多缺点，如分离效率低、分析速度慢等。
为了克服这些问题，人们进行了一系列的改进和创新。
在20世纪60年代，高效液相色谱技术被引入，这种技术在分离效率和分析速度方面较传统的液相色谱技术有了显著的提高。
此外，超临界流体色谱、毛细管电泳等新型色谱分析技术的出现也为色谱分析的研究和应用带来了新的思路和方法。
二、现代色谱分析技术的分类及原理现代色谱分析技术主要可以分为气相色谱、液相色谱和电泳三类。
下面将分别介绍这三种技术的原理和特点。
1. 气相色谱（Gas Chromatography，GC）气相色谱是利用气体作为载气相和样品分子之间的分隔介质，将混合物中的分离成分分开的色谱技术。
它主要包括样品的气相进样、气相传递和色谱柱的分离。
气相色谱具有分离效率高、分析速度快和灵敏度高等优点，被广泛应用于气体组分分析、环境检测、食品安全等领域。
2. 液相色谱（Liquid Chromatography，LC）液相色谱是以液体作为流动相和样品分子之间的分离介质的色谱技术。
常见的液相色谱包括高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和超高效液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC）。
液相色谱具有高分离度、适用范围广、操作简便等特点，广泛应用于生物医药、食品安全、环境监测等领域。
hplc的色谱条件及测定方法 -回复
hplc的色谱条件及测定方法-回复HPLC的色谱条件及测定方法HPLC（高效液相色谱）是基于液相色谱的一种分析技术，广泛应用于各个领域的化学分析中。
它具有分离效果好、分离速度快、灵敏度高和适用范围广等优点，因此被广泛地应用于食品、医药、环境等领域的分析和质量控制中。
本文将详细介绍HPLC的色谱条件及测定方法，并逐步解释相关概念和操作步骤。
一、基本色谱条件1. 色谱柱的选择在HPLC分析中，选择适合的色谱柱对于保证准确性和可重复性至关重要。
色谱柱的选择应根据需要分离的样品特性来确定。
常见的色谱柱有反相柱、离子交换柱和凝胶过滤柱等，每种柱的特点和分离能力都不同。
2. 流动相的选择流动相是指在色谱柱中流动的液体，由流动相A和流动相B组成。
流动相可以根据样品的特性和分离要求来选择。
在HPLC中，常用的流动相有水、有机溶剂（如乙腈）和缓冲液等。
根据不同的分析要求，可以选择不同的流动相组合。
3. 流速的选择流速是指流动相在色谱柱中流动的速率。
流速的选择应根据样品的特性、分离效果和分析时间等因素来确定。
一般来说，较高的流速可以缩短分析时间，但可能会影响分离效果，因此需要在速度和分离效果之间进行权衡。
4. 检测器的选择在HPLC中，常用的检测器有紫外-可见光谱检测器（UV-VIS）、荧光检测器、电化学检测器等。
检测器的选择应根据分析目标物的性质和分析要求来确定。
二、HPLC的测定方法1. 样品制备在进行HPLC分析之前，需要对样品进行适当的处理和制备。
常见的样品制备方法包括提取、浓缩、稀释等。
样品制备的目的是提高分析物的浓度，减少干扰物的影响。
2. 色谱柱条件的设定在测定之前，需要根据样品的特性和分析要求来设定适当的色谱柱条件，包括色谱柱的类型、尺寸和流速等。
根据需要，可以进行多次试验来确定最佳的色谱柱条件。
3. 校准曲线的建立为了定量分析目标物，需要建立校准曲线。
校准曲线通常是通过分析一系列含有不同浓度的标准样品来获得的。
现代色谱分析试题
现代⾊谱分析试题第⼀章⾊谱法概论1. 综述各种⾊谱法的特点及其应⽤。
