第二章 工具酶
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基因工程-2-工具酶
1.制备DNA分子杂交探针(缺口平移Nick translation)
5‘ (a) 3’ 5‘ 3‘ 5’ 3‘
(a)DNaseI处理双链的DNA 分子
(b)带有3’-OH末端的单链缺口 (c) polⅠ从5‘-P移去一个核 苷酸 (d) polⅠ将32P标记的核苷 酸参入取代被移去的核苷酸 (e)重复(c)(d)的步骤，缺口 沿5’-3‘方向移动，形成32P标记 的核苷酸合成的DNA链
HindⅢ Bacillus amyloliquefaciens H
BamHⅠ
Escherichia coli R质粒
EcoRⅠ
六、限制内切酶的反应体系
DNA 1μ l(1μ g)
buffer(10×)
ddH2O 限制性内切酶 总体积
2μ l
16μ l 1μ l(1u) 20μ l
A）确定酶切DNA的量
100～200 units
up to 20 μl
70℃保温15分钟后冰上冷却，得到第一链cDNA。
4个 6个
44 =256
λDNA 49Kb
46=4096
48 =65536
12位点。 Bgl II 6个；BamH I 5个；Sal I 2个。
三、II型限制性内切酶切割类型
1、平齐末端（Blunt end）
Hind II 切割反应
Sma I 切割反应
2、粘性末端（Sticky end） 2.1 产生5’粘性末端
(b) (c)
3’
5‘ 3’ 5‘
5’
3‘ 5’ 3‘ 5’
(d)
3’
* *** ****
5‘ (e) 3’
3‘ 5’
五、DNA聚合酶的应用
2.制备DNA分子杂交探针(随机引物法)
5‘ (a) 3’ 5‘ 3‘ 5’ 3‘
(a)DNaseI处理双链的DNA 分子
(b)带有3’-OH末端的单链缺口 (c) polⅠ从5‘-P移去一个核 苷酸 (d) polⅠ将32P标记的核苷 酸参入取代被移去的核苷酸 (e)重复(c)(d)的步骤，缺口 沿5’-3‘方向移动，形成32P标记 的核苷酸合成的DNA链
HindⅢ Bacillus amyloliquefaciens H
BamHⅠ
Escherichia coli R质粒
EcoRⅠ
六、限制内切酶的反应体系
DNA 1μ l(1μ g)
buffer(10×)
ddH2O 限制性内切酶 总体积
2μ l
16μ l 1μ l(1u) 20μ l
A）确定酶切DNA的量
100～200 units
up to 20 μl
70℃保温15分钟后冰上冷却，得到第一链cDNA。
4个 6个
44 =256
λDNA 49Kb
46=4096
48 =65536
12位点。 Bgl II 6个；BamH I 5个；Sal I 2个。
三、II型限制性内切酶切割类型
1、平齐末端（Blunt end）
Hind II 切割反应
Sma I 切割反应
2、粘性末端（Sticky end） 2.1 产生5’粘性末端
(b) (c)
3’
5‘ 3’ 5‘
5’
3‘ 5’ 3‘ 5’
(d)
3’
* *** ****
5‘ (e) 3’
3‘ 5’
五、DNA聚合酶的应用
2.制备DNA分子杂交探针(随机引物法)
第二章(生物工具酶)
• • • • 如EcoRI
切割位点
5’-----NGAATTCN-----------3’ 3’-----NCTTAAGN-----------5’
对称轴
↓
↑
II型限制性内切酶的切割方式
三种切割方式：按切割位点相对于二重对称轴的位置来区分
，
一种是在对称轴5’侧切割产生5’粘端，
5’----NG↓AATTCN----3’ EcoRI 5’----NG
• • 限制性内切核酸酶
用
的
主 要
工
功
具
能
酶
在DNA分子内部的特异性的 碱基序列内部进行切割
restriction endonucleases
•
• • • • • • • • • • •
DNA连接酶
DNA ligase DNA聚合酶I DNA polymerase I 多核苷酸激酶 DNA polymerase kinease 反转录酶 reverse transcriptase DNA末端转移酶 DNA terminal Deoxynuc leatidy transferase
•
•
异常： 酶切产物能电脉鉴定出现的 DNA条带数比正常情况下有增加。
产生星号活性的因素有多种 ------主要的原因
： 甘油浓度过高：是引起星号活性的常见原因(在限 (1)
制性内切酶的浓度与DNA数量的比值为50u/ugDNA时，甘油的含量 为7.5％（v/v）便能引起星号活性。当应用酶浓度较低微10u/ugDNA时 ， 甘油含量高于15％（v/v）或以上也会引起星号反应)。
endonuclese R,其后再加上述已说明的名称， 如写为endonuclese R.HindIII。
切割位点
5’-----NGAATTCN-----------3’ 3’-----NCTTAAGN-----------5’
对称轴
↓
↑
II型限制性内切酶的切割方式
三种切割方式：按切割位点相对于二重对称轴的位置来区分
，
一种是在对称轴5’侧切割产生5’粘端，
5’----NG↓AATTCN----3’ EcoRI 5’----NG
• • 限制性内切核酸酶
用
的
主 要
工
功
具
能
酶
在DNA分子内部的特异性的 碱基序列内部进行切割
restriction endonucleases
•
• • • • • • • • • • •
DNA连接酶
DNA ligase DNA聚合酶I DNA polymerase I 多核苷酸激酶 DNA polymerase kinease 反转录酶 reverse transcriptase DNA末端转移酶 DNA terminal Deoxynuc leatidy transferase
•
•
异常： 酶切产物能电脉鉴定出现的 DNA条带数比正常情况下有增加。
产生星号活性的因素有多种 ------主要的原因
： 甘油浓度过高：是引起星号活性的常见原因(在限 (1)
