抗MDV-1 VP22羧基端单克隆抗体的制备与免疫学特性鉴定
猪细小病毒核衣壳VP2蛋白单克隆抗体的制备及部分特性鉴定
Ａｂ ｔａ ｔ ｓｒ ｃ ：Ｔｈ ｅＢＡＬ ｃｍｉｅｗｅ ｅｉ Ｂ／ ｃ ｒ ｍｍｕ ｉｅ ｔ ｕ ｉ ｅ ＰＶＶＰ ． ｉｅｈ ｂ ｉｏ ｅｌ ｉｅ ， ａ ｄ ｎ ｚ ｄ ｗｉ ｐ ｒｆ ｄ Ｐ ｈ ｉ ２ Ｆ ｖ ｙ ｒｄ ｍａ ｃ ｌ ｌ ｓ ｎ ｍｅ ｎ
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抗人胰岛素样生长因子-1单克隆抗体的制备与鉴定
抗人胰岛素样生长因子-1单克隆抗体的制备与鉴定毕立清;刘莉;程蕴琳;施有为;仇镇宁;姜苏蓉【期刊名称】《南京医科大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2008(028)006【摘要】目的:制备稳定分泌抗人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞系,并对其分泌的mAb进行鉴定.方法:用纯化后的hIGF-1重组蛋白免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备抗hIGF-1的mAb,用Western blot法鉴定mAb的特异性,用间接ELISA法检测mAb腹水效价及mAb的亲和力,杂交瘤细胞染色体分析,鉴定Ig亚类.结果:获得2株能稳定分泌抗hIGF-1的mAb 杂交瘤细胞系,Western blot分析显示,该mAb能与具有生物学活性的成熟IGF-1蛋白结合.腹水mAb效价可达6×104.mAb相对亲和力为2.1×109/mol～7.8×109/mol.2株单抗属IgM亚类.染色体分析符合杂交瘤细胞特征.结论:成功制备出抗hIGF-1的2株mAb杂交瘤细胞,为进一步用于hIGF-1的临床检测和实验研究创造了条件.【总页数】6页(P712-716,741)【作者】毕立清;刘莉;程蕴琳;施有为;仇镇宁;姜苏蓉【作者单位】南京医科大学第一附属医院老年医学科,江苏,南京,210029;南京医科大学第一附属医院老年医学科,江苏,南京,210029;南京医科大学第一附属医院老年医学科,江苏,南京,210029;南京医科大学第一附属医院老年医学科,江苏,南京,210029;南京医科大学卫生部抗体技术重点实验室,江苏,南京,210029;南京医科大学第一附属医院老年医学科,江苏,南京,210029【正文语种】中文【中图分类】R329.28【相关文献】1.抗人绒毛膜促性腺激素β亚单位羧基末端肽（hCGβ-CTP）单克隆抗体制备及初步鉴定 [J], 王锐;安晓丽;梁秋波;张道旭;李郑武;2.抗人OX40单克隆抗体的制备和初步鉴定 [J], 侯小娟;陈鸿斌;袁旭东;王双;仇玮祎;孙志伟3.抗人釉原蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 [J], 程岚;束蓉;夏一如;宁航4.重组抗HER2人源化单克隆抗体大规模制备及活性鉴定方法学建立 [J], 陈观平;汪一帆;应栩华5.抗人Ig轻链系列单克隆抗体的研制1．抗人λ轻链亚型／亚群单克隆抗体的制备及特性鉴定 [J], 赵蓉;郑志竑;谢捷明;包少佳;吴国华;邱文萱因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
抗伏马菌素B1单克隆抗体的制备及试剂盒的研制
ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＧｌ，ＩｇＧ２。，ＩｇＧ２ｂ，ＩｇＧ３）以上均购自美国Ｓｉｇｍａ公司； ＲＰＭＩ １６４０培养基，ＨＡＴ选择性培养基，ＨＥＰＥＳ，福氏佐剂（完 全、不完全），二甲基亚砜（ＤＭＦ），吐温２０（Ｔｗｅｅｎ ２０），聚乙二醇 （ＰＥＧ，ＭＷ ４０００），青霉素，链霉素，以上均购自Ｇｉｂｃｏ公司；辣 根过氧化物酶羊抗鼠ＩｇＧ（北京中山试剂公司），３０％Ｈ２０２（优 级纯，北京化工厂）。 １．１．３溶液系统ＥＬＩＳＡ使用液
关键词：伏马菌素Ｂ， 中图分类号：Ｒ１５５．５２
单克隆抗体ＥＬＩＳＡ试剂盒
ＴＳ２０７．５
文献标识码：Ａ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｆｕｍｏｎｉｓｉｎ Ｂｌ ａｎｄ ＥＬＩＳＡ—ｋｉｔ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｆｕｍｏｎｉｓｉｎ Ｂ１
＋１．７９３（ｒ＝Ｏ．９９，Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｏｎ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ５０ｎｇ／ｍｌ，２００ｎｇ／ｍｌ ａｎｄ ５００ｎｇ／ｍｌ ｗａｓ ａｍｏｎｇ
７１．８９％一１１２．９５％．Ｔｈｅ ｋｉｔ ｃａｎ ｂｅ ｓｔｏｒｅｄ ａｔ ｎｏｒｍａｌ ｔｅｍｐｅｒｔａｔｕｒｅ ｉｎ ｔｅｎ ｍｏｎｔｈｓ ａｔ ｌｅａｓｔ．Ｔｈｅ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｎｔ ｗｉｎｔｈｉｎ— ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ ｂｅｔｗｅｅｎ—ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｗａｓ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ２０％．
用２～４轮淘选，仅需两周左右的时间；（５）当抗体库容量很大 时，可得到高亲和力抗体。目前认为影响抗体库容量的主要 因素是抗体引物的多样性与细菌转化率的限制。国内报道用 不同的系统构建的库容为２．７×１０６。作者电转一次构建的库 容为１．２×１０６，如果要得到接近体内Ｂ淋巴细胞群数量（约 ｌＯｓ）的抗体库，必须通过增加转化次数来累积库容。有文献 报道经过上百次的电穿孔转化获得了１０”的抗体库№ｏ。
病毒学：MDV-1 CV1988／Rispens疫苗毒体外感染期间VP22的表达及细胞间转导作用
２０ ｏ．２ ｏ１ ０ ６ｖ １ ，Ｎ ．９ １
解 析 其 结 构 分 别 为 ４（一 咯 基 ）１异喹 一 吡 ２ 一一 啉 酮 ．一 酸 （ ） ４（． 咯 基 ）１异 喹 ３甲 Ａ和 ． 吡 ２ －－ 啉 酮 一一 酸 甲酯 （ ） 在 相 刷 条件 下 ， ３甲 Ｂ． 通 过 单 独 培 养 这 两 株 内 生 真 菌 未 能 得 到 ｍａｉａ ｄ ｓ ｒ ｍｉ ．实验 结 果表 明 ，混合 发酵 ｎ ｅ 技 术 有 可 能 成 为 寻 找 新 颖 代谢 产物 的有 效 途 径 ． 图 １ ２参 ３ 表 ６ 关键词 ：内生真菌；混合发酵：代 谢产
０１１２ ６ ９ １６ １ ０・ ４ 病毒 学 ８ ６
ＭＤ １ＣＶ ９ ８ Ｒｓｅ ｓ疫苗毒体外感 Ｖ一 Ｉ８ ／ ｉ ｎ ｐ 染期 间 Ｖ ２ 的表 达 及 细 胞 间转 导 作 用 Ｐ２ ［ ，中］ 陈鸿军（ 刊 ／ 扬州大学江苏 省动物 预防医学重点实验室 ，扬州 ２ ５ ０ ） ２ ０ ９， 宋 翠 萍 ，秦 爱 建 ， 张晨 飞， 国 科 学 Ｃ ／ 中
物 ： 生物 碱
ｔ １ １ ２ ＇ ９ １５ ６ １ ０ ・６ ８ １
研 究 类 （ 自然科学）
ＣＶ ９ ８ 的 Ｖ ２ 蛋 白转 导功 能 奠 定 了 Ｉ８ 株 Ｐ２
基 础 ．图 ３参 ２ ４
１ ６７
明， 共混膜非常适合角膜细 胞贴 附生长 ，
１ ０ｄ内长 成 良好 单 层 细 胞 ．将 载 有 角膜
０ １ １２ ６的 全 基 因 组 分 析 ００ ［ ， 中］ 杨 帆 （ 毒 基 因 工程 国家 重 点 刊 ／ 病 实验 室，北京 １０ ７ ） ０ １６ ，贾茜，熊朝晖 ， 张笑 冰 ，吴洪 涛 ，赵 颖 ，杨 剑 ，朱俊 萍 ， 董 杰 ，薛 颖 ， 孙 立 连 ， 沈 岩 ，金 奇 ， ／ 科
伪狂犬病病毒VP22_蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定
ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ＶＰ２２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＰＲＶ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｕｐｐｏｒｔ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆｅ １５ｔｈ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｗａｓ １： ６ ４００ Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｕｂｔｙｐｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｈｅａｖｙ
ｃｈａｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ＩｇＧ１， ａｎｄ ｔｈｅ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅ κ ｔｙｐｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎｄ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍ⁃
Ｒｕｒａｌ Ａｆｆａｉｒｓ， Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９５， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＶＰ２２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ （ ＰＲＶ） ， ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ
Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ＆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２０２４， ５６ （５） ： ８２－８９．
抗Periostin单克隆抗体的制备及鉴定
曹启江等抗Periostin 单克隆抗体的制备及鉴定第1期抗Periostin 单克隆抗体的制备及鉴定①曹启江李雪娇②张朔②刘畅②张鹏②赵洪礼（沈阳大学生命科学与工程学院，辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室，沈阳110044）中图分类号R392.12文献标志码A文章编号1000-484X （2022）01-0067-04［摘要］目的：制备抗Periostin 单克隆抗体并鉴定其免疫学性能，为后期临床应用奠定基础。
方法：表达并纯化Periostin 的GST 融合蛋白，经过免疫小鼠、细胞融合及亚克隆筛选，制备效价良好的高亲和力单克隆抗体，并用免疫组化实验鉴定其免疫学性能。
结果：获得6株杂交瘤细胞株，均能稳定分泌高亲和力抗体，经酶联免疫吸附测定、Western blot 和免疫组化实验证实均能特异性识别人的Periostin ，显微镜下观察发现Periostin 在结直肠癌、乳腺癌等肿瘤患者的组织切片中表达水平显著高于健康人。
结论：成功制备了高亲和力、特异性强的抗人Periostin 单克隆抗体，为小分子抗体以及抗体人源化制备奠定了基础，进而为治疗人体内组织器官纤维化提供理论依据。
［关键词］Periostin ；细胞融合；杂交瘤细胞；单克隆抗体Generation and characteristics identification of monoclonal antibody to PeriostinCAO Qijiang ，LI Xuejiao ，ZHANG Shuo ，LIU Chang ，ZHANG Peng ，ZHAO Hongli.Liaoning Key Laboratory of Urban Integrated Pest Management and Ecological Security ，College of Life Science and Bioengineering ，Shenyang University ，Shenyang 110044，China［Abstract ］Objective ：To generate and characterize Periostin -specific monoclonal antibodies ，and to lay the foundation for laterclinical applications.Methods ：GST fusion protein of Periostin was expressed and purified ，monoclonal antibody against Periostin was generated by mouse immunization ，cell fusion ，subcloning ，screening.Prepare high -affinity monoclonal antibodies ，which were used forimmunohistochemical experiments to identify immunological properties.Results ：Six hybridoma cell lines capable of stably secretinganti -Periostin antibodies were obtained.These monoclonal antibodies specifically recognized human Periostin protein by ELISA ，Western blot and ing microscope found Periostin were increased obviously in the colorectal cancer ，breast cancer than normal tissue.Conclusion ：The anti -human Periostin monoclonal antibodies with high affinity and specificity were success‐fully generated ，thereby providing the foundation for the preparation of small molecule antibodies or humanized antibodies ，and then lay a theoretical basis for the treatment of human tissue and organ fibrosis disease.［Key words ］Periostin ；Cell fusion ；Hybridoma cells ；Monoclonal antibody组织器官的纤维化是影响组织器官功能的主要因素，是世界性的医学难题。
非洲猪瘟病毒p22蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(１０):１４０~１４５ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.１０.０１９收稿日期:２０２２－１２－２８基金项目:山东省重点研发计划项目(２０２０ＣＸＧＣ０１０８０１ꎬ２０２２ＴＺＸＤ００４１ꎬ２０２２ＣＸＰＴ０１０ꎬ２０２１ＬＺＧＣ００１)ꎻ山东省现代农业产业技术体系(ＳＤＡＩＴ－０８－０１)ꎻ山东省农业科学院农业科技创新工程项目(ＣＸＧＣ２０２３Ｆ１０ꎬＣＸＧＣ２０２３Ａ２１ꎬＣＸＧＣ２０２３Ａ２１)ꎬ泰山学者工程项目作者简介:矫健(１９９８ )ꎬ男ꎬ山东青岛人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事动物病毒学与免疫学研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:１１７４６２９５６１＠ｑｑ.ｃｏｍ李建达(１９９２ )ꎬ男ꎬ山东济南人ꎬ博士ꎬ主要从事动物微生物与免疫学研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｌｊｄ４４５３＠１６３.ｃｏｍ∗同为第一作者ꎮ通信作者:于江(１９８５ )ꎬ女ꎬ山东莱州人ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ研究方向为动物病原学与免疫学ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｙｕｊｉａｎｇ＿２２１３＠１６３.ｃｏｍ吴家强(１９７５ )ꎬ男ꎬ山东诸城人ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ研究方向为动物病原学与免疫学ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｗｕｊｉａｑｉａｎｇ２０００＠ｓｉｎａ.ｃｏｍ非洲猪瘟病毒ｐ２２蛋白单克隆抗体的制备及鉴定矫健１ꎬ２ꎬ李建达２∗ꎬ韩先杰１ꎬ张琳２ꎬ张玉玉２ꎬ任素芳２ꎬ刘飞２ꎬ陈智２ꎬＮａｔａｌｉｉａＨｒａｂｃｈｅｎｋｏ２ꎬ张文娟３ꎬ于江１ꎬ２ꎬ吴家强１ꎬ２(１.青岛农业大学动物医学院ꎬ山东青岛㊀２６６１０９ꎻ２.山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室/农业农村部畜禽生物组学重点实验室ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ３.山东碧蓝生物科技有限公司ꎬ山东泰安㊀２７１４００)㊀㊀摘要:非洲猪瘟(ＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒꎬＡＳＦ)是由非洲猪瘟病毒(ＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓꎬＡＳＦＶ)引起的一种高度传染性病毒性疾病ꎬ发病率和死亡率高达１００％ꎬ对我国的生猪养殖业造成了毁灭性打击ꎮｐ２２蛋白为ＡＳＦＶ的结构蛋白ꎬ本研究构建了重组原核表达质粒ｐＥＴ－３２ａ－ｐ２２ꎬ将其转化至大肠杆菌ＢＬ２１(ＤＥ３)感受态细胞表达重组ｐ２２蛋白并纯化ꎬ经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定证实重组ｐ２２蛋白与ＡＳＦＶ阳性血清有良好的免疫反应性ꎮ利用重组ｐ２２蛋白免疫Ｂａｌｂ/ｃ小鼠并通过间接ＥＬＩＳＡ方法筛选到２株能够稳定分泌ｐ２２蛋白单克隆抗体(ＭＡｂ)的杂交瘤细胞株２Ｄ６和５Ｅ７ꎮ经抗体亚型鉴定两株抗体均为ＩｇＧ１型ꎻ经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定ꎬ两株抗体能够特异性识别过表达的ｐ２２蛋白ꎮ综上ꎬ本研究成功表达并纯化了ｐ２２重组蛋白ꎬ制备了ｐ２２单克隆抗体ꎬ为进一步探讨ｐ２２蛋白的结构功能及其在ＡＳＦＶ中的感染致病机制提供了基础条件ꎮ关键词:非洲猪瘟病毒ꎻｐ２２蛋白ꎻ单克隆抗体ꎻ原核表达中图分类号:Ｓ８５２.