2. 简要说明⽓相⾊谱法（GLC、GSC）、⾼效液相⾊谱法（HPLC的各类⽅法）特点及其应⽤范围？3. 试⽐较⾊谱法（GC、HPLC）之间的异同？第⼆章⾊谱基本理论例1 采⽤3M⾊谱柱对A、B⼆组分进⾏分离，此时测得⾮滞留组分的t M值为0.9min ，A组分的保留时间（t R(A)）为15.1min，B组分的t R为18.0min，要使⼆组分达到基线分离（R=1.5），问最短柱长应选择多少⽶（设B组分的峰宽为1.1 min）？解⽅法（1）：由已知条件，得n B=16(18.0/1.1)2=4284r i,B=18.0-0.9/15.1-0.9=1.20K/B=18.0-0.9/0.9=19则因为所以故⽅法（2）：同⽅法（1）得n B=4284；r i,B=1.20；K/B=19所以则n B (R=1.5)=16 (1.5)2(1.2/0.2)2[(1+19)/19]2=1425故L=n (R=1.5)H=14250.07=99.8cm1m1.A、B ⼆组分的分配系数之⽐为0.912，要保证⼆者的分离度达到1.20，柱长因应选择多少⽶？设有效塔板⾼度为0.95mm.。
2.有⼀液相⾊谱柱长25cm,流动相速度为0.5ml/min，流动相体积为0.45ml，固定相体积为0.25ml,现测得萘、蒽、菲、芘四组分（以A、B、C、D）的保留值及峰宽如表3-1。
根据已知条件试计算出：（1）各组分容量及分配系数；（2）各组分的n及n eff；（3）各组分的H 值及H eff值；（4）画出四组分的K/值之间的关系曲线表3-1 在HPLC柱上测得的A、B、C、D 的组分t R(min) W h/2(min)⾮滞留组分ABCD 4.06.513.514.620.10.420.971.101.38答：（1）K/（A=0.60；B=2.38；C=2.65；D=4.03）；（2）（A=4021；B=3099；C=2818；D=3394）n eff（A=595；B=1535；C=1486；D=2178）;（3）H（A=0.06；B=0.08；C=0.09；D=0.07）H eff（A=0.42；B=0.16；C=0.17；D=0.11）;(5)根据已有数据，绘出K/--n--n eff曲线，⾃⾏判断正确与否，并分析原因。
现代仪器分析——色谱分析
气-液色谱分离原理 —— 两相分配
载气 固定液
迁移
平衡
各成分在固定液中 分离原理
各组分在固定液中溶解能 力不同
溶解-挥发平衡 溶解度不同
溶解度大难挥发柱中 停留时间长向前移动慢
3、气相色谱仪
基本流程和主要部件
进样系统 检测器
载气系统
色谱柱
记录、数据 处理系统
气相色谱仪的流程图
1)载气系统
3、高效液相色谱仪
基本流程和主要部件
高压输 液系统
进样 系统
分离 系统
检测 系统
贮液器、高压 泵、脱气器
1．贮液罐（滤棒，可滤 去颗粒状物质） 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
高效液相色谱仪的流程图
主要部件
1) 高压输液泵
＝
2(t R 2 t R1 ) W1 W2
相平衡参数
1、分配系数 ( K )
在一定温度下组分在两相之间分配达到平衡 时的浓度值比。
组分在固定相中的浓度 CS K 组分在流动相中的浓度 CM
2、容量因子( k )
指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达 分配平衡时，在固定相与流动相中的质量 比——更易测定.
操作 分离效率 分离速度 分析灵敏度
加温操作 高 快 高
Thank you !