制性内切酶的浓度与DNA数量的比值为50u/ugDNA时，甘油的含量 为7.5％（v/v）便能引起星号活性。当应用酶浓度较低微10u/ugDNA时 ， 甘油含量高于15％（v/v）或以上也会引起星号反应)。
endonuclese R,其后再加上述已说明的名称， 如写为endonuclese R.HindIII。
第2章 工具酶
34
限制酶的星活性（ Star activity ） 。指某些限制酶在不适的环境中其 识别序列发生改变（切割与识别序 列相似的序列）的现象。
35
影响酶活性的因素
底物
酶
36
1.底物DNA样品的纯度
蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、 NaCl等。
①加大酶的用量
②加大反应总体积（稀释）
29
Hsu I
不完全同裂酶
识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。
Xma I 5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
Sma I
30
同尾酶(Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如 BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等。
Ⅱ型限制性内切酶
1970年，由H.O. Smith和K.W. Wilcox从 流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶 是Hind Ⅱ。 限制-修饰系统分别由限制酶与修饰酶两 种不同酶分子组成，分子量小，能识别 DNA的特殊序列，种类多，在基因工程中 起重要作用。
17
能识别双链DNA的特殊序列，并在这个 序列内进行切割，产生特异的DNA片段。 其种类繁多。 通常所指的DNA限制性核酸内切酶。 在基因工程技术中，I型不能用，Ⅲ型酶 基本不用， Ⅱ型酶最有用。
26
Pvu Ⅱ等产生的平末端
5’… G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3’… C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’
PvuⅡ 37 ℃
5’… G-C-T-C-A-G-OH 3’… C-G-A-G-T-C-P
2第二章 基因工程工具酶
连接酶的作用机制
DNA连接酶
作用模式图： 1. 连接粘性末端
5′
3′
*********G —OH *********C T T A A — P
3′
5′
5′
3′
P— A A T T C********* OH— G*********
3′
5′
DNA连接酶
5′ **********GAATTC**********
目录
用途： ①连接带匹配粘端的DNA分子。 ②使平端的双链DNA分子互相连接或与合成
接头相连接。
三 核酸酶S1
功能： 水解双链DNA、RNA或DNA-RNA
杂交体中的单链部分。
核酸酶S1
核酸酶S1
+
核酸酶S1
用途：
1. 除去双链DNA的粘性末端以产生 平末端；
2. 除去cDNA合成时形成的发夹结构；
（3）特点： 星号活力的识别形式常对标准识别顺序中两侧 的碱基没有特异性。
GACTAGCNAATTNTACGCAATTT CTGATCGNTTAANATGCGTTAAA
EcoRI*
EcoRI*
（4）产生的原因 a.高甘油含量（>5%V/V) b.内切酶用量过大，一般为> 100U/g DNA c.低离子强度<25mmol/L d.高pH值 pH8.0 e.含有机溶剂：DMSO、乙醇、乙烯二乙醇 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的离子存在
9 Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通 用缓冲液)的使用表
二、DNA连接酶用于催化DNA片段连接
DNA连接酶（DNA ligase）：催化两个相邻的3′-OH和 5′-磷酸基团形成3′，5′-磷酸二酯键，从而使DNA片段或单 链断裂形成的缺口连接起来。
DNA连接酶
作用模式图： 1. 连接粘性末端
5′
3′
*********G —OH *********C T T A A — P
3′
5′
5′
3′
P— A A T T C********* OH— G*********
3′
5′
DNA连接酶
5′ **********GAATTC**********
目录
用途： ①连接带匹配粘端的DNA分子。 ②使平端的双链DNA分子互相连接或与合成
接头相连接。
三 核酸酶S1
功能： 水解双链DNA、RNA或DNA-RNA
杂交体中的单链部分。
核酸酶S1
核酸酶S1
+
核酸酶S1
用途：
1. 除去双链DNA的粘性末端以产生 平末端；
2. 除去cDNA合成时形成的发夹结构；
（3）特点： 星号活力的识别形式常对标准识别顺序中两侧 的碱基没有特异性。
GACTAGCNAATTNTACGCAATTT CTGATCGNTTAANATGCGTTAAA
EcoRI*
EcoRI*
（4）产生的原因 a.高甘油含量（>5%V/V) b.内切酶用量过大，一般为> 100U/g DNA c.低离子强度<25mmol/L d.高pH值 pH8.0 e.含有机溶剂：DMSO、乙醇、乙烯二乙醇 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的离子存在
9 Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通 用缓冲液)的使用表
二、DNA连接酶用于催化DNA片段连接
DNA连接酶（DNA ligase）：催化两个相邻的3′-OH和 5′-磷酸基团形成3′，5′-磷酸二酯键，从而使DNA片段或单 链断裂形成的缺口连接起来。
第二章基因工程操作的工具酶10315
常见的限制性内切酶
限制性核酸内切酶名称 识别序列和切割点
EcoR Ⅰ
G↓AATTC
HindⅡ
GTPy↓PuAC
Hind Ⅲ
A↓AGCTT
BsuR I
GG↓CC