６５＋１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)１０－０１４０－０６ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔｐ２２ＰｒｏｔｅｉｎｏｆＡｆｒｉｃａｎＳｗｉｎｅＦｅｖｅｒＶｉｒｕｓＪｉａｏＪｉａｎ１ꎬ２ꎬＬｉＪｉａｎｄａ２∗ꎬＨａｎＸｉａｎｊｉｅ１ꎬＺｈａｎｇＬｉｎ２ꎬＺｈａｎｇＹｕｙｕ２ꎬＲｅｎＳｕｆａｎｇ２ꎬＬｉｕＦｅｉ２ꎬＣｈｅｎＺｈｉ２ꎬＮａｔａｌｉｉａＨｒａｂｃｈｅｎｋｏ２ꎬＺｈａｎｇＷｅｎｊｕａｎ３ꎬＹｕＪｉａｎｇ１ꎬ２ꎬＷｕＪｉａｑｉａｎｇ１ꎬ２(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＱｉｎｇｄａｏＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＱｉｎｇｄａｏ２６６１０９ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＳｈａｎｄｏｎｇＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｉｍａｌＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＬｉｖｅｓｔｏｃｋａｎｄＰｏｕｌｔｒｙＭｕｌｔｉ￣ｏｍｉｃｓꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＳｈａｎｄｏｎｇＧｒｅｅｎＢｌｕｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｍｐａｎｙＬｉｍｉｔｅｄꎬＴａｉａｎ２７１４００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ａｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒ(ＡＳＦ)ｉｓａｈｉｇｈｌｙｃｏｎｔａｇｉｏｕｓｖｉｒａｌｄｉｓｅａｓｅｃａｕｓｅｄｂｙＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ(ＡＳＦＶ)ｗｉｔｈｔｈｅｍｏｒｂｉｄｉｔｙａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙｕｐｔｏ１００％ꎬｗｈｉｃｈｈａｓｃａｕｓｅｄａｄｅｖａｓｔａｔｉｎｇｂｌｏｗｔｏＣｈｉｎａ ｓｐｉｇｆａｒｍｉｎｇｉｎｄｕｓｔｒｙ.Ｔｈｅｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎｉｓａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｏｆＡＳＦＶ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｐＥＴ￣３２ａ￣ｐ２２ｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１(ＤＥ３)ｒｅｃｅｐｔｉｖｅｃｅｌｌｓｔｏｅｘｐｒｅｓｓｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｐｕｒｉｆｙｉｔ.Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎｈａｄｇｏｏｄｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｗｉｔｈＡＳＦＶｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｒｕｍ.Ｂａｌｂ/ｃｍｉｃｅｗｅｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈｔｈｅｒｅ￣ｃｏｍｂｉｎａｎｔｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｔｗｏｈｙｂｒｉｄｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｓ２Ｄ６ａｎｄ５Ｅ７ꎬｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｓｅｃｒｅｔｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ(ＭＡｂ)ｔｏｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎꎬｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙｉｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡ.Ｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙｓｕｂｔｙｐｅｓｏｆｔｈｅｔｗｏｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉ￣ｆｉｅｄａｓＩｇＧ１ｔｙｐｅ.Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｗｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｃｏｕｌｄｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｒｅｃｏｇｎｉｚｅｔｈｅｏｖｅｒｅｘ￣ｐｒｅｓｓｅｄｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎ.Ｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎꎬｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬａｎｄｔｈｅｐ２２ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｗａｓｐｒｅｐａｒｅｄꎬｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｄｏｎｅｏｆｔｈｅｂａｓｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｆｕｒ￣ｔｈｅｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎꎬａｎｄａｌｓｏｉｔｓｒｏｌｅｉｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆＡＳＦＶｉｎ￣ｆｅｃｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ａｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓꎻｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎꎻＭｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙꎻＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ㊀㊀非洲猪瘟(ＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒꎬＡＳＦ)是由非洲猪瘟病毒(ＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓꎬＡＳＦＶ)引起的一种高度传染性㊁出血性疾病ꎬ临床上以高热㊁皮肤发绀㊁淋巴结及脏器广泛出血为主要特征ꎬ如肾瘀斑㊁皮肤红斑㊁肺水肿㊁弥散性血管内凝血等[１]ꎮＡＳＦＶ主要通过接触性传播ꎬ家猪和野猪都是其主要宿主ꎬ一旦侵入家猪ꎬ便可在猪群中快速传播ꎬ发病率和死亡率高达１００％[２－３]ꎬ感染性病毒在组织中能够存在较长时间ꎬ尤其是淋巴结和扁桃体[４]ꎮ此外ꎬ该病毒也是唯一已知的ＤＮＡ虫媒病毒ꎬ能够通过软蜱进行传播[５]ꎮＡＳＦ于１９２１年首次在肯尼亚报道ꎬ随后传入其他非洲国家[６]ꎮ２００７年ꎬ在格鲁吉亚发现了毒力更高的ＡＳＦＶⅡ型ꎬ并迅速传播[７]ꎮ２０１８年８月ꎬ我国沈阳首次暴发ＡＳＦꎬ随后迅速蔓延到全国所有省份[８]ꎬ对我国乃至全世界的养猪业造成了严重的经济损失ꎮＡＳＦＶ是Ａｓｆａｒｖｉｒｉｄａｅ科中Ａｓｆａｒｖｉｒｕｓ属的唯一成员[９]ꎬ是一种有囊膜的双链ＤＮＡ病毒ꎮＡＳＦＶ粒子是具有多层结构的二十面体ꎬ直径约为２００ｎｍꎬ病毒粒子结构自内向外依次为类核㊁核壳㊁内囊膜㊁衣壳㊁外囊膜[１０－１１]ꎮＡＳＦＶ基因组长度约为１７０~１９４ｋｂꎬ目前已从其中鉴定出结构蛋白６８种ꎬ部分蛋白的功能尚不清楚[１２]ꎮ这些结构蛋白分布在不同的区域ꎬ在病毒黏附与入侵㊁病毒基因组复制和转录㊁病毒包装与出芽以及免疫逃避等病毒感染的不同方面发挥着重要的作用[５]ꎮ由于ＡＳＦＶ结构复杂繁冗ꎬ对其功能的了解也十分有限ꎬ到目前为止还没有完全有效的ＡＳＦＶ商业疫苗ꎬ因此鉴定病毒结构蛋白的免疫原性在探讨病毒与宿主相互作用中至关重要[１３]ꎮＡＳＦＶｐ２２蛋白由ＫＰ１７７Ｒ基因编码ꎬ分子量为２２ｋＤａꎮｐ２２最初被描述为一种早期诱导的跨膜结构蛋白ꎬ位于病毒颗粒外部ꎬ能够从病毒颗粒表面溶解释放出来[１４]ꎮ然而ꎬ进一步的研究发现ꎬｐ２２蛋白位于病毒颗粒的内膜和感染细胞的表面[１５]ꎮ目前ꎬｐ２２蛋白在ＡＳＦＶ感染致病过程中的作用仍不清楚ꎮ本研究通过大肠杆菌原核表达系统成功表达并纯化出ｐ２２重组蛋白ꎬ通过免疫Ｂａｌｂ/ｃ小鼠成功制备了其单克隆抗体(ＭＡｂ)ꎬ为进一步探究ｐ２２蛋白的生物学作用奠定基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀细胞㊁菌株㊁载体及实验动物大肠杆菌Ｔｒａｎｓ５α㊁ＢＬ２１(ＤＥ３)感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司ꎻ骨髓瘤细胞ＳＰ２/０㊁ｐＥＴ－３２ａ载体均由本实验室保存ꎻＡＳＦＶ标准阳性血清购自中国兽医药品监察所ꎻＳＰＦ级５~８周龄Ｂａｌｂ/ｃ雌性小鼠购自济南朋悦试验动物繁育有限公司ꎮ１.