第6章 克隆策略

2)cDNA (cDNA library) ：
• 是指将某种生物体基因组转录的全部 mRNA经反转录产生的cDNA片段分别 与克隆载体重组，储存于某种受体ry DNA，互补DNA)： 是由生物的某一特定器官或特定发育时 期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的 互补DNA。
目的基因的一个主要困难。
高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在 一定时间阶段的单个细胞或个体中，仅有15%左右的 基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。 可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比
直接从基因细胞总RNA的提取和mRNA的分离 第一条cDNA合成 第二条cDNA合成 双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载 体并的保存
1) 影印膜滤保存法Leabharlann 2）在液体培养基中扩增保存
方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆 子转入含适当的抗生素培养基中，混 合的细菌生长数代后，其培养物于-70 oC储的序列过多或过少。
• 免疫筛选法：利用多肽等作为抗原进行原位杂 交筛选 • PCR筛选法：根据保守序列合成引物，，其复杂程度是 蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复 序列。 采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离 到目的基因。这是从染色体DNA为出发材料直接克隆
a）质粒载体可承载15kb DNA左右片段 (有效的范
围为<10kb)
b）载体可承载25kb DNA左右片段(有效的范围为
15 kb) c）Cosmid 载体可承载45kb DNA左右片段(有效 的范围为<40 kb)
（四）重组ＤＮＡ转化受体细胞
１、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞 常见的宿主细胞： DH5: 用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷型的抑 制型菌株，可与pUC编码的－半乳糖苷酶氨基端实现互补。 HB101: 用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高
3) 保存单个克隆子于含有甘油的培养基 中
方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合 适的含抗生素的培养基中，菌体生 长到一定浓度后，加入终浓度为25% 的甘油，于-70 oC或-25 oC下保存。 缺点：需保存的于鉴别，如互补筛选 • 抗性筛选法：如二氢叶酸还原酶可以使三甲苄 二氨嘧啶降解，而该化学物可抑制大肠杆照外源DNA片段的来源：
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•
从特定组织提---cDNA 用于基因克隆的DNA材料的选择：
• 如果研究的目标是弄清一种蛋白质的氨基酸顺序，可以根据克隆 的cDNA分子的核苷酸序列的结构直接推导出来； • 如果要研究的是控制基因表达活动的调控序列，或是在mRNA中 不存在的某种特定序列，有关这类的信息就只能从染色体基因组
• 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆 排序
• 克隆片段易于从载体分子上完整卸下
• 重组克隆能稳定②高纯度基因组 DNA的提取和大片段的制 备； ③高纯度基因组 DNA的部分酶切与脉冲电 泳分级分离； ④载体与外源片段的连接与转化或侵染 宿主细胞；
cDNA
基因重组
1 细胞总RNA的提取和mRNA的分离
• 通常用于构建cDNA的是真核细胞的 mRNA，由于cDNA从mRNA合成而来， 代表了基因组的可转录部分，不含内含子 序列，因此可被用于在大肠杆菌中表达编 码蛋白。 • 由于每类细胞和组织只表达一套特定的基 因，因此从特定组织中制备的mRNA通 常会富集某些特异序列。所以起始材料的 选择十分重要。
转导（Transduction）
• 转导是指通过病毒将一个宿主的DNA转 移到另一个宿主的细胞中而引起的基因 重组现象。如果供体DNA未与受体DNA 发生重组则称此转导过程为流产转导 （Abortive transduction）。
• 转导这个概念有3个关键词：病毒、宿主DNA、整合 （integrate）。首先，转导一般用于描述通过病毒 而发生的基因转移；其次，转移的必须是宿主的DNA， 病毒感染的时候，不少病毒DNA都可能整合到受体基 因组，如果没有病毒以外的宿主DNA，这个过程就不 能叫做转导。自然情况下，一些病毒与宿主DNA发生 重组，形成新的病毒基因组，包装以后感染其他细胞， 就产生转导。实验研究中，常用基因重组的办法把目 的DNA插入病毒基因组，实现目的基因的转导。最后， 这个DNA必须整合到新宿主细胞基因组才算实现转导。
3）多聚核糖体免疫学纯化法
*
使用抗体来纯化合成目的多肽的多聚核糖体。将
正在合成的新生多肽链的多聚核糖体结合到免疫亲和 柱（A蛋白-Sepharose柱）上，随后用EDTA将多
聚核糖体解离下来，并通过Oligo(dT)层析分离
mRNA, 利用该方法可将目的mRNA纯化数千倍. 目 的mRNA在细胞中的含量可为数十拷贝.