Pst Ⅰ Sma Ⅰ Xba Ⅰ Xho Ⅰ BamHⅠ Not Ⅰ
CTGCA↓G CCC↓GGG
T↓CTAGA C↓TCGAG G↓GATCC
•
HindIII
Xba I
• -A
CTAGA-
• -TTCGA
T
•
Klenow酶填补
• -AAG
CTAGA-
• -TTCGA
TCT-
•
-AAGCTAGA-
•
-TTCGATCT-
C.平末端连接
• -AAGCCCGGGTCG- - GGAGGTTAACCT-
• -TTCGGGCCCAGC- - CCTCCAATTGGA
②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常 不是彼此直接相对的；
Pst Ⅰ酶切 5’ … C – T –G –C–A↓G … 3’ 3’ … G↑A–C – G–T– C… 5’
③断裂结果形成的DNA片段往往具有互补的 单链延伸末端。
EcoRⅠ： 5’ … G↓A –A- T –T – C … 3’ 3’ … C – T –T –A –A↑G … 5’
以内切方式水解DNA，产物的5’为p， 3’ 为 OH。
限制性内切酶的发现
Luria和Human发现： λ．K噬菌体 ---------------Ecoli λ．B噬菌体---------------- Ecoli 广泛存在于原核细菌 。
由宿主控制的对外源DNA的限制(restriction) 和对内源DNA的修饰(modification)现象称 为宿主细胞的限制和修饰作用。
第二章基因工程工具酶
M．HpaI C mCGG
HpaI C CGG 相同
2. E.coli 的dam、dcm甲基化酶
这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相 应的限制修饰系统。
Dam 甲基化酶可在 GATC 序列中的腺 嘌呤 N6 位置上引入甲基。 G mATC
Dcm 甲基化酶识别 CCAGG 或 CCTGG 序列，在第二个胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入 甲基。 C mCAGG C mCTGG
DNA重组 限制酶（物理）图谱绘制 突变分析（RFLP分析） 限制酶的部分酶切与完全酶切
第二节 甲基化酶 （Methylase）
一、甲基化酶的种类与识别序列 二、甲基化对限制酶切的影响
原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一 员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。
3’-C T T A A G-5’ ►有些限制酶的识别序列不对称
AccBSⅠ C C G ↓ C T C
GGC↑GAG
►有些限制酶可识别多种序列
AccⅠ G T M K A C
CAKMTG
►有些限制酶识别的序列呈间断对称， 对称序列之间含有若干个任意碱基。
AlwNⅠ C A G N N N C T G
3. 哺乳动物的甲基化酶
该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化， 其甲基化反应与DNA复制、基因转录 等过程有关。
4. E.coli中依赖于甲基化的限制修饰系统
E.coli 中至少有 3 种依赖于甲基化的 限制系统 mcrA、 mcrBC 和 mrr ，它们
识别的序列各不相同，但只识别经过甲基 化的序列，都降解由 CpG 甲基化酶（M
在识别位点 下游 24-26bp
限制反应与甲基 化反应
分开的反应
互斥
《基因工程》第二章工具酶
•E.coli 菌株中的 DNA 甲基化程度并不完全相同。pBR322 DNA 能 被完全修饰（因此完全不能被 MboI 切割），而 λDNA 只有大约 50% 的 Dam 位点被甲基化，这是因为在 λDNA 被包装到噬菌体头 部之前，甲基化酶还没来得及将 DNA 完全甲基化。因此，被 Dam 或 Dcm 甲基化完全阻断的酶却能对这些 λDNA 进行部分切割。
•5’……G*A-A-T-T- C……3’ •3’……C- T- T-A-A*G……5’
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《基因工程》第二章工具酶
讨论:下面的序列中可能含有多 少个潜在的酶切位点?
•1
•2
•3
•4
•5
•GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAG
A
•6
PPT文档演模板
《基因工程》第二章工具酶
•一、DNA限制性内切酶 •二、甲基化酶 • 三、分子克隆过程中所需要的另一些酶
Hale Waihona Puke PPT文档演模板《基因工程》第二章工具酶
•（一）DNA聚合酶 •（二）RNA聚合酶 •（三）反转录酶 •（四）核酸外切酶 •（五）核酸酶S1
•（六）DNA酶 •（七）RNA酶 •（八）连接酶 •（九）末端转移酶 •（十）碱性磷酸酶
•1．大肠杆菌DNA聚合酶（E.Coli DNA polymerase）主要有3种 作用：
•①5’→3’的聚合作用。但不是复制染色体而是修补DNA，填 补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。 •②3’→5’的外切酶活性。消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。
•③5’→3’外切酶活性。切除受损伤的DNA。
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•DNA 甲基化酶普遍存在于原核和真核生物中， 能将 S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到腺嘌呤或者 是胞嘧啶上。
•5’……G*A-A-T-T- C……3’ •3’……C- T- T-A-A*G……5’
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《基因工程》第二章工具酶
讨论:下面的序列中可能含有多 少个潜在的酶切位点?