２㊀主要试剂质粒小提试剂盒㊁胶回收试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司ꎻ限制性核酸内切酶㊁Ｔ４ＤＮＡ连接酶㊁蛋白Ｍａｒｋｅｒ均购自赛默飞世尔科技公司ꎻＮｉ￣ＮＴＡＡｇａｒｏｓｅ购自德国Ｑｉａｇｅｎ公司ꎻ单抗亚型鉴定试剂盒购自美国ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ公司ꎻＥＣＬ发光液㊁羊抗鼠ＨＲＰ－ＩｇＧ㊁羊抗猪ＨＲＰ－ＩｇＧ购自Ｂｅｙｏｔｉｍｅ公司ꎮ１.３㊀ＡＳＦＶｐ２２蛋白的原核表达１.３.１㊀重组表达质粒ｐＥＴ－３２ａ－ｐ２２的构建㊀根据ＡＳＦＶｐｉｇ/ＨＬＪ/２０１８株基因序列(ＧｅｎＢａｎｋＮｏ.ＭＫ３３３１８０.１)的ＫＰ１７７Ｒ基因序列进行引物设１４１㊀第１０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀矫健ꎬ等:非洲猪瘟病毒ｐ２２蛋白单克隆抗体的制备及鉴定计ꎬ正向引物(ｐ２２－Ｆ)序列:５ᶄ－ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴ￣ＧＣＧＴＧＴＴＴＡＴＧＡＴＴＡＣ－３ᶄ(包含ＸｈｏⅠ酶切位点)ꎬ反向引物(ｐ２２￣Ｒ)序列:５ᶄ－ＧＧＡＴＣ￣ＣＡＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡ－３ᶄ(包含ＢａｍＨⅠ酶切位点)ꎬ由生工生物工程(上海)股份有限公司合成ꎮ以合成的密码子优化后的ｐ２２基因序列为模板ꎬ使用引物扩增目的基因片段ꎬＰＣＲ反应程序为９５ħꎬ５ｍｉｎꎻ９４ħꎬ４５ｓꎬ５８ħꎬ４５ｓꎬ７２ħꎬ４５ｓꎬ３２个循环ꎻ７２ħꎬ１０ｍｉｎꎻ４ħ结束ꎮ将扩增产物进行１％的琼脂糖凝胶电泳并纯化回收ꎬ用Ｔ４ＤＮＡ连接酶分别将ＫＰ１７７Ｒ基因与ｐＥＴ－３２ａ载体连接ꎬ将连接产物转化到感受态细胞Ｔｒａｎｓ５α中ꎮ挑取单克隆摇菌ꎬ菌液经ＰＣＲ鉴定为阳性后ꎬ送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序ꎮ测序成功后将阳性重组质粒命名为ｐＥＴ－３２ａ－ｐ２２ꎮ１.３.２㊀ＡＳＦＶｐ２２重组蛋白的表达和纯化㊀将阳性重组质粒ｐＥＴ－３２ａ－ｐ２２转化至大肠杆菌ＢＬ２１(ＤＥ３)感受态细胞ꎬ挑取单克隆至ＬＢ培养基中３７ħ培养过夜ꎬ取１ｍＬ菌液接种至氨苄青霉素(ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎꎬＡｍｐ)抗性的１００ｍＬＬＢ液体培养基中ꎬ３７ħ㊁２２０ｒ/ｍｉｎ摇床培养至ＯＤ６００值达到０.６~０.８时ꎬ添加终浓度为１ｍｍｏｌ/Ｌ的ＩＰＴＧ诱导目的蛋白表达ꎬ诱导４ｈ后ꎬ收集菌体沉淀ꎬ使用裂解液(３００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌꎬ５０ｍｍｏｌ/ＬＮａＨ２ＰＯ４ꎬｐＨ＝７.４)重悬菌体ꎬ进行超声破碎ꎬ４ħ㊁４０００ｒ/ｍｉｎ离心ꎬ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴定后使用０.４５μｍ滤膜过滤ꎬ与蛋白纯化填料４ħ过夜结合ꎮ采用亲和层析的方式纯化ꎬ收集洗脱产物ꎬ用于ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定ꎬ使用超滤管将有单一目的蛋白条带的洗脱产物浓缩并置换到ＰＢＳ中ꎬ－８０ħ保存ꎮ１.３.３㊀ＡＳＦＶｐ２２重组蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定㊀重组ｐ２２蛋白纯化后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳ꎬ随后转移到ＰＶＤＦ膜上ꎬ经５％脱脂奶粉封闭后ꎬ以ＡＳＦＶ标准阳性血清(１ʒ１０００)作为一抗孵育２ｈꎮ清洗后ꎬ加入ＨＲＰ标记的羊抗猪ＩｇＧ二抗(１ʒ８０００)孵育１ｈꎬ进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定ꎮ１.４㊀ＡＳＦＶｐ２２单克隆抗体的制备１.４.１㊀Ｂａｌｂ/ｃ小鼠的免疫及血清效价的测定㊀纯化后的重组ｐ２２蛋白与等体积弗氏完全佐剂乳化后ꎬ对４只５~８周龄Ｂａｌｂ/ｃ小鼠进行背部多点皮下注射ꎬ免疫剂量为１００μｇ/只ꎬ每１４ｄ免疫一次ꎬ共免疫３次ꎮ最后一次免疫７ｄ后从小鼠尾静脉取少量血ꎬ分离血清ꎬ通过间接ＥＬＩＳＡ方法检测血清中的抗体效价ꎮ将纯化的ｐ２２重组蛋白以２ｇ/ｍＬ的浓度包被到聚苯乙烯９６孔反应板(１００μＬ/孔)ꎬ４ħ放置过夜ꎻ次日用ＰＢＳＴ洗板３次后进行封闭(ｌ５０μＬ/孔封闭液)ꎬ室温放置０.５ｈꎻ用样品稀释液将小鼠血清按１ʒ２０００ꎬ１ʒ４０００ꎬ１ʒ８０００ꎬ１ʒ１６０００ꎬ１ʒ３２０００ꎬ１ʒ６４０００ꎬ１ʒ１２８０００ 进行倍比稀释ꎬ洗板３次后加入稀释好的血清并设置空白血清做阴性对照(１００μＬ/孔)ꎬ室温孵育１ｈꎻ洗板３次后加入ＨＲＰ标记的鼠二抗(１ʒ５０００ꎬ１００μＬ/孔)ꎬ３７ħ孵育４０ｍｉｎꎻＰＢＳＴ洗板５次并拍干ꎬ加入ＴＭＢ(１００μＬ/孔)ꎬ室温避光显色１０~１５ｍｉｎꎻ加入终止液(５０μＬ/孔)ꎬ用酶标仪测定４５０ｎｍ处各孔的吸光值ꎮ１.４.２㊀细胞融合及亚克隆筛选㊀按照标准流程取免疫后的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞ＳＰ２/０融合ꎬ通过间接ＥＬＩＳＡ方法检测筛选阳性杂交瘤细胞ꎬ使用有限稀释法对单克隆阳性孔进行３次亚克隆ꎮ筛选出稳定表达ｐ２２的阳性孔ꎬ进行扩大培养ꎮ１.４.３㊀腹水制备㊀将阳性杂交瘤细胞扩大培养并注射至Ｂａｌｂ/ｃ小鼠的腹腔(经弗氏不完全佐剂乳化)ꎬ７~１０ｄ后观察小鼠腹部隆起状况ꎬ并及时抽取腹水ꎮ１２０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ收集上清ꎬ－７０ħ冻存备用ꎮ１.５㊀ＡＳＦＶｐ２２单克隆抗体的鉴定１.５.１㊀单克隆抗体效价鉴定㊀将进行不同比例稀释后的腹水作为一抗ꎬＨＲＰ标记的羊抗鼠ＩｇＧ作为二抗ꎬ用重组ｐ２２蛋白建立的间接ＥＬＩＳＡ方法进行效价的测定(方法同１.４.１)ꎮ１.５.２㊀单克隆抗体亚型鉴定㊀用小鼠抗体亚型鉴定试剂盒对杂交瘤细胞制备的腹水抗体进行亚型测定ꎮ准备好包被有重组ｐ２２蛋白的板条(５０ｎｇ/孔)ꎬ每个克隆收集６００μＬ腹水上清ꎬ分别滴加到６个对应的酶标孔中(１００μＬ/孔)ꎬ３７ħ孵育１ｈꎻＰＢＳＴ洗板３次ꎬ将稀释好的分型二抗抗ＩｇＭ㊁ＩｇＡ㊁ＩｇＧ１㊁ＩｇＧ２ａ㊁ＩｇＧ２ｂ㊁ＩｇＧ３的抗体加入６个孔中ꎬ３７ħ孵育１ｈꎻＰＢＳＴ洗板３次ꎬ加入ＴＭＢ显色ꎬ有信号反应的孔对应的鉴定二抗亚型即为２４１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀该抗体的亚型ꎮ１.５.３㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定单克隆抗体的免疫原性㊀纯化的重组ｐ２２蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳后ꎬ转移至ＰＶＤＦ膜上ꎬ使用５％脱脂奶粉封闭２ｈꎻＰＢＳＴ洗膜后ꎬ加入单克隆抗体(１ʒ１０００)ꎬ４ħ孵育过夜ꎻ清洗后ꎬ加入ＨＲＰ标记的羊抗鼠ＩｇＧ二抗孵育１ｈꎬ充分清洗后使用ＥＣＬ发光液进行曝光ꎬ观察结果ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀重组表达质粒ｐＥＴ３２ａ－ｐ２２的构建用ｐ２２－Ｆ/ｐ２２－Ｒ引物对优化的ｐ２２基因进行扩增ꎬ结果显示ꎬＰＣＲ扩增后的ｐ２２基因片段约为４４７ｂｐꎬ大小符合预期(图１)ꎮ通过酶切酶连将ｐ２２扩增产物连接到ｐＥＴ－３２ａ质粒中ꎮ经测序分析后ꎬ基因测序结果完全正确ꎮ２.２㊀重组ｐ２２蛋白的表达和纯化ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳结果显示ꎬ与未诱导组相比ꎬ诱导组可见与预期大小一致的３７ｋＤａ融合蛋白ꎬ经超声破碎后可溶性分析发现ꎬ重组ｐ２２蛋白条带出现在超声后上清中ꎬ表明重组ｐ２２蛋白为可溶性表达(图２Ａ)ꎮ进一步大量诱导ｐ２２重组蛋白的表达ꎬ并与ＨｉｓＮｉ－ＮＴＡＡｇａｒｏｓｅ亲和层析柱结合ꎬ使用不同浓度梯度的咪唑洗脱液洗脱蛋白ꎬ收集洗脱液ꎬ随后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴定ꎮ结果显示ꎬ使用高浓度洗脱液时ꎬ在３７ｋＤａ处出现单一条带(图２Ｂ)ꎬ纯化后纯度大于９５％ꎮ１:ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００ꎻ２:阴性对照ꎻ３:目的基因ＰＣＲ产物ꎮ图１㊀ｐ２２基因ＰＣＲ扩增目的片段２.３㊀重组ｐ２２蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定对重组ｐ２２蛋白进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定ꎬ通过Ｈｉｓ标签抗体孵育后ꎬ在３７ｋＤａ处检测到嵌合Ｈｉｓ标签的ｐ２２蛋白ꎻ而使用ＡＳＦＶ阳性血清孵育后ꎬ发现重组ｐ２２蛋白能够与ＡＳＦＶ阳性血清发生特异性结合(图２Ｃ)ꎬ表明该抗原具有良好免疫原性ꎮＡ:１.预染蛋白质分子质量标准ꎬ２~５.诱导组ꎬ超声破碎后上清ꎬ超声破碎后沉淀ꎬ未诱导组ꎻＢ:１.预染蛋白质分子质量标准ꎬ２.超声破碎后上清ꎬ３.流穿液ꎬ４~９.２０㊁４０㊁５０㊁１００㊁１００㊁２００ｍｍｏｌ/Ｌ咪唑洗脱液ꎻＣ:１㊁３.预染蛋白质分子质量标准ꎬ２.Ｈｉｓ抗体孵育重组ｐ２２蛋白ꎬ４.阳性猪血清孵育重组ｐ２２蛋白ꎮ图２㊀重组ｐ２２蛋白的表达(Ａ)㊁纯化(Ｂ)及鉴定(Ｃ)２.４㊀单克隆抗体的制备及鉴定２.４.１㊀血清效价的测定㊀三免７ｄ后通过间接ＥＬＩＳＡ方法检测接种小鼠血清效价ꎬ测得１㊁２㊁３号小鼠的血清效价为１ʒ１２８０００ꎬ４㊁５号小鼠的血清效价为１ʒ６４０００(图３Ａ)ꎮ选取１㊁２㊁３号小鼠进行加强免疫ꎮ２.４.