第二章 工具酶

• 人工设计识别特异DNA序列的α螺 旋，采用如上的通用序列，通过改 变其中7个X来实现识别不同的三联 体碱基； • TGEK是多个螺旋间的连接序列； • 人工锌指结构域和FokI融合蛋白 （ZFN）可以在指定区域切断DNA 双链； • 构建成对ZFN。
FokI: type II restriction endonuclease
5’ C T T A G
G A G G C 3’
5’
Nick
3’ G A A T C T A C T C C G 5’ C T T A G
OH3’ 5’P
A G G C 3’
5’
Gap
3’ G A A T C T A C T C C G
3、碱性磷酸酶
可以催化切除DNA、RNA和dNTP上的5’ 磷酸基团 用途
• 从DNA片段除去 5’ 磷酸以防自身连接
• 制备5’ 末端核酸探针
5’
T A T A G C A T A T T A T A C G T A T A
3’
5’
去除DNA末端5’ 磷酸基团
Recessed 3’ hydroxyl group
Overhanging 5’ phosphate group extension
2、酶切末端类型
平齐末端
5’ 粘性末端
粘末端
3’ 粘性末端
平齐末端（blunt end）:
在识别序列的对称轴上对双链DNA进行切 割，末端平齐。
+
粘末端（cohesive end or sticky end )
在识别序列对称轴的相应位点切割，产生一个 单链延伸的粘性末端。
EcoR I
5’----G
指来源不同但识别相同序列的酶。该类 酶切割DNA的位点相同，但切割后产生的末端 可能不同。如：
5′GGTAC C 3′ KpnI 3′C CATGG 5′ 5′GGTAC 3′Cp + pC3′ CATGG5′
5′G GTACC 3′ Asp718I 3′CCATG G 5′
5′G pGTACC3′ 3′CCATGp + G5′
Klenow片段
从大肠杆菌DNA聚合酶I全酶中除去 3′ 5′外切酶活性片段
大肠杆菌DNA聚合酶I全酶
Klenow fragment (68 kD)
N exonuclease 5’ 3’ proofreading polymerase site catalytic
small fragment (35 kD) C C exonuclease 5’ 3’
2. RE的分类及特点
• I 型限制性核酸内切酶 • II 型限制性核酸内切酶 • III 型限制性核酸内切酶
I 型限制酶
复合功能酶，具有多种功能 在DNA链上的识别和切割位点不一致 没有固定的切割位点，在距识别位点1至
几个kb处随机切割
不产特异末端
III 型限制性酶
属于复合功能酶
• 用于DNA3’端标记——TUNEL凋亡检测
重组人工粘性末端
锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases）
锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内 切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。
• Cys2–His2锌指结构域是真核生物中最 常见的一种DNA结合基序，在人类基 因组中也是编码频次排名第2的蛋白结 构域； • 一个锌指大约由30个氨基酸组成，形 成了一种保守的ββɑ结构，其中每一个 α螺旋可以特异识别3-4个碱基；
《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
• 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs》 《Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs》
3’----CTTAAp5’
+
5’pAATTC---3’
G---5’
5’ 粘性末端
EcoR I
5’----CTGCAOH3’
PstI
5’ G---3’ 3’HOACGTC---5’
3’----G5’
+
3’ 粘性末端
3、几类特殊的II型限制性酶
异源同工酶
同尾酶
远距离裂解酶 可变酶
异源同工酶
特点：在距识别位点约25bp处切割
DNA，切割位点难以预测。
II 型限制性酶
1、特点
• 功能特点 识别和切割双链DNA的特定序列，产生特定
的DNA末端。
EcoRI GAATTC HindIII AAGCTT •
识别序列特点 识别序列一般在4～6个碱基对，通常为
反转互补序列，即具180°旋转对称性（又称回文结构）
第二章 工具酶

限制性核酸内切酶 其他重要的核酸酶


ZFN: Zinc-finger nucleases
TALEN: transcription activator-like (TAL) effector nucleases
Ⅰ 工具酶的功能分类：