•1
•2
•3
•4
•5
•GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAG
A
•6
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《基因工程》第二章工具酶
•一、DNA限制性内切酶 •二、甲基化酶 • 三、分子克隆过程中所需要的另一些酶
Hale Waihona Puke PPT文档演模板《基因工程》第二章工具酶
•（一）DNA聚合酶 •（二）RNA聚合酶 •（三）反转录酶 •（四）核酸外切酶 •（五）核酸酶S1
•（六）DNA酶 •（七）RNA酶 •（八）连接酶 •（九）末端转移酶 •（十）碱性磷酸酶
•1．大肠杆菌DNA聚合酶（E.Coli DNA polymerase）主要有3种 作用：
•①5’→3’的聚合作用。但不是复制染色体而是修补DNA，填 补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。 •②3’→5’的外切酶活性。消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。
•③5’→3’外切酶活性。切除受损伤的DNA。
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•DNA 甲基化酶普遍存在于原核和真核生物中， 能将 S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到腺嘌呤或者 是胞嘧啶上。
第二章 生物技术常用的工具酶
例如：EcoRⅠ 从大肠杆菌（Escherichia coli) R株分离 的第一种限制酶命名为EcoRⅠ， 其中E 代表属名 （Escherichia)，co 代表种名（coli)，R 代表株系 （RY13），Ⅰ 代表该菌株中首次分离到。
Hind Ⅲ
属 种 株 序
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
Sau3AI的酶切位点为GATC，但胞嘧啶“C”被甲 基化（修饰）后，Sau3AI的内切酶活性即被抑制。
二、限制酶的分类
• 根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性 等，一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ三大类。I类和Ⅲ类酶 不适用于基因工程。
• 基因工程所用的酶一般为Ⅱ类酶。 Ⅱ类酶的特点： Ⅱ型核酸内切限制酶仅有内切核酸酶的活性，而没 有甲基化酶的活性； 反应条件需Mg2+； 对DNA的水解有很强的特异性，它要求严格的识别 序列和切割点。
第二章 生物技术常用的工具酶
使核酸降解的核酸酶类（核酸内切酶和核酸 外切酶） 催化核酸合成的酶类（DNA聚合酶、RNA 聚合酶、DNA连接酶等） 核酸修饰酶类（甲基化酶、激酶、核酸转 移酶、磷酸酶等）
3′→5′外切酶 5′→3′外切酶
核酸外切酶：从DNA或RNA链的一端逐个水解下单核苷酸。 磷酸酶：是一种能够将对应底物去磷酸化的酶。 核苷酸转移酶：催化核糖核苷酸还原、生成相应的脱氧核糖核苷酸的酶。 甲基化酶：是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。 核苷酸激酶：催化ATP的γ -磷酸转移到DNA或RNA的5′-OH末端生成ADP的反应。
1μL
1μL 1μL
四、 使用时的注意事项
1) DNA连接酶不能催化两单链DNA分子连接； 2) 只能连接双链DNA分子的单链缺刻(nick)；
第二章 基因工程的工具酶2
4. DNA连接酶
连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末 端连接起来，使之成为一个完整的DNA分 子。 (1). T4噬菌体DNA连接酶 不受dNTP的抑制，催化DNA片断的连接。
(2). E.coli DNA连接酶 不能连接平端DNA,不能连接RNA。
5. 碱性磷酸酶
去除DNA或者RNA的5‘’磷酸，可防止自身环 化。 5’pDNA 5’pRNA 5’OHDNA 5’OHRNA
6.末端转移酶
分子量60000D,在二价阳离子的作用下，催 化dNTP加于DNA分子的3’羟基端。 底物： 带3’羟基端单链DNA或带3’羟基突出端的 双链DNA。
7.核酸酶S1
S1 核 酸 酶 的 基 本 特 性 ： 来 自 稻 谷 曲 霉 菌 （Aspergillus oryzae） 水解单链核酸以及双链核酸中的单链区或单链末端， 产生5’–核苷酸和5’末端为p的寡核苷酸。 Zn2+必需,最适pH范围为4.0 - 4.3,需要NaCl 10 300 mM. 降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍
8 .T4噬菌体多核苷酸激酶
催化ATP的γ-磷酸基团转移到DNA或RNA的5’末端。
用途：
1 .标记DNA5’末端。 2.对缺乏5’磷酸基团的DNA进行磷酸化或者合成接 头进行磷酸化。
第二章 基因工程的载体和 工具酶
2.4 基因工程工具酶
1.工具酶的概念 应用与基因工程的各种酶的总称. 切: 连: 修饰:
3. DNA聚合酶
(1)大肠杆菌DNA聚合酶I （E.coli DNA pol I)：
具有三种酶活性 a、5’ ---3’DNA聚合酶活性 CCGATA-OH E.coli DNA pol I GGCTATCGGA Mg2+ dNTP b、3’ ---5’ 外切酶活性 CGCATCG-OH E.coli DNA pol I GCG Mg2+ dNTP CCGATAGCCT GGCTATCGGA
第二章--工具酶
3) 缓冲体系：限制性核酸内切酶要求有稳定的pH环境，这通常由 Tris•HCl缓冲体系来完成。另外保持限制性核酸内切酶稳定和活性一 般使用DTT。
2010
湖南师范大学生命科学学院
基因工程
影响限制性核酸内切酶活性的因素
4) 反应体积和甘油浓度：商品化的限制性核酸内切酶均加50％甘油作 为保护剂，一般在-20℃下贮藏。在进行酶切反应时，加酶的体积一般 不超过总反应的10％，若加酶的体积太大，甘油浓度过高，则会影响 酶切反应。
II型
核酸内切酶和甲 基化酶分开 单一亚基 Mg2+
III型
双功能的酶 两种不同的亚基 ATP、Mg2+
特异性识别位点
切割位点 序列特异的切割 在基因工程中的应用
非对称序列
在距识别位点至少 1000bp的地方随机 的切割 不是 无用
回文对称结构
位于识别位点上 是 广泛使用
非对称序列
距识别位点下游 24～26bp处 是 用处不大
2010
湖南师范大学生命科学学院
基因工程
Klenow酶的基本用途