1、mRNA的制备: 动物细胞或植物细胞mRNA的制备 2、mRNA的来源: 选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物 等方法提高mRNA的含量。 3、mRNA完整性的检测 1)mRNA分子的大小： 哺乳动物mRNA长度 为500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb 之间. 2)总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的
JM101: 可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌 JM109: 支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌
MZ-1: 温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体ＰＬ启动子质粒载 体的宿主菌
２、重组质粒转化受体细胞 1）转化法(transformation) 2）转导法(transduction)
3）转染法(transfection)
DNA中获得。
基因组DNA
限制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因1)基因组•(Genomic library)
：
是指将某种生物体的全部基因组DNA用 限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围 的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并 转化相应的宿主细胞获得的所某种生物的全部 基因。
转染（Transfection）
• 对于真核生物，转染就是原核生物中转 化的同义词。之所以在真核生物中使用 转染这个词来代替转化，是因为人们之 前已经习惯了用转化这个词表示真核细 胞变为恶性细胞。 • 原核生物中，偶尔也用到转染这个词， 当细菌的转化过程中吸收的外源DNA是 病毒DNA时就应该称此过程为转染。
1) 按大小对mRNA进行分级分离
* 通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分子，该 方法的分离效果最好，但从凝胶中回收的得率较低.
* 蔗糖梯度离心：加入破坏RNA二级结构的变 性剂，再进行蔗糖梯度离心以分离不同分子量mRNA.
2) cDNA的分级分离
* mRNA通过反转录形成cDNA，在插入到克隆 载体前，通过琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的cDNA 分子分离开来。 * 优 点： a）避免了分离过程中mRNA被污染的 RNA酶降解 b）增加了获得全长cDNA克隆的概率 c）获得更准确的分
基因重组
体外包装
的提取
染色体DNA
质粒DNA
要求：制备的DNA的长度为100-200kb，
防止在制备过程中的机械断裂
（二）基因组DNA的不完全酶切
1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶 a) 四个识别位点的限制酶出现的几率: 1/256 b) 六个识别位点的限制酶出现的几率: 1/1024 2、分离目的酶切片段大小的确定 a) 克隆单个基因：< 10 kb
b) 克隆基因族：< 20kb
3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量
DNA的不完全酶切
（三）酶切片段与克隆载体连接
１、酶切片段的分离与纯化 １）低熔点琼脂糖回收目的片段 ２）试剂盒回收目的片段
2、酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择
能力
4、mRNA在细胞中的丰度
1) 高丰度mRNA
目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总 mRNA量的50-90%, 该类mRNA在合成和克隆 cDNA之前不需进一步纯化特定mRNA 。
2) 低丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总 mRNA量的0.5%以下。
5、mRNA的富集方法
典型的哺乳动物细胞含有10,00030,000种不同的mRNA分子,某些mRNA 分子在细胞内的拷贝数很低甚片段与适当的载体在体外 重组后，转化宿主细胞，并通过一定的 选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或 噬菌体)，因组DNA，制备合适 大小的DNA片段，或提取组织或器官的 mRNA并反转录成cDNA； • 2) DNA片段或cDNA片段与经特殊处 理的载体连接形成重组DNA； • 3)重组DNA转化宿主细胞或体外包装后 侵染受体菌； • 4)阳性重组菌落或噬菌斑的选择。
转化（Transformation）
• 原核生物的转化定义中，关键词是free DNA，也 就是说，是裸DNA本身，不是通过其他媒介（如病 毒）转移到原核生物里面。现在说到转化，一般都 是指实验室内从细菌里面纯化的DNA分子直接导入 遗传性状相异的细菌，比如质粒转化，所用的是纯 化的质粒DNA本身，没有任何媒介帮助。从这个概 念的内涵来说，只要DNA进入细菌，就完成了转化 过程，所以这里不涉及转化的DNA是否复制，是否 改变细菌的遗传性状以及蛋白是否表达等，虽然转 化是否成功，多半只能通过DNA是否改变细菌的遗 传性状来实现。
• 为了解决这个难题，一种可行的方法就是将 这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可 能性。但是由于要分离的目的基因往往是未 知基因，因此无法对它进行特异性扩增，而 只能对所有的基出来，第六章
克节 基因克隆的筛选策略
前言
• 外源基因：插入到载体内的那个特定
的片段基因。
• 目的基因：那些已被或者准备要分离、
改造、扩增或表达的特定基因或DNA片
段。
• 对于高等真核生物而言，基因组DNA十分 庞大,基因可达数万个，且基因组成结构 复杂，除编码序列，还有非编码序列及 调控序列，基因间还存在大量的间隔序 列和重复序列，因此，单个目的基因在 整个基因组中所占的比例极其微小，除 少数例外，绝大多数基因难以直接过大，以减轻筛选工作的压力 • 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