汇报结束，欢迎指导。
早期的机械涂层法，易使固定液流失，已淘汰。 化学键合固定相：用化学反应的方法将固定液的官能团 键合在载体表面上。 目前应用最广、性能最佳的固定相
特点
（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；
（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击， 耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （3）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性。
高效液相色谱仪工作流程
高效液相色谱仪工作流程高效液相色谱仪（High-Performance Liquid Chromatography, HPLC）是现代色谱分析技术中的关键仪器之一，广泛应用于生命科学、医学、制药和环境监测等领域。
HPLC不仅可以分离复杂混合物，还能测定化合物的纯度、分子量和化学反应动力学参数等。
本文将详细介绍HPLC的工作流程及其各个环节的具体内容。
一、概述HPLC分离方法是在特定的操作条件下，利用样品中化合物在流动相与固定相交互作用不同而分离纯化目标化合物的一种仪器分离方法。
常用固定相材料包括硅胶、活性炭、十八烷基硅胶和氨基硅胶等，而流动相则是要经过调节才能使各化合物分离，例如改变溶剂配比，改变温度等。
HPLC一般由液相泵、样品进样器、柱子、检测器和数据处理系统组成。
下面，我们将详细介绍每个环节的作用和工作流程。
二、液相泵液相泵是指在HPLC中负责将流动相（移动相）通过固定相（柱子）的系统中流动的一种泵。
通俗来讲，其功能是向上抬升活塞推动流动相流经柱子，使样品能与固定在柱子上的固定相发生相互作用从而分离出纯度更高的化合物。
液相泵可以提供稳定的流速和压力，是HPLC系统中关键的组成部分。
液相泵在HPLC系统中的具体工作流程如下：1. 设置流速，输入溶剂参数：首先需要在仪器控制软件上设置流速；还需要输入流动相的一些参数，如溶剂的种类、浓度和缩写等。
2. 启动液相泵：通过点击控制软件“启动”按钮将提供压力的泵浦启动。
3. 压力监控：液相泵将持续加压，直到达到预设的压力值。
在加压过程中，成分浓度的变化会导致压力的变化，这时可以通过压力监控系统及时调整流速来保持压力的稳定。
4. 柱前压力平衡：为确保柱子中样品能够顺利分离，开始运行HPLC之前首先需要在柱子中填充流动相，进行柱前压力平衡。
三、样品进样器样品进样器是HPLC系统中负责将待分析的化合物样品进给进HPLC柱中的一个系统，它的主要作用是将待测试的样品转化成具有高性能液相色谱分析所需的样品状态。
现代仪器分析方法
现代仪器分析方法
现代仪器分析方法包括：
1. 液相色谱法（HPLC）：用于分离和测定液体和溶液中的化学成分。
2. 气相色谱法（GC）：用于分离和测定气体和挥发性液体中的化学成分。
3. 质谱法（MS）：用于确定化合物的分子式、结构和质量。
可以与色谱法结合使用，例如气相色谱-质谱联用（GC-MS）。
4. 原子吸收光谱法（AAS）：用于测定金属元素的含量和浓度。
5. 荧光光谱法：测量物质在吸收紫外或可见光后放射出的荧光。
6. 红外光谱法（IR）：用于确定物质中的官能团和分子结构。
7. 核磁共振光谱法（NMR）：用于确定物质的分子结构和官能团。
8. X射线衍射法（XRD）：用于确定物质的结晶结构。
9. 表面分析技术（如扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM））：用于观察和分析材料的表面形貌和结构。
10. 热分析技术（如差示扫描量热仪（DSC）和热重分析（TGA））：用于测量材料在不同温度下的热稳定性和热性质。
这些现代仪器分析方法在科学研究、环境监测、食品安全、制药和化工等领域广泛应用。
高效液相色谱技术的研究现状及其应用
高效液相色谱技术的研究现状及其应用高效液相色谱（HPLC）是现代分析化学中最常用的分离分析技术之一。
它可以快速、准确地分离和检测各种化合物，广泛应用于大家生命科学、化工、环保、食品等领域。
本文将介绍高效液相色谱技术的研究现状及其应用。
一、HPLC技术的基础高效液相色谱技术基于物质的化学性质，在多种物理和化学作用的共同作用下，通过高效液相色谱柱进行分离和检测。
它借助液体流动的特点，将待检样品溶解于流动相中，在分配指定波长下，测量物质的独特的光学特性，进行定性和定量分析。
二、HPLC技术的研究现状HPLC技术诞生于20世纪60年代末，经过多年的发展和完善，它已成为现代分析化学的核心技术之一。
在HPLC仪器、柱、检测器等方面的持续改进和优化，使得HPLC分析的灵敏度、分辨率、重现性等指标得到了大幅提升，并且越来越适应于复杂的样品分析。
1. HPLC仪器传统的HPLC仪器结构简单，易于维护，但灵敏度和分离能力有限。
随着技术的进步，新型HPLC仪器受到更多关注。
它们使用电镀柱和各种新型材料，如小孔隙、非球形、非对称等，使样品分析更加高效。
此外，凭借着现代信息技术（IT）的发展，HPLC仪器正在向珂学（在线监测、规定实时性检测），自动化（自动进样、数据处理智能化）和移动化（小型化、便携式）等方向发展。