２㊀单克隆抗体效价测定㊀在骨髓瘤细胞和脾细胞融合后ꎬ进行融合筛选ꎬ对筛选的阳性孔进行３次亚克隆后ꎬ经间接ＥＬＩＳＡ方法检测ꎬ最终筛选到了两株能够稳定分泌重组ｐ２２ＭＡｂ的杂交瘤细胞株ꎬ通过小鼠腹腔注射两种杂交瘤细胞株ꎬ制备了小鼠腹水ꎬ通过间接ＥＬＩＳＡ方法测定腹水的效价分别为１ʒ５１２０００和１ʒ２５６０００(图３Ｂ)ꎬ将获得的单克隆抗体命名为２Ｄ６和５Ｅ７ꎮ３４１㊀第１０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀矫健ꎬ等:非洲猪瘟病毒ｐ２２蛋白单克隆抗体的制备及鉴定图３㊀小鼠血清效价(Ａ)及单克隆抗体效价(Ｂ)的测定２.４.３㊀单克隆抗体亚型鉴定㊀采用美国ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ公司的单抗亚型鉴定试剂盒分别对ｐ２２ＭＡｂ２Ｄ６和５Ｅ７的亚型进行检测ꎬ结果显示两种ＭＡｂ的亚型均为ＩｇＧ１(表１)ꎮ㊀㊀表１㊀单克隆抗体亚型鉴定细胞株编号亚型轻链类型２Ｄ６ＩｇＧ１Ｋａｐｐａ５Ｅ７ＩｇＧ１Ｋａｐｐａ２.４.４㊀单克隆抗体的免疫反应鉴定㊀为了鉴定ＭＡｂ２Ｄ６和５Ｅ７的免疫反应性ꎬ通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测了其对外源性ｐ２２蛋白的反应性ꎮ结果显示ꎬ两株ＭＡｂ均能够在３７ｋＤａ处与ｐ２２蛋白发生特异性反应(图４)ꎮ１:预染蛋白质分子质量标准ꎻ２:重组ｐ２２蛋白ꎮ图４㊀单克隆抗体２Ｄ６(Ａ)和５Ｅ７(Ｂ)的免疫反应鉴定３㊀讨论与结论自２０１８年ＡＳＦ传入中国并迅速传播以来ꎬＡＳＦ对生猪生产造成了重大的经济威胁ꎬ目前ꎬ在中国传播的ＡＳＦＶ类型主要为一种高毒力的基因型Ⅱ毒株[１６]ꎬ基因型Ⅰ毒株也有报道[１７]ꎮＡＳＦＶ在环境中具有高传染性和稳定性ꎬ可通过与受感染的猪或其产品直接接触或通过软蜱进行传播[１８]ꎮ直到目前ꎬ仍然没有针对ＡＳＦＶ的有效商业疫苗ꎬ使得非洲猪瘟的预防㊁控制和治疗变得十分艰难[１９]ꎬ因此ꎬ筛选ＡＳＦ免疫原性蛋白ꎬ鉴定免疫相关基因ꎬ将有助于ＡＳＦ疫苗的开发ꎮ另外ꎬ需要对ＡＳＦＶ的结构功能等基础研究进行攻克ꎬ以期为ＡＳＦ疫苗或诊断试剂的研发提供更多理论依据ꎮ相关研究表明ꎬ鉴定最具抗原性的病毒蛋白对改进血清学诊断试验具有重要作用ꎬ在ＡＳＦＶ血清诊断试验中使用重组蛋白作为抗原来源可避免操纵活病毒的潜在风险[２０]ꎮｐ２２蛋白为ＡＳＦＶ的结构蛋白ꎬ根据序列分析比较ꎬ东欧等地区ＡＳＦＶ分离株中的ｐ２２序列保守ꎬ证明ｐ２２蛋白是抗原稳定的ꎬ因此适合用作开发新的血清诊断试验的工具[２１]ꎮ目前对于ｐ２２蛋白的功能研究尚不完善ꎬ其生物学功能仍待阐明ꎮ原核表达系统具有操作简单㊁表达量高的特点ꎬ本研究中所用的原核表达载体ｐＥＴ－３２ａ可在ＢＬ２１(ＤＥ３)细菌中高度表达ꎬ并且可以在裂解物的上清液中检测到大量目标蛋白ꎬ大大简化了纯化过程ꎬ同时避免了由包涵体的变性和复性可能引起的活性损失[２２]ꎮ虽然从构象结构上看ꎬ原核表达与真核表达的抗原会有差异ꎬ但不会影响抗原的线性表位[２３]ꎬ因此ꎬ使用原核表达系统制备单克隆抗体仍可继续进行线性表位的筛选ꎬ为ＡＳＦＶ结构功能的研究提供生物学材料ꎮ单克隆抗体(ＭＡｂ)是诊断病毒感染的关键试剂ꎮ与多克隆抗体相比ꎬＭＡｂ在现代免疫诊断的应用中表现出特异性强㊁灵敏度高等优势ꎬ在疾病预防㊁诊断㊁治疗和流行病学调查等研究中发挥了巨大作用ꎮ张冯禧等[２４]通过原核表达系统获４４１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀得ＡＳＦＶｐ３０重组蛋白并制备了ＭＡｂꎬ效价为１ʒ１０２４００ꎬ表明该蛋白有良好的免疫原性ꎮ齐艳丽等[２５]通过原核表达系统表达纯化了ＡＳＦＶｐ５４重组蛋白并制备了ＭＡｂꎬ抗体ＥＬＩＳＡ效价均高于１ʒ２５６００且特异性良好ꎮ本研究通过大肠杆菌表达系统成功表达并纯化出一种可溶性重组蛋白ｐ２２ꎬ并制备了两株针对该蛋白的ＭＡｂꎮ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ共同分析ꎬ重组蛋白大小约为３７ｋＤａꎬ将纯化的重组蛋白做免疫原免疫小鼠ꎬ得到抗体的ＥＬＩＳＡ效价不低于１ʒ２５６０００ꎬ说明制备的ＭＡｂ具有良好的免疫原性ꎬ为ｐ２２蛋白的结构功能等基础研究以及ＡＳＦＶ免疫类诊断试剂产品的开发提供了重要的生物材料ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＺｈｕＸꎬＦａｎＢꎬＺｈｏｕＪꎬｅｔａｌ.Ａｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｍｅｔｈｏｄｔｏａｎ￣ａｌｙｚｅｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎｏｆＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓｉｎｖｉｔｒｏ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２１ꎬ８:７１９－８５９.[２]㊀王清华ꎬ任炜杰ꎬ包静月ꎬ等.我国首例非洲猪瘟的确诊[Ｊ].中国动物检疫ꎬ２０１８ꎬ３５(９):１－４.[３]㊀吴萌萌ꎬ张栋良ꎬ孙彩虹ꎬ等.非洲猪瘟研究进展[Ｊ].畜牧兽医杂志ꎬ２０２２ꎬ４１(１):４３－４７.[４]㊀ＷｉｌｋｉｎｓｏｎＰＪꎬＷａｒｄｌｅｙＲＣꎬＷｉｌｌｉａｍｓＳＭ.ＳｔｕｄｉｅｓｉｎｐｉｇｓｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ(Ｍａｌｔａ/７８)[Ｃ]ʊＥｘ￣ｐｅｒｔＣｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎｏｎＡｆｒｉｃａｎＳｗｉｎｅＦｅｖｅｒＲｅｓｅａｒｃｈꎬ１９８３:７４－８４.[５]㊀ＤｉｘｏｎＬＫꎬＣｈａｐｍａｎＤＡＧꎬＮｅｔｈｅｒｔｏｎＣＬꎬｅｔａｌ.Ａｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｏｍｉｃｓ[Ｊ].ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１３ꎬ１７３(１):３－１４.[６]㊀Ｇａｖｉｅｒ￣ＷｉｄéｎＤꎬＳｔåｈｌＫꎬＤｉｘｏｎＬ.ＮｏｈａｓｔｙｓｏｌｕｔｉｏｎｓｆｏｒＡｆｒｉ￣ｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０２０ꎬ３６７(６４７８):６２２－６２４. [７]㊀ＤｉｘｏｎＬＫꎬＳｕｎＨꎬＲｏｂｅｒｔｓＨ.Ａｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒ[Ｊ].Ａｎｔｉｖｉ￣ｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１９ꎬ１６５:３４－４１.[８]㊀ＧｅＳꎬＬｉＪꎬＦａｎＸꎬｅｔａｌ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓꎬＣｈｉｎａꎬ２０１８[Ｊ].ＥｍｅｒｇｉｎｇＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａ￣ｓｅｓꎬ２０１８ꎬ２４(１１):２１３１－２１３３.[９]㊀ＡｌｏｎｓｏＣꎬＢｏｒｃａＭꎬＤｉｘｏｎＬꎬｅｔａｌ.ＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍꎬＩＲＩＣＴＶｖｉ￣ｒｕｓｔａｘｏｎｏｍｙｐｒｏｆｉｌｅ:Ａｓｆａｒｖｉｒｉｄａｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉ￣ｒｏｌｏｇｙꎬ２０１８ꎬ９９:６１３－６１４.[１０]ＷａｎｇＧꎬＸｉｅＭꎬＷｕＷꎬｅｔａｌ.Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｉｖｅｒ￣ｓｉｔｉｅｓｏｆＡＳＦＶｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｖｉｒｕｓｅｓꎬ２０２１ꎬ１３(１１):２１２４. [１１]ＷａｎｇＮꎬＺｈａｏＤꎬＷａｎｇＪꎬｅｔａｌ.ＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｏｆＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓａｎｄｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｖｉｒａｌａｓｓｅｍｂｌｙ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１９ꎬ３６６(６４６５):６４０－６４４.[１２]郭怡德ꎬ李冰ꎬ蔡汝健ꎬ等.非洲猪瘟病毒蛋白功能研究进展[Ｊ].动物医学进展ꎬ２０２０ꎬ４１(１０):９６－１０１. [１３]ＤíａｚＣꎬＳａｌáｔＪꎬＫｏｌａｒ㊅ｏｖáＤＢꎬｅｔａｌ.Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｉｍｍｕｎｏ￣ｇｅｎｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｎｔｉｇｅｎｓｂａｓｅｄｏｎｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＲｅ￣ｓｅａｒｃｈꎬ２０２２ꎬ６６(３):２９７－３０４.[１４]ＣａｍａｃｈｏＡꎬＶｉñｕｅｌａＥ.Ｐｒｏｔｅｉｎｐ２２ｏｆＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉ￣ｒｕｓ:ａｎｅａｒｌｙｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｔｈａｔｉｓｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｍｅｍｂｒａｎｅｏｆｉｎｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ１９９１ꎬ１８１(１):２５１－２５７.