• 补平由核酸内切酶产生的5′粘性末端 • DNA片段的同位素末端标记 • cDNA第二链的合成 • 双脱氧末端终止法测定DNA序列
2010
湖南师范大学生命科学学院
基因工程
四、反转录酶
• 反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链
5) 限制性核酸内切酶反应的时间：通常为1h，但大多数酶活性可维 持很长的时间，进行大量DNA酶解反应时，一般让酶解过夜。
6) DNA的纯度和结构：一个酶单位定义为在1h内完全酶解lμg λ噬 菌体DNA所需的酶量。DNA样品中所含蛋白质、有机溶剂及RNA等杂质均 会影响酶切反应的速度和酶切的完全程度，酶切的底物一般是双链DNA， DNA的甲基化位置会影响酶切反应。
第二章 工具酶
重组DNA中常见的工具酶
• 组员：
曹 学 荣
朱 卓 策
施 斌 豪
方 嘉 霖
王 振
叶 可 松
方 燕 婷
陈 玲 琼
胡 冰 冰
陈 宇 驰
酶切反应时应注意
1. 要求较纯的底物DNA。蛋白质、苯酚、氯 仿、乙醇、EDTA、SDS、大于10 mmol／L NaCl等 2.Mg2+和Tris-HCl缓冲体系、pH范围在7.27.6 3.对离子强度的要求分为3个级别， 高盐(100 mmol／L NaCl) H 中盐(50 mmol／L NaCl) M 低盐(0～10 mmol／L NaCl) L 4.应在低温或冰浴条件下完成操作。
第二章 工具酶
★用于核酸操作的工具酶
– 限制性内切酶和甲基化酶 – DNA连接酶 – DNA聚合酶 – RNA聚合酶: – 核酸酶：核酸外切与内切酶 – 核酸末端修饰酶：碱性磷酸酶、末端转移 酶、T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）
限制性核酸内切酶类型及特性
按其亚基组成和切断核酸情况的不同，分为三 类： Ⅰ型 II型 Ⅲ型 – Ⅰ型: 它们在识别位点很远的地方任意切割 DNA链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性， 是随机的。 – Ⅲ型: 有专一的识别顺序，在识别顺序旁边 几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这 几个核苷酸对也不是特异性的。
DNA聚合酶
• • • • • • • 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段 T4噬菌体聚合酶 T7噬菌体DNA聚合酶 TapDNA聚合酶 逆转录酶 末端转移酶
大肠杆菌DNF聚合酶Ⅰ
• 具有5`→3`DNA聚合酶活性：要求DNA单 链模板和具有3`-OH末端引物，4种底物 • 具有5`→3`外切酶活性：从双链DNA 5` 端开始降解DNA，且5`端必须带有磷酸基 团 • 具有3 `→ 5`外切酶活性：是修复机制， 活性底物是带3 `-OH的双链或单链DNA， 对于双链DNA需要足够底物dNTP
基因工程 第2章 工具酶
Cutting site
mainly internally
AccBSI
CCGCTC (-3/-3) GGCGAG
-2/-4
in one end
EcoRII
CCWGG
Sau3AI GATC
NlaIII CATG
in both ends BcgI (10/12)CGA(N)6TGC(12/10)
10(N)CGA(N)6TGC(N)12
PstI GCTGCAGC 0 0
TGCACTGCAGTGCA
AACTGCAG(N) 14
10
>90
10
>90
CTGCAG(N) 20
0
0
DNA fragment（linear vector）
10/ug DNA 60min
CGTACG CTCGAG GAATTC CTGCAG GATATC
EcoRI
HindII
5’ ...G T Py Pu A C... 3’ 3’…C A Pu Py T G... 5’
GTCGAC G T TAA C G T C AA C GTTGAC
G R
HindII
5’ ...G A A T T C... 3’ 3’…C T T A A G... 5’
EcoRI
Nomenclature of Restrictive endonuclease
5‘ recessed
KpnI
GGTACC CCATGG
Blunt end
HaeIII GG↓CC EcoRV GAT↓ATC XmnI GAANN↓NNTTC
Dissymetrical and protruding ends
第二章基因工程中常用的工具酶
第二章 基因工程中常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA 分子的特异切割分子的特异切割DNA 甲基化酶—用于DNA 分子的甲基化分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA 和RNA 的连接的连接核酸聚合酶—用于DNA 和RNA 的合成的合成核酸酶—用于DNA 和RNA 的非特异性切割的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA 和RNA 的末端修饰的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
§2-1 核酸内切限制酶定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。
双链结构的核酸内切酶。
到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。
种以上不同的核酸内切限制酶。
核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）一 、限制修饰系统的种类（图）限制修饰系统的种类（图）二、 限制性内切酶的定义、命名1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II 型限制酶。
型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
例如：Hin d Ⅲ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae ，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
表示分离到的第三个限制酶。
Eco RI RI——Escherichia coli RI RI Hin d Ⅲ—Haemophilus influensae d ⅢSac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA 分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp 的地方可以随机地切割DNA 分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。