2. HPLC柱HPLC柱作为HPLC技术的核心部件之一，是HPLC性能和分离效率的关键因素之一。
对于众多的HPLC柱，随着时间的推移和应用领域的不同，柱的类型也在持续发展和改进。
例如，亲水凝胶柱、醚类柱、反相柱、离子交换柱、手性分析柱等不同的HPLC柱的类型，都得到了不同程度上的应用。
3. HPLC检测器HPLC检测器是HPLC分析中最关键的部分之一。
现代HPLC检测器可以识别样品中的任何鉴定成分，测量许多光学信号、电学信号等，请通过检测技术进行检测分析样品。
例如，高性能荧光检测器、紫外光吸收检测器、电感耦合等离子体发射光谱仪等应用在HPLC技术中，使HPLC检测手段的多样性和分析手段的严密性得以彰显。
HPLC
高效液相色谱法
2 仪器组成 高效液相色谱仪由输液泵、进样器、 色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。
高效液相色谱法
泵
洗脱分等度洗脱和梯度洗脱二种。梯 度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀实 现程序控制。
高效液相色谱法
进样器 手动进样器(六通阀式进样器) 自动进样器：在程序控制器或微机控制下， 可自动进行取样、进样、清洗等一系列动 作，有几种比较典型的自动进样装置：圆 盘式自动进样器、链式自动进样器、坐标 式自动进样器等，操作者只需将样品按顺 序装入贮样室内即可。
高效液相色谱法
④包覆聚合物(Polymer encapsulated) 包覆聚合物是在无机载体如硅胶、石墨化 碳或氧化锆的表面形成固载化的有机聚合 物薄层，聚合物薄层表面还可键合上C18、 C8、NH2、CN等，色谱过程中仅聚合物层 与流动相和组分接触，因而兼顾了无机载 体的刚性和有机聚合物的化学稳定性。
高效液相色谱法
3、电化学检测器(Electrochemical detector，ECD)： 电化学检测器是测量物质的电信号变化，对具 有氧化还原性质的化合物，如含硝基、氨基等有机 化合物及无机阴、阳离子等物质可采用电化学检测 器。包括极谱、库仑、安培和电导检测器等。前三 种统称为伏安检测器，用于具有氧化还原性质的化 合物的检测，电导检测器主要用于离子检测。其中 安培检测器(amperometric detector，AD)应用较广泛， 更以脉冲式安培检测器最为常用。
高效液相色谱法
缺点：只适用于能够产生荧光的物质 的检测，适用范围不如紫外检测器。影响 因素较多，对溶剂的纯度、pH值、样品浓 度、检测温度等需很好地控制。 适用范围：具有天然荧光的物质可以 直接检测，也可通过荧光衍生化使原本没 有荧光的物质转变成荧光衍生物后测定， 从而扩大了荧光检测器的适用范围。主要 用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化 合物及酶等的检测。
hplc文档
HPLC（高效液相色谱）分析技术简介1. 概述HPLC（High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱）分析技术是一种常用的分离、定性和定量分析方法。
它是在液相体系中进行的一种色谱分析方法，具有分离效率高、分离能力强、灵敏度高等优点，被广泛应用于多个领域，如化学、生物、环境等。
2. 原理HPLC分析技术的基本原理是通过液体作为流动相，通过与固定相的相互作用来实现样品分离。
液体流动相被泵送到柱中，样品溶液在柱中的固定相上发生相互作用，并按照不同的亲和性被分离。
分离后的成分经过检测器检测并生成信号，进而进行定量和定性分析。
3. 仪器组成HPLC系统由多个主要组成部分构成，包括： - 柱：用来进行样品分离的重要组成部分。
根据需要，可以选择不同类型和尺寸的柱进行分析。
- 泵：用来将流动相推送到柱中的装置。
它可以提供恒定且可调的流速。
- 注射器：用来将样品注入柱中的设备。
高精度和可重复性是注射器的重要特点。
- 检测器：用于检测和测量柱中流出的化合物。
常见的检测器类型包括紫外可见、荧光和质谱检测器。
- 数据系统：用于采集、处理和分析检测器生成的信号和数据。
4. 分析步骤HPLC分析通常需要进行以下步骤： 1. 准备样品：样品准备过程包括溶解、过滤和稀释等。
2. 样品注射：将样品注入HPLC系统中，注射器按照预定的体积将样品引入柱中。
3. 分离过程：样品在柱中进行分离，不同成分依照性质不同以不同速率通过柱。
4. 检测分离的成分：通过检测器对柱中流出的化合物进行检测和测量。
5. 数据分析：处理和分析检测器生成的信号和数据，获取所需结果。
5. 应用领域HPLC技术在许多领域中被广泛应用： - 化学分析：用于分析和测定化学物质的组成和浓度。
- 药物分析：用于药物含量测定、药物残留量检测等。
- 生物分析：用于生物样品中化合物的分离和分析。
- 环境监测：用于监测环境中有害化合物的浓度和分布。
色谱分析-HPLC
灵敏度
表2 检测限(LOD) 和定量限(LOQ)
精确度
表3 相对标准偏差<1%
回收率
表4所示
干扰因素
图3所示 在快酸色谱柱中木糖、半乳糖 、果糖共洗脱的图谱，3个谱峰叠加在一 起
应用程序和传输方法
图4所示 A Phenomenex RFQ column分析玉米秸 秆半纤维素水解产物的色谱图 B Aminex HPX-87H column分析玉米秸 秆半纤维素水解产物的色谱图