[１５]ＡｌｅｊｏＡꎬＭａｔａｍｏｒｏｓＴꎬＧｕｅｒｒａＭꎬｅｔａｌ.ＡｐｒｏｔｅｏｍｉｃａｔｌａｓｏｆｔｈｅＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓｐａｒｔｉｃｌｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ２０１８ꎬ９２(２３):ＤＯＩ:１０.１１２８/ｊｖｉ.０１２９３－１８.[１６]ＭｏｎｔｅａｇｕｄｏＰＬꎬＬａｃａｓｔａＡꎬＬóｐｅｚＥꎬｅｔａｌ.ＢＡ７１ΔＣＤ２:ａｎｅｗｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｉｖｅａｔｔｅｎｕａｔｅｄＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓｗｉｔｈｃｒｏｓｓ￣ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ９１(２１):ＤＯＩ:１０.１１２８/ｊｖｉ.０１０５８－１７.[１７]ＳｕｎＥꎬＨｕａｎｇＬꎬＺｈａｎｇＸꎬｅｔａｌ.ＧｅｎｏｔｙｐｅＩＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅ￣ｖｅｒｖｉｒｕｓｅｓｅｍｅｒｇｅｄｉｎｄｏｍｅｓｔｉｃｐｉｇｓｉｎＣｈｉｎａａｎｄｃａｕｓｅｄｃｈｒｏ￣ｎｉｃｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＥｍｅｒｇｉｎｇＭｉｃｒｏｂｅｓ＆Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓꎬ２０２１ꎬ１０(１):２１８３－２１９３.[１８]ＲｅｖｉｌｌａＹꎬＰｅｒｅｚ￣ＮｕｎｅｚＤꎬＲｉｃｈｔＪＡ.Ａｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉ￣ｒｕｓｂｉｏｌｏｇｙａｎｄｖａｃｃｉｎｅａｐｐｒｏａｃｈｅｓ[Ｊ].ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＶｉｒｕｓＲｅ￣ｓｅａｒｃｈꎬ２０１８ꎬ１００:４１－７４.[１９]ＷｕＫꎬＬｉｕＪꎬＷａｎｇＬꎬｅｔａｌ.ＣｕｒｒｅｎｔｓｔａｔｅｏｆｇｌｏｂａｌＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖａｃｃｉｎｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｕｎｄｅｒｔｈｅｐｒｅｖａｌｅｎｃｅａｎｄｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆＡＳＦｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅｓꎬ２０２０ꎬ８(３):５３１.[２０]ＧａｌｌａｒｄｏＣꎬＢｌａｎｃｏＥꎬＲｏｄｒíｇｕｅｚＪＭꎬｅｔａｌ.Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｐｒｏｐｅｒ￣ｔｉｅｓａｎｄｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓｐｒｏｔｅｉｎｐｐ６２ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｉｎｓｅｃｔｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉ￣ｏｌｏｇｙꎬ２００６ꎬ４４(３):９５０－９５６.[２１]ＶｌａｓｏｖａＮＮꎬＫａｚａｋｏｖａＡＳꎬＶａｒｅｎｔｓｏｖａＡＡꎬｅｔａｌ.Ｃｏｍｐａｒａ￣ｔｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｏｕｔｅｒｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆＡｆｒｉ￣ｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｇｉｏｎｓｏｆＲｕｓｓｉａｎＦｅｄｅｒａｔｉｏｎａｎｄＡｒｍｅｎｉａ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１２ꎬ１(１):１－１１.[２２]ＸｕＬꎬＣａｏＣꎬＹａｎｇＺꎬｅｔａｌ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｓｉｔｅｉｎｔｈｅＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓｐ５４ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｉｔｓｐｒｅｌｉｍｉ￣ｎａｒｙａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎａｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌａｓｓａｙ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ２３(４):ｅ５５.[２３]于浩洋ꎬ王彩霞ꎬ吴绍强ꎬ等.非洲猪瘟病毒ｐ３０蛋白单克隆抗体的制备及阻断ＥＬＩＳＡ检测方法的建立[Ｊ].中国兽医科学ꎬ２０２２ꎬ５２(１):４８－５５.[２４]张冯禧ꎬ肖琦ꎬ朱家平ꎬ等.非洲猪瘟病毒Ｐ３０蛋白单克隆抗体制备㊁鉴定及阻断ＥＬＩＳＡ方法的建立[Ｊ].中国农业科学ꎬ２０２２ꎬ５５(１６):３２５６－３２６６.[２５]齐艳丽ꎬ刘桃雪ꎬ于海深ꎬ等.非洲猪瘟病毒ｐ５４蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定[Ｊ].畜牧兽医学报ꎬ２０２３ꎬ５４(１):２８１－２９２.５４１㊀第１０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀矫健ꎬ等:非洲猪瘟病毒ｐ２２蛋白单克隆抗体的制备及鉴定。
阪崎肠杆菌单克隆抗体的制备与特性鉴定
阪崎肠杆菌单克隆抗体的制备与特性鉴定周鹤峰;邵敏;于立强;葛正龙【期刊名称】《中国免疫学杂志》【年(卷),期】2012(028)009【摘要】目的:制备抗阪崎肠杆菌的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定.方法:采用灭活的阪崎肠杆菌菌体为抗原,免疫BALB/c小鼠,取血清效价高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,mAb亚类检测试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型,通过Western blot和间接ELISA法鉴定该单克隆抗体的特性、效价及mAb相对亲和力.结果:获得2株能稳定分泌抗阪崎肠杆菌mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1H7、2B12,抗体Ig亚类分别为IgG1和IgG2b;交叉反应显示单抗具有良好的特异性;ELISA分析表明制备的单抗效价在1×107~2×107,相对亲和常数达109L/mol,染色体鉴定分别为104和106条,符合杂交瘤细胞的特性.结论:抗阪崎肠杆菌单克隆抗体的成功制备为其快速检测方法的建立奠定了基础.【总页数】4页(P817-820)【作者】周鹤峰;邵敏;于立强;葛正龙【作者单位】遵义医学院珠海校区生物工程系,珠海,519041;遵义医学院珠海校区生物工程系,珠海,519041;山东省烟台第三中学,烟台,264000;遵义医学院生物化学教研室,遵义,563003【正文语种】中文【中图分类】R392.11【相关文献】1.茄科劳尔氏菌单克隆抗体的制备及其特性鉴定 [J], 马兰;王艳;董庆利;刘箐;曾海娟;谢曼曼;胡谦;丁承超;王淑娟;翟绪昭;孙静娟;李杰2.牛骨骼肌肌钙蛋白T单克隆抗体的制备及其特性鉴定 [J], 刘静静; 李玉静; 王振华; 张静; 吴萌; 杜顺丰; 张岩; 李春生3.呋喃西林代谢物单克隆抗体的制备及免疫学特性鉴定 [J], 徐冬梅; 李亚英; 耿海波; 李玉静4.抗O型口蹄疫兔化弱毒YNTBa株单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定 [J], 汤雅淇;李珂;艾军;严红亚;信爱国5.抗人Ig轻链系列单克隆抗体的研制1．抗人λ轻链亚型／亚群单克隆抗体的制备及特性鉴定 [J], 赵蓉;郑志竑;谢捷明;包少佳;吴国华;邱文萱因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
抗百菌清和腐霉利单克隆抗体制备及其特性分析
（Ｒ２＝０．９８２），ＣＴＮ和ＰＲＭ的半数抑制浓度（ＩＣ５０）分别为７９ ｎｇ／ｍＬ和１２５ｎｇ／ｍＬ， 对两种抗原的线性检测范围均为１０ｎｇ／ｍＬ－－－＂１０００ｎｇ／ｍＬ。抗原单独免疫组７号小 鼠的竞争抑制曲线方程为ｖ－－２３．５８ｘ＋９１．９３３，（Ｒ２＝０．９７９），ＣＴＮ的半数抑制浓 度（ＩＣ５０）为５９ｎｇ／ｍＬ，线性检测范围为１０ｎｇ／ｍＬ＂一１０００ｎｇ／ｍＬ：１１号小鼠的竞争抑 制曲线方程为ｖ＝．３１．０８ｘ＋１１９．２７，（Ｒ２ ０．９７６），ＰＲＭ的半数抑制浓度（ＩＣｓｏ）为 ９３ｎｇ／ｍＬ，线性检测范围为１０ｎｇ／ｒＩｌＬ～１０００ｎｇ／ｍＬ。
ｂｏｄｉｅｓ ｂｅｇａｎ ｔＯ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｆｔｅｒ ２５ ｄａｙｓ ｗｈｅｎ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｆｉｒｓｔｌｙ
ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ＥＬＩＳＡ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｒｅａｃｈｅｄ ｔＯ ｌ：１２８００
ｅｃｏｎｏｍｉｃａｌ，ｓｕｉｔａｂｌｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｏｃｈｌｏｒｉｎｅ ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ．
Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ，ｃｈｌｏｒｏｔｈａｌｏｎｉｌ（ＣＴＮ）ａｎｄ ｐｒｏｃｙｍｉｄｏｎｅ（ＰＲＭ）ｏｆ ｏｒｇａｎｏｃｈｌｏｒｉｎｅ ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ ｗｅｒｅ ｔａｋｅｎ ｃｏｕｎｔ ｉｎｔｏ ｓｔｕｄｙ ｂｅｃａｕｓｅ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ．ＣＴＮ ａｎｄ ＰＲＭ ｗｅｒｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｅｄ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｋｅｄ ｔＯ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｎ．Ｎ－ｃａｒｂｏｎｙｌｄｉｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ＣＤＩ）．Ｔｈｅｎ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ＣＴＮ ａｎｄ ＰＲＭ ｗｅｒｅ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｉｍｍｕｎｉｚｅ ｍｉｃｅ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ａｎｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎ ｓｕｃｃｅｓｓｉｏｎ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ．Ａｆｔｅｒｗａｒｄｓ，ａｎｔｉ—ＣＴＮ ａｎｄ ＰＲＭ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｄｅｔａｉｌｅｄ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｓ ａｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｅｄ． １．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ＣＴＮ ａｎｄ ＰＲＭ
伏马毒素B1单克隆抗体的制备及间接竞争ELISA方法的建立
伏马毒素B1单克隆抗体的制备及间接竞争ELISA方法的建立王雨晨;王君;王元凯;严亚贤【摘要】To establish an indirect competitive ELISA for Fumonisin Bi detection, conjugations of KLH-FB1 and OVA-FB1 were synthetized using glutaraldhyde method and they were employed as the coating antigen and immunogen, respectively. 8-week-old Balb/c mouse was immunized by the KLH-FB1 to develop the monoclonal antibody (MAb) using hybridoma technique. After three times of subcloning, two hybridoma cell lines stably secreting specific antibody against FB1 were screened by indirect competitive ELISA. The ascites MAb were purified and characterized by SDS-PAGE. The titre of the MAb reached 1 : 16 000. In addition, the immunological sub-type of the MAb was identified as IgG1 and the its light chain belonged to k type. Aflatoxin B1, Chlorpromazine, streptomycin and Zearalenone showed no cross-activity with the monoclonal antibody. Indirect competitive ELISA (IC-ELISA) was established based on the specific antibody against FB1. The sensitivity of IC-ELISA was 0.44 ng/mL and the liner range was 0. 93～73. 06 ng/mL. The method was used to detect FB1 in spiked samples and the recoveries were 78.4％～102％ in the detection range.%采用戊二醛法将半抗原伏马毒素B1分别与载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)和蛋白卵清白蛋白(OVA)偶联成为完全抗原KLH-FB1和OVA-FB1.OVA-FB1作为包被抗原建立ELISA方法;KLH-FB1作为免疫原免疫8周龄Balb/c小鼠,应用杂交瘤细胞融合技术制备单克隆抗体.经三次亚克隆后,筛选出两株(6H3,6H11)能特异、稳定分泌抗FB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株.选择其中一株杂交瘤细胞通过体内诱生腹水的方法制备单克隆抗体,经检测表明单克隆抗体的亚型为IgGl,轻链为k型.采用间接ELISA测得腹水纯化后效价达1:16000,抗体对伏马毒素的半数阻断浓度(IC50)为8.26ng/mL,对玉米赤霉烯酮、黄曲霉素B1等结构类似物几乎不存在交叉反应,与其他结构的氯丙嗪、链霉素等无交叉反应.利用获得的抗FB1单克隆抗体,建立了间接竞争ELISA检测方法,检测灵敏度为0.44 ng/mL,检测线性范围为0.93～73.06 ng/mL,加标回收率在线性范围内达到回收率可达78.4%～102%.【期刊名称】《上海交通大学学报（农业科学版）》【年(卷),期】2011(029)002【总页数】6页(P69-74)【关键词】伏马毒素B1;半抗原;单克隆抗体;间接竞争ELISA【作者】王雨晨;王君;王元凯;严亚贤【作者单位】上海交通大学农业与生物学院,上海市兽医生物技术重点实验室,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海市兽医生物技术重点实验室,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海市兽医生物技术重点实验室,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海市兽医生物技术重点实验室,上海200240【正文语种】中文【中图分类】R379伏马毒素(Fumonisins)是由串珠镰刀菌产生的真菌毒素,目前已知有28种衍生物,分为A、B、C、P四类。
猪脑心肌炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定的开题报告
猪脑心肌炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定的开题报告一、研究背景和意义猪脑心肌炎病毒（Porcine Encephalomyocarditis Virus，PEMCV）是一种单链RNA病毒，能够感染多种动物，包括猪、鼠、猫、狗等。
该病毒感染猪会导致猪脑心肌炎，并对养殖业产生严重的经济损失。
目前，PEMCV疫情在全球范围内有发生，尤其在中国、越南等亚洲国家增加了对PEMCV的研究和防控的需求。
因此，开展PEMCV病毒学研究和制备PEMCV抗体具有重要的科学和实际应用价值。
其中，VP1蛋白是PEMCV病毒的主要结构蛋白，作为制备PEMCV病毒抗体的重要靶标，具有研究和生产应用的意义。
本课题计划制备猪脑心肌炎病毒VP1蛋白的单克隆抗体，并对其进行鉴定与评价。
二、研究内容和方案1. 研究内容本课题的主要研究内容包括：（1）选择并克隆PEMCV VP1基因，将其表达为重组蛋白，获取目标蛋白。
（2）将免疫原与佐剂混合，注射至小鼠体内，免疫小鼠，制备免疫小鼠的多克隆抗体，并筛选出与VP1蛋白有很高亲和力的抗体。
（3）通过反复克隆，获得单一克隆细胞系，并结合酶联免疫吸附实验或Western blotting等技术，对其鉴定及评价。
2. 研究方案（1）基因表达载体构建：将PEMCV VP1基因扩增，并克隆入表达载体，再进行大规模表达和纯化，得到VP1蛋白。
（2）小鼠免疫及多克隆抗体制备：将VP1蛋白及佐剂混合后，注射至BALB/c小鼠体内，以实现多克隆抗体的制备。
（3）ELISA筛选抗体：用细胞匀浆蛋白、大肠杆菌蛋白与VP1蛋白分别涂釉酶标记板上，以筛选出与VP1蛋白有很高亲和力的抗体。
并通过Western blotting等技术鉴定其特异性。