第二章 工具酶.限制酶
第二章 基因克隆的工具酶
第一节 第二节 第三节 第四节 逆转录酶及其它酶
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1
基因工程工具酶
“工若善其事，必先利其器”。 基因工程的操作，是分子水平的操作， 它涉及到一系列相互关连的酶促反应， 要靠一些重要酶类作工具，对基因进行 人工切割和拼接，故称为“工具酶”。 已知有许多酶在基因克隆实验中有着广 泛的用途。 工具酶是从哪里获得的呢？
徐师大-屈艾老师制作 17
四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性
1. 为单链多肽, 最适pH6-8, 能被盐抑制、被Mg2+激活； ，2. 底物DNA分子双链中有特异性识别序列，通常有 4-8个bP甚或更多，大都为一回文对称的结构（即识别 序列中有一个中心对称轴，若从这个轴向两侧方向 “读”，内容都是完全相同的，也称为反向重复序 列）。 3 . 一般可在特异性识别序列内切割双链DNA分子 （有例外），产生链的断裂，断裂端有粘性末端和平 齐末端之分。其中两个粘性末端可以互补配对连结成 重组分子。 4. 其他：同裂酶、同尾酶、远距离裂解酶、双切割酶 等。分述如下：
徐师大-屈艾老师制作 7
l
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8
徐师大-屈艾老师制作
9
二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率 1、类型
特性 （7项） I型
II型
分开的核 酸内切酶 和甲基化 酶
III型
限制和修 饰活性
单一多功 能的酶
具有一种 共同亚基 的双功能 的酶
核酸内切 限制酶的 蛋白质结 构
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21
三种酶切末端
3’粘性末端（如Pst Ⅰ） 5’粘性末端（如EcoR Ⅰ）
第一节 第二节 第三节 第四节 逆转录酶及其它酶
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1
基因工程工具酶
“工若善其事，必先利其器”。 基因工程的操作，是分子水平的操作， 它涉及到一系列相互关连的酶促反应， 要靠一些重要酶类作工具，对基因进行 人工切割和拼接，故称为“工具酶”。 已知有许多酶在基因克隆实验中有着广 泛的用途。 工具酶是从哪里获得的呢？
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四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性
1. 为单链多肽, 最适pH6-8, 能被盐抑制、被Mg2+激活； ，2. 底物DNA分子双链中有特异性识别序列，通常有 4-8个bP甚或更多，大都为一回文对称的结构（即识别 序列中有一个中心对称轴，若从这个轴向两侧方向 “读”，内容都是完全相同的，也称为反向重复序 列）。 3 . 一般可在特异性识别序列内切割双链DNA分子 （有例外），产生链的断裂，断裂端有粘性末端和平 齐末端之分。其中两个粘性末端可以互补配对连结成 重组分子。 4. 其他：同裂酶、同尾酶、远距离裂解酶、双切割酶 等。分述如下：
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9
二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率 1、类型
特性 （7项） I型
II型
分开的核 酸内切酶 和甲基化 酶
III型
限制和修 饰活性
单一多功 能的酶
具有一种 共同亚基 的双功能 的酶
核酸内切 限制酶的 蛋白质结 构
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21
三种酶切末端
3’粘性末端（如Pst Ⅰ） 5’粘性末端（如EcoR Ⅰ）
第2章 工具酶
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。
2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。
如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。
3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统， 用罗马字母表示。
1.2 限制-修饰系统的类型与特点
1.2.1 I型限制－修饰系统
一种酶，由3个分别行使切割、甲基化和识别序列的亚基构成。 首先由M.Meselson等在1968年从大肠杆菌 K株分离：EcoK
（1）识别位点序列: 未甲基化修饰的特异序列
EcoB： TGA(N)8TGCT
EcoK：AAC(N)6GTGC
（1）I型： 单酶3亚基，随机切割 （2）II型： 双酶，定点切割 （3）IIs型：双酶，随机切割 （4）III型：单酶2亚基，随机切割
1.3 限制性核酸内切酶简介
（2）限制性核酸内切酶的定义
简称限制酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（多 为4-8bp），并由此处(或在此处附近）切割DNA双链的核酸内切酶。
主要内容
第一节 限制-修饰系统及限制性核酸内切酶
1.1 限制-修饰系统的发现及原理 1.2 限制-修饰系统类型及特点 1.3 限制性内切酶简介 1.4 基因工程中对宿主限制修饰的要求
（1）识别位点序列: 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（一般为
回文序列），与DNA的来源无关。
回文序列(Palindrome)：双链DNA中的一段反向重复序列，当该序列的双链 被打开后，可形成发夹结构。或者说其序列具有中心对称的特点，或者两条 单链从同一方向（5‘或3’)读时具有相同序列。
2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。
如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。
3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统， 用罗马字母表示。
1.2 限制-修饰系统的类型与特点
1.2.1 I型限制－修饰系统