图2所示
用新方法检测水溶的糖溶液时发现糖 降解不会产生呋喃类（即没有产生羟 甲基糠醛和呋喃甲醛）。（40 g/L的葡 萄糖，100 g/L的木糖，20 g/L的半乳 糖在水中）糖的混合液共洗脱时，出 峰时间在2.1-2.5min之间。
线性关系
表1 r2>0.999，呈现良好的线性关系
快速高压液相色谱法分析 木质生物质水解和发酵产 品的发展和验证
定义
色谱法是利用混合物中各组分在两相中 分配系数不同，当流动相推动样品中的 组分通过固定相时，在两相中进行连续 反复多次分配，从而形成差速移动， 达到分离的方法。根据流动相的状态可 分为气相色谱法和液相色谱法。在液相 色谱中，采用颗粒十分细的高效固定相 并采用高压泵输送流动相，全部工作通 过仪器来完成。这种色谱称为高效液相 色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）。
柱子的优点
能承受较高的温度和流速 当使用Rezex分析柱时需要的操作温度较高， 而酸性流动相在高温条件下有可能使糖退 化。解决方案便是用单糖类来模拟玉米秸 秆半纤维素水解产物（40 g/L的葡萄糖， 100 g/L的木糖，20 g/L的半乳糖，10 g/L的 阿拉伯糖，10 g/L的甘露糖在水中）在 85℃的温度下用Rezex分析柱来分析。实验 表明糖降解不会产生羟甲基糠醛和呋喃甲 醛（图2）。
高效液相色谱分析法 HPLC
§2-3 各类高效液相色谱法简介
一、液固吸附色谱法（LSC） (liquid-solid adsorption chromatography)
二、液液分配色谱法（LLC） (liquid-liquid partition chromatography, chemical bonded phase chromatography
2．流动相差别的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用
力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用
力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
2．进样装置 1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室）
GC系统压力较小，可以 HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期） 2）阀进样：不必停泵，六通阀
液相色谱
3．色谱柱：直径4~6mm,柱长10~30cm 柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子） 柱再生：维护、保养、柱子的冲洗
4．检测器 1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质 2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质 灵敏度高 3）示差折光检测器：利用折光率的差别 灵敏度低，温度要求严格 4）电化学检测器 5）化学发光
注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间 5．出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱 6．硅胶吸水量↑，LSC→LLC • 硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大 • 硅胶含水量>17% 分配色谱 硅胶失活→载体
HPLC原理及方法简介
附录---HPLC原理及方法简介I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。
二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压——压力可达150-300 Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速——流速为0.1-10.0 mL/min。
高效——可达5000塔板每米。
在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01 ng。
同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快——通常分析一个样品在15-30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
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湿法装柱
紫外检测器－固定波长检测器
紫外检测器－可变波长检测器
紫外检测器－光二极管阵列检测器
DAD三维色谱图
折光指数检测器
电导检测器
荧光检测器
蒸发激光散射检测器
电化学检测器
利用氧化还原反应的检测器
梯度曲线
进样装置－停流进样
手动进样器－六通阀
Sample Syringe
Load
To Waste
Inject
To Waste
To Column
From Pump