（4）单克隆抗体制备：通过抗体蓝细胞瘤（Hybridoma）技术，筛选出与VP1蛋白有很高亲和力的单克隆细胞系。
（5）抗体评价：对所得到的VP1单克隆抗体进行鉴定与评价，包括对其亲和力、特异性、稳定性等的检测。
抗人羧酸酯酶1多克隆抗体的制备与鉴定
抗人羧酸酯酶1多克隆抗体的制备与鉴定于梅;路胜;刘红【期刊名称】《黑龙江医药》【年(卷),期】2011(024)004【摘要】目的:制备兔抗人羧酸酯酶1(CES1)多克隆抗体,并对其特性进行初步鉴定.方法:重组表达蛋白,免疫动物制备人羧酸酯酶1的多克隆抗体,辛酸-硫酸铵法纯化抗体,对纯化的抗体进行EUSA、Western Blotting和免疫组化鉴定.结果:获得抗人羧酸酯酶1多克隆抗体.该抗体效价为1:64 000;Westem Blotting分析该抗体可在预期位置36 kDa识别免疫原GST-CES1,在天然蛋白62 kDa所对应的位置出现明显且单一的条带,与预期的天然CES1蛋白分子量一致,表明纯化的抗体可识别正常肝脏的CES1;免疫组织化学显示该抗体与肝细胞细胞浆内蛋白有特异的弥漫性结合,但与血管平滑肌细胞细胞浆无特异性结合.结论:制备出了效价高、特异性良好的兔抗人羧酸酯酶1多克隆抗体,制备的兔抗人羧酸酯酶1多克隆抗体可应用于EUSA、Western Blotting、免疫组化等实验.【总页数】3页(P573-575)【作者】于梅;路胜;刘红【作者单位】哈药集团生物工程有限公司;哈药集团生物工程有限公司;哈药集团生物工程有限公司【正文语种】中文【中图分类】R392.11【相关文献】1.兔抗人β2糖蛋白Ⅰ多克隆抗体的制备与鉴定 [J], 黄宏亮;周红;俞颖;李娜;石文霞;王婷;王海波2.兔抗人RBBP10多克隆抗体的制备与鉴定 [J], 李侃;刘华;张道明;郑小娟3.兔抗人热激蛋白70样蛋白1多克隆抗体的制备与初步鉴定 [J], 杨秉芬;李平;李娟;瞿秀华;李晓明;柳晓兰;孙启鸿;曹诚4.兔抗人多发性骨髓瘤细胞多克隆抗体的制备与鉴定 [J], 母波;赵春艳;梁素华;章欢;申跃武;陈保峰;杨俊宝5.大鼠抗人β-catenin多克隆抗体的制备与鉴定 [J], 牛夏忆; 李淼; 张倩; 陈云雨; 刘晓平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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［ 关键 词 ］ 马 立 克 氏病 病 毒 ；Ｖ Ｐ ２ ２羧 基 端 ；单 克 隆 抗体 ；
特 性 鉴 定
［ 中图分类号 ］ Ｒ ３ ９ ２ ． １ １
［ 文献标识码 ］ Ａ
ＭＥ Ｔ Ｈ ＯＤ Ｓ：Ｃ ａ ｒ ｂ ｏ ｘ ｙ ｌ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ｕ ｓ Ｏ ｆ ＣＶ Ｉ ９ ８ ８ Ｖ Ｐ ２ ２ （ ９ ４ ａ ａ～
２ ４ ３ ａ ａ ）ｗ ａ ｓ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｅ ｄ ｉ ｎ ｐ ｒ ｏ ｋ ａ ｒ ｙ ｏ ｔ ｉ ｃ ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ．ｍＡ ｂ ｓ ａ ｇ ａ ｉ ｎ ｓ ｔ
Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎａ ｒ ｙ Ｍ ｅ ｄ ｃ ｉ ｎ ｅ， Ｙａ ｎ ｇ ｚ ｈｏ ｕ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ， Ｙａ ｎ ｇ ｚ ｈｏ ｕ ２ ２５ ０ ０９， Ｃｈｉ ｎ ａ
ｍ Ａ ｂ呈现整个 单 层 的细胞 核荧 光。Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 和 Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ 分
达产物 Ｇ Ｓ Ｔ — Ｖ Ｐ ２ ２ Ｃ 。将该表达产 物切胶 免疫小 鼠 ， 利用 杂交
瘤 技术 制备抗 ＭＤ Ｖ 一 １ Ｖ Ｐ ２ ２ Ｃ的 ｍ Ａ ｂ ， 并通过 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ、间接免 疫荧光 （ Ｉ Ｆ Ａ） 、Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ 鉴定其 特性 。结果 ：获得 了 ２株 ３ Ｆ ７ 、 ４ Ｅ ４ 。Ｉ Ｆ Ａ鉴定 表明 ， 两株 ｍ Ａ ｂ均能与感染 ＭＤ Ｖ 一 １的成 纤 维细胞反应 ， 其 中，３ Ｆ ７ ｍ Ａ ｂ染色 呈现 ＭＤ Ｖ空斑 ，而 ４ Ｅ ４
抗 ＭＤ Ｖ ． １ Ｖ Ｐ ２ ２羧 基 端 单克 隆抗 体 的 制备 与 免疫 学 特性 鉴定
宋翠 萍 ，陈鸿 军 ， 秦 爱建 ，张晨 飞 （ 扬州大学兽医学院 江苏省动物预防医学重点实验室， 江苏 扬州 ２ ２ ５ ０ ０ ９ ）
Ｐｒ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｉ ｍｍ ｕ ｎｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｈａ ｒ ａ ｃ － ｔ ｅ ｒ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｍｏ ｎ ｏ ｃ ｌ ｏ ｎａ ｌ ａ ｎｔ ｉ ｂｏ ｄ ｉ ｅ ｓ
维普资讯
Ｉ Ｓ Ｓ Ｎ １ ０ ０ ７— ８ ７ ３ ８细胞 与 分 子 免疫 学 杂 志 （ Ｃ ｈ ｉ ｎ Ｊ Ｃ ｅ ｌ ｌ Ｍｏ ｌ Ｉ ｍｍ ｕ ｎ ｏ １ ） ２ ０ ０ ７ ， ２ ３ （ ３
２ ４ ９
・
论Hale Waihona Puke ・ 文 章编 号 ：１ ０ ０ ７— ８ ７ ３ ８ （ ２ ０ ０ ７ ） ０ ３— ０ ２ ４ ９— ０ ４
Ｓ Ｏ Ｎ Ｇ Ｃ ｕ ｉ － ｐ ｉ ｎ ｇ， Ｃ Ｈ Ｅ ＮＨ ｏ ｎ ｇ － ｊ ｕ ｎ ， Ｑ Ｉ ＮＡ ｉ － ｊ ｉ ０ ｎ ， Ｚ Ｈ Ａ Ｎ Ｇ Ｃ ｈ ｅ ｎ － ｆ ｅ ｉ
Ｋｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｆ Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｓ ｕ Ｐ ｒ ｅ ｖ ｅ ｎ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ， Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ
析表 明 ， ３ Ｆ ７能与杆状病毒表达 的 Ｖ Ｐ ２ ２反应 ， ４ Ｅ ４不具备该 特性 。对 ３ Ｆ ７ ｍ Ａ ｂ进一步鉴定 ， 确定了该 ｍ Ａｂ针对的具体位
置在 ９ ４～１ ９ ３ ａ ａ处 ， 是蛋 白转导域 的预测位置。结论 ： 成功地 制备 了抗 ＭＤ Ｖ 一 １ Ｖ Ｐ ２ ２ Ｃ的 ｍ Ａ ｂ ，为深 入研 究 Ｖ Ｐ ２ ２蛋 白的转 导功能提供 了有用 的试剂 。
ａ ｇ ａ ｉ ｎ ｓ ｔ ＶＰ２ ２ ｃ ａ ｒ ｂｏ ｘ ｙ ｌ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎｕ ｓ ｏ ｆ 可稳定 分泌抗 ＭＤ Ｖ 一 １ Ｖ Ｐ ２ ２ Ｃ的 ｍＡ ｂ的杂交 瘤细胞 ，命名 为 Ｍａ ｒ ｅ ｋ’ Ｓ ｄ ｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｓ ｅ ｒ ｏ ｔ ｙ ｐｅ １
ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｚ ｅ ｄ ｂ ｙ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ，ｉ ｎ ｄ ｉ ｒ ｅ ｃ ｔ ｆ ｌ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｓ ｓ ａ ｙ（ Ｉ Ｆ Ａ）
ＶＰ ２ ２ ｗｅ ｒ ｅ ｐ ｒ ｅ ｐ ａｒ ｅ ｄ ｂ ｙ ｈ ｙ ｂ ｒ ｉ ｄ ｏｍａ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｆ ｒ ０ ｍ ＢＡＬ Ｂ ／ ｃ ｍｉ ｃ ｅ ｉ ｍｍｕ ｎ ｉ ｚ ｅ ｄ ｗｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ ｆ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ＧＳ Ｔ— ＶＰ ２ ２ Ｃ ａ ｎ ｄ
［ Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］ Ａ Ｉ ￣ Ｉ ：Ｔ ０ ｐ ｒ ｅ ｐ ａ ｒ ｅ ａ ｎ ｄ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｚ ｅ ｍ ｏ ｎ ｏ —
ｃ ｌ ｏ ｎ ａ ｌ ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｉ ｅ ｓ（ ｍＡ ｂ ）ａ ｇ ａ ｉ ｎ ｓ ｔ Ｖ Ｐ ２ ２ ｃ ａ ｒ ｏｘ ｂ ｙ ｌ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ｕ ｓ ｏ ｆ
血 清 Ｉ型 马立 克 氏病病 毒 （ Ｍａ ｒ ｅ ｋ ’ ｓ ｄ ｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｓ ｅ ｒ ｏ ｔ ｙ ｐ ｅ １ ，ＭＤ Ｖ 一 １ ）的 Ｖ Ｐ ２ ２由 Ｙ ａ ｎ ａ ｇ ｉ ｄ ａ等 从
Ｍ Ｄ Ｖ 一 １ Ｇ Ａ株 的一段长 为 ８ ． ４ ｋ ｂ的 Ｂ ａ ｍＨ Ｉ — Ｅ ｃ ｏ Ｒ Ｉ