一种酶，由3个分别行使切割、甲基化和识别序列的亚基构成。 首先由M.Meselson等在1968年从大肠杆菌 K株分离：EcoK
（1）识别位点序列: 未甲基化修饰的特异序列
EcoB： TGA(N)8TGCT
EcoK：AAC(N)6GTGC
（1）I型： 单酶3亚基，随机切割 （2）II型： 双酶，定点切割 （3）IIs型：双酶，随机切割 （4）III型：单酶2亚基，随机切割
1.3 限制性核酸内切酶简介
（2）限制性核酸内切酶的定义
简称限制酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（多 为4-8bp），并由此处(或在此处附近）切割DNA双链的核酸内切酶。
主要内容
第一节 限制-修饰系统及限制性核酸内切酶
1.1 限制-修饰系统的发现及原理 1.2 限制-修饰系统类型及特点 1.3 限制性内切酶简介 1.4 基因工程中对宿主限制修饰的要求
（1）识别位点序列: 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（一般为
回文序列），与DNA的来源无关。
回文序列(Palindrome)：双链DNA中的一段反向重复序列，当该序列的双链 被打开后，可形成发夹结构。或者说其序列具有中心对称的特点，或者两条 单链从同一方向（5‘或3’)读时具有相同序列。
第二章+工具酶(ye)
DNase I 5‘ 5‘ … G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘ DNA pol I
制备32P标记的探针
Mg2+ 5‘ dNTP 5‘ ppp dA（a-32P-dATP
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ ）
3.1.2 Klenow酶的基本用途：
A片段的同位素末端标记
cDNA第二链的合成 双脱氧末端终止法测定DNA序列
Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端
5‘ … G-C-T-G-OH
P-A-A-T-T-C-G-A-G
…
3’ … C-G-A-C-T-T-A-A-P 3‘
4.1 T4-DNA聚合酶
4.1.1 T4-DNA酶的基本特性：
5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切 酶活性 在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切 在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止 在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位
4.1.2 T4-DNA聚合酶的基本用途：
100 mM 中盐酶
150 mM 高盐酶
1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全
水解 1 mg 标准DNA所需的酶量
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：
BamHI SmaI
5‘ 3‘ …GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’ 5‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’ …GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTACCTAG 5‘ …GCTACATGGATCCC 3‘ …CGATGTACCTAGGG GGCCCAAGCGTA…5’ GGGTTCGCAT…3’ CCCAAGCGTA…5’
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BstpI
GGTNACC
Bgl I GCC（N）4GGC
4、影响II 型限制性酶作用的因素
离子强度、pH的影响
如 MgCl2由5mM EcoRI EcoRI* 2mM (pH8.5)酶对底物识别专一性降低 GAATTC NAATTN
某些试剂可改变酶的专一性 如疏水试剂甘油，二甲基亚砜存在时，会使BamH I的识别 和切割特异性发生改变。 酶量的影响 酶解温度和时间 过量会影响酶的识别顺序
TALEN 基因敲除
TALEN (TALE+FOK I) 表达质粒对 TALEN 表达质粒对转染、表达 切割靶位点 切割诱发DNA损伤修复机制 （nonhomologous end-joining， NHEJ）。由于在此修过程中总是 有一定的错误率存在。在修复中发 生移码突变错误的个体即形成目标 基因敲除突变体
5mmol/L MgCl2
2mmol/L MgCl2
Ⅲ 其他重要的工具酶
DNA聚合酶 DNA连接酶 碱性磷酸酶
S1核酸酶-单链核酸内切酶
末端脱氧核糖核苷酸转移酶
1、DNA聚合酶
特点：能够把脱氧核糖核苷酸连续的加 到双链DNA分子引物链的3′-OH末端， 催化核苷酸的聚合作用。 常用DNA聚合酶
• 用于DNA3’端标记——TUNEL凋亡检测
重组人工粘性末端
锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases）
锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内 切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。
• Cys2–His2锌指结构域是真核生物中最 常见的一种DNA结合基序，在人类基 因组中也是编码频次排名第2的蛋白结 构域； • 一个锌指大约由30个氨基酸组成，形 成了一种保守的ββɑ结构，其中每一个 α螺旋可以特异识别3-4个碱基；
T A
T A
G C
T
T
A
A
A
A
T
T
C G
T A
T A
HO
去除DNA片段 5’ 末端磷酸
以防自身连接
4、末端脱氧核糖核苷酸转移酶 （Terminal deoxynuclotidyl transferase) 催化dNTP加到DNA分子的3’-OH末端，
带3’突出的DNA为最佳受体。
应用
• 重组人工粘性末端；
TAL 靶点识别模块
FokI
X2
TALEN靶向（基因敲除）技术基本流程
1. 选择、确定靶点 2. TALE识别模块串联构建
X2
3. TALEN真核表达质粒构建
X2
4. TALEN真核表达质粒转入细 胞，表达TALEN重组蛋白
X2
ห้องสมุดไป่ตู้
5. 检测突变效率，筛选（移码） 突变体
Mut
选择确定TALE靶点