限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 是一类能识别和切割双链DNA分子中特定 碱基顺序的核酸酶，简称限制酶。
应用
构建cDNA文库；反转录PCR（RT-PCR)
逆转录过程
2、DNA连接酶
将两段DNA分子拼接起来的酶。
主要有T4 DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶 概念区分： 切口（nick）指DNA分子糖-磷酸主链的破坏
缺口（gap） DNA分子核苷酸缺失，单独 用DNA连接酶不能连接。
N N N N N N C T A G
G A T CN N N N N N
远距离裂解酶
这类酶的识别与切割位点不一致，但其切割 位点和识别位点的距离是一定的，一般为10个碱 基左右。 MboII GAAGANNNNNNNN
可变酶
II类酶中一个特例，他的识别序列中有一个 或几个核苷酸是可变的，且识别序列一般大于 6个 碱基对。
• 核酸修饰酶 (modification nuclease) 对宿主DNA进行限制性修饰，防止DNA被 降解。
Ⅱ 限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease，RE）
1. 命名原则: EcoRI 限制酶的第一个字母（大写），代表产生该酶的 微生物（宿主菌）属名；第二、三个字母（小写， 斜体）代表微生物种名；第四个字母（斜体）代表 菌的株或型；如该菌产生几种限制酶，根据发现和 分离的顺序用罗马字母代表。 如大肠杆菌R菌株 EcoRI 和EcoRⅡ
BstpI
GGTNACC
Bgl I GCC（N）4GGC
4、影响II 型限制性酶作用的因素
离子强度、pH的影响
如 MgCl2由5mM EcoRI EcoRI* 2mM (pH8.5)酶对底物识别专一性降低 GAATTC NAATTN
某些试剂可改变酶的专一性 如疏水试剂甘油，二甲基亚砜存在时，会使BamH I的识别 和切割特异性发生改变。 酶量的影响 酶解温度和时间 过量会影响酶的识别顺序
• 34aa中的第12和13个氨基酸（Repeat Variant Di-residue, RVD) 对应识别一个目标碱基
2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》 • 一篇大鼠
TALEN 基因敲除
TALEN (TALE+FOK I) 表达质粒对 TALEN 表达质粒对转染、表达 切割靶位点 切割诱发DNA损伤修复机制 （nonhomologous end-joining， NHEJ）。由于在此修过程中总是 有一定的错误率存在。在修复中发 生移码突变错误的个体即形成目标 基因敲除突变体
5mmol/L MgCl2
2mmol/L MgCl2
Ⅲ 其他重要的工具酶
DNA聚合酶 DNA连接酶 碱性磷酸酶
S1核酸酶-单链核酸内切酶
末端脱氧核糖核苷酸转移酶
1、DNA聚合酶
特点：能够把脱氧核糖核苷酸连续的加 到双链DNA分子引物链的3′-OH末端， 催化核苷酸的聚合作用。 常用DNA聚合酶
同尾酶 识别与切割顺序相互有关的酶。来源 各异，识别序列也各不相同，但作用后产 生相同的粘性末端。
BamHI
N N G N N C C T A G
G A T C C N N N G N N N
BglII
N N A N N T C T A G
G A T C T N N N A N N N
Sau 3A
在线靶点选择设计软件：https://boglab.plp.iastate.edu/node/add/talefoff/
TALE识别模块串联构建
• TAL的核酸识别单元
为34aa模块中的双连 氨基酸（RVD） • RVD与A、G、C、T 有恒定的对应关系， 即NI识别A，NG识别T， HD识别C，NN识别G， 非常简单明确 • 欲使TALEN特异识 别某一核酸序列（靶 点），只须按照靶点 序列将相应TAL单元 （14 -18个）串联克 隆即可。
T A
T A
G C
T
T
A
A
A
A
T
T
C G
T A
T A
HO
去除DNA片段 5’ 末端磷酸
以防自身连接
4、末端脱氧核糖核苷酸转移酶 （Terminal deoxynuclotidyl transferase) 催化dNTP加到DNA分子的3’-OH末端，
带3’突出的DNA为最佳受体。
应用
• 重组人工粘性末端；
TALEN表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别 靶点核酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除 的过程。
TALEN技术发展
• 1989年，植物病原体黄单胞菌属 （Xanthomonas spp.）avrBs3 基 因被克隆。 • 2007年 发现其序列特异性核酸结合特性， avrBs3 - TA • 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译 • 17 -18个34aa重复序列
大肠杆菌大聚合酶I及其Klenow片段 TaqDNA聚合酶
逆转录酶
大肠杆菌聚合酶I及其Klenow片段
大肠杆菌wk.baidu.com合酶I
5′3′DNA聚合酶活性，使DNA链 沿5′3′延伸 3′5′外切酶活性，能从游离的3’-OH端逐个降解 双链或单链DNA核苷酸成为单核苷酸 5′3′外切酶活性，能从游离的5′端降解双链 DNA成为单核苷酸
ZFN 技术
研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑，比如基因敲除。 已建立有ZFN库，识别多种DNA序列，但还不能达到识别任意 靶DNA的目的，其应用受到一定的限制。
锌指核酸酶介导的定向染色体删除
ZFN off-targeting 原因
transcription activator-like (TAL) effector nucleases:TALEN
Taq DNA聚合酶
是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，
最佳作用温度位70～80℃，也具有5′3′外
切酶活性
可用于 聚合酶链式反应（PCR）；
DNA测序
逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶，RDDP）
多功能：
以RNA为模板5′3′方向DNA聚合酶活性；以 mRNA为模板催化合成互补的DNA，称为cDNA
TAL 靶点识别模块
FokI
X2
TALEN靶向（基因敲除）技术基本流程
1. 选择、确定靶点 2. TALE识别模块串联构建
X2
3. TALEN真核表达质粒构建
X2
4. TALEN真核表达质粒转入细 胞，表达TALEN重组蛋白
X2
5. 检测突变效率，筛选（移码） 突变体
Mut
选择确定TALE靶点
靶点的DNA序列特征： 相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点
参考文献：Cermak et al., Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting,
Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 12, e82.