Sample Loop (Fixed Volume)
To Column
From Pump
进样装置－六通阀进样
进样装置－自动进样器
min(分析型），1～100ml/min; 微径柱： 10~1000μl/min 4. 输出流量稳定，重现性好。
恒流泵－注射螺杆泵
注射螺杆泵的优缺点
优点：流量稳定，无脉动 缺点： （1）液缸体积有限，约100～150ml,
不利于连续工作。 （2）不能用于梯度洗脱。
恒流泵－往复泵
Agilent 1100 系列自动进样器
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
Precision
0.1
0
10 25 50 100
色谱柱
1. 柱材料 内壁抛光、钝化的不锈钢管 2. 规格 a.内径4.6或3.9mm，柱长10～30cm, 5~10μm
填料, 柱效5000~10000/m b.内径4.6或3.9mm，柱长5～10cm, 3～5 μm
千谱 ZD－1（本研究所研制）
固定相
内容： 固定相载体结构 正相色谱固定相 键合相色谱固定相
Particles of Column Packings
50 m
Large Porous Particles
30 m 2 m Active Surface
Pellicular Beads
Gear
Motor with Encoder
往复泵的优缺点
1.可在高压下连续输液 2.液缸容积小（几十～几百微升），适合
于梯度洗脱 3.存在脉动 4.柱塞与流动相直接接触，易造成污染
恒压泵
又称气动放大泵
过滤器
脉动阻尼器
梯度洗脱－低压梯度
四元泵工作原理
MCGV 比例阀 AIV 主动阀 OBV 单向阀
氧化、还原反应
氧化
A
B + e-
还原
OH
OH
Hydroquinone
O
+ 2H+ + 2e-
O
Quinone
库仑阵列检测器
高效液相色谱的一种检测器
属于电化学一类
由数个多孔石墨电极串连组成
在一次试验中，可同时提供多个氧化还原反应 电势
库仑阵列电池示意图
Channel 1 Channel 2 Channel 3 Channel 4
Inlet
Outlet
Frit
Counter Reference
Response (µA)
CHLOROGENIC ACID CATECHIN 4HPAC VANILLIC ACID CAFFEIC ACID SYRINGIC ACID
Chromatographic and Voltammetric Resolution
高效液相色谱法
高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法与经典液相色谱法原理 相同，无本质区别。
1. 新型高效输液泵，使分析时间缩短 2. 高效固定相，分离效能高，选择性好 3. 高灵敏度检测器
高效液相色谱法的应用范围
1. 高沸点、热不稳定、分子量大、不同 极性的有机物；
2. 生物活性物质、天然产物； 3. 合成与天然高分子 涉及石油化工、食品、药品、生物化工、
流动相的脱气
1. 氦脱气法 2. 加热回流 3. 抽真空 4. 超声脱气 5. 在线脱气
12 ml
Solenoid valve
HP1100 on-line degasser
高压输液泵
要求： 1. 泵体材料耐腐蚀。优质耐酸不锈钢，
聚醚醚酮（PEEK) 2. 耐高压。40～50MPa 3. 输出流量范围宽。填充柱: 0.1~10 ml/
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0 Retention time (minutes)
色谱工作站
ChemStation (Agilent 1100) Empower (Waters) CLASS VP (Shimadzu) 杭州英谱 N-2000
4. HPLC 不能代替中、低压色谱，如受压 易分解变性的具有生物活性的生化样品。
高效液相色谱仪
高效液相色谱 (HPLC)
混合器 泵
进样口 液瓶
1. 贮液瓶应耐腐蚀，用玻璃、不锈钢、 氟塑料或特种塑料。
2. 溶剂使用前必须经过0.45μm滤膜过滤， 过滤用液相色谱专用滤膜或4号微孔玻璃 漏斗。
3-10 m
MCGV
Vacuum Chamber
from solvent bottles
Damper Purge Valve
AIV
to injection device
OBV
Authoring Division Name File Name Security Notice (if required)
Waste
梯度洗脱－高压梯度
单元泵工作原理
Outlet Ball Valve Active Inlet Valve
Damper Purge valve
Seal
Piston
Ball Screw Drive
Authoring Division Name File Name Security Notice (if required)
环境等领域。80％的化合物可用HPLC分 析。
HPLC的局限性
1. 溶剂消耗大，成本高于GC, 梯度洗脱 的操作也比GC的程序升温复杂。
2. 缺少通用型检测器。近年来ELSD应用 日益增多，有望成为通用型检测器，但 稳定性尚需提高。
3. HPLC不能代替GC，对于柱效要求高 的分析，仍需GC，如石油产品。