靶点的DNA序列特征： 相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点
5’ C T T A G
G A G G C 3’
5’
Nick
3’ G A A T C T A C T C C G 5’ C T T A G
OH3’ 5’P
A G G C 3’
5’
Gap
3’ G A A T C T A C T C C G
3、碱性磷酸酶
可以催化切除DNA、RNA和dNTP上的5’ 磷酸基团 用途
Klenow片段
从大肠杆菌DNA聚合酶I全酶中除去 3′ 5′外切酶活性片段
大肠杆菌DNA聚合酶I全酶
Klenow fragment (68 kD)
N exonuclease 5’ 3’ proofreading polymerase site catalytic
small fragment (35 kD) C C exonuclease 5’ 3’
特点：在距识别位点约25bp处切割
DNA，切割位点难以预测。
II 型限制性酶
1、特点
• 功能特点 识别和切割双链DNA的特定序列，产生特定
的DNA末端。
EcoRI GAATTC HindIII AAGCTT •
识别序列特点 识别序列一般在4～6个碱基对，通常为
反转互补序列，即具180°旋转对称性（又称回文结构）
ZFN 技术
研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑，比如基因敲除。 已建立有ZFN库，识别多种DNA序列，但还不能达到识别任意 靶DNA的目的，其应用受到一定的限制。
锌指核酸酶介导的定向染色体删除
ZFN off-targeting 原因
transcription activator-like (TAL) effector nucleases:TALEN
同尾酶 识别与切割顺序相互有关的酶。来源 各异，识别序列也各不相同，但作用后产 生相同的粘性末端。
BamHI
N N G N N C C T A G
G A T C C N N N G N N N
BglII
N N A N N T C T A G
G A T C T N N N A N N N
Sau 3A
在线靶点选择设计软件：https:///node/add/talefoff/
TALE识别模块串联构建
• TAL的核酸识别单元
为34aa模块中的双连 氨基酸（RVD） • RVD与A、G、C、T 有恒定的对应关系， 即NI识别A，NG识别T， HD识别C，NN识别G， 非常简单明确 • 欲使TALEN特异识 别某一核酸序列（靶 点），只须按照靶点 序列将相应TAL单元 （14 -18个）串联克 隆即可。
Taq DNA聚合酶
是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，
最佳作用温度位70～80℃，也具有5′3′外
切酶活性
可用于 聚合酶链式反应（PCR）；
DNA测序
逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶，RDDP）
多功能：
以RNA为模板5′3′方向DNA聚合酶活性；以 mRNA为模板催化合成互补的DNA，称为cDNA
参考文献：Cermak et al., Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting,
Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 12, e82.
• 从DNA片段除去 5’ 磷酸以防自身连接
• 制备5’ 末端核酸探针
5’
T A T A G C A T A T T A T A C G T A T A
3’
5’
去除DNA末端5’ 磷酸基团
Recessed 3’ hydroxyl group
Overhanging 5’ phosphate group extension
指来源不同但识别相同序列的酶。该类 酶切割DNA的位点相同，但切割后产生的末端 可能不同。如：
5′GGTAC C 3′ KpnI 3′C CATGG 5′ 5′GGTAC 3′Cp + pC3′ CATGG5′
5′G GTACC 3′ Asp718I 3′CCATG G 5′
5′G pGTACC3′ 3′CCATGp + G5′
第二章 工具酶
限制性核酸内切酶 其他重要的核酸酶
ZFN: Zinc-finger nucleases
TALEN: transcription activator-like (TAL) effector nucleases
Ⅰ 工具酶的功能分类：
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 是一类能识别和切割双链DNA分子中特定 碱基顺序的核酸酶，简称限制酶。
TALEN表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别 靶点核酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除 的过程。
TALEN技术发展
• 1989年，植物病原体黄单胞菌属 （Xanthomonas spp.）avrBs3 基 因被克隆。 • 2007年 发现其序列特异性核酸结合特性， avrBs3 - TA • 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译 • 17 -18个34aa重复序列
N N N N N N C T A G
G A T CN N N N N N
远距离裂解酶
这类酶的识别与切割位点不一致，但其切割 位点和识别位点的距离是一定的，一般为10个碱 基左右。 MboII GAAGANNNNNNNN
可变酶
II类酶中一个特例，他的识别序列中有一个 或几个核苷酸是可变的，且识别序列一般大于 6个 碱基对。
• 人工设计识别特异DNA序列的α螺 旋，采用如上的通用序列，通过改 变其中7个X来实现识别不同的三联 体碱基； • TGEK是多个螺旋间的连接序列； • 人工锌指结构域和FokI融合蛋白 （ZFN）可以在指定区域切断DNA 双链； • 构建成对ZFN。
FokI: type II restriction endonuclease
《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
• 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs》 《Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs》
• 34aa中的第12和13个氨基酸（Repeat Variant Di-residue, RVD) 对应识别一个目标碱基