【学习课件】第二章基因工程中常用的工具酶
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基因工程常用的工具酶
Py dCMP、dTMP Pu dAMP、dGMP
2024/10/14
.
6
识别序列呈典型的旋转对称型回文结构
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的 DNA双螺旋结构
2024/10/14
.
14
第三节 DNA聚合酶
2024/10/14
.
15
DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤 的一类酶
❖作用特点
能够把脱氧核苷酸分子连续的加到DNA分子引物链的3’-OH末端，催 化核苷酸的聚合
❖作用条件
➢ 脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP）
属名
种名
株名
Haemophilus influenzae d
HindΙ、 HindⅡ、 Hind Ⅲ
不同限制修饰系统
2024/10/14
.
4
三、Ⅱ型限制酶的特性-识别序列
识别双链DNA分子中特定的4 - 8对核苷酸序列
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
5‘ HO 3‘ HO
T4-PNP
5‘ p 3‘ HO
OH 3‘ OH 5‘
Mg2+ pppATP（g-32P-ATP）
OH 3‘
5‘ HO
BAP / CIP
2024/10/14
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识别序列呈典型的旋转对称型回文结构
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的 DNA双螺旋结构
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第三节 DNA聚合酶
2024/10/14
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15
DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤 的一类酶
❖作用特点
能够把脱氧核苷酸分子连续的加到DNA分子引物链的3’-OH末端，催 化核苷酸的聚合
❖作用条件
➢ 脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP）
属名
种名
株名
Haemophilus influenzae d
HindΙ、 HindⅡ、 Hind Ⅲ
不同限制修饰系统
2024/10/14
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三、Ⅱ型限制酶的特性-识别序列
识别双链DNA分子中特定的4 - 8对核苷酸序列
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
5‘ HO 3‘ HO
T4-PNP
5‘ p 3‘ HO
OH 3‘ OH 5‘
Mg2+ pppATP（g-32P-ATP）
OH 3‘
5‘ HO
BAP / CIP
生物技术课件-02基因工程常用工具酶
性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金 限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双
链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进 行切割的一种酶。 功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。
根据限制性核酸内切酶的限制修饰活性、 相对分子量大小、酶蛋白结构、切割位点 及限制作用所需的辅助因子等，将限制性 核酸内切酶分为三类：I型酶，II型酶，III型 酶。
（DDT：二硫苏糖醇 BSA：牛血清蛋白）
在DNA分子双链的特异性识别序列部位， 切割DNA分子，产生链的断裂。
2个单链断裂部位在DNA分子上的分布， 通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的 DNA片段，具有互补的单链延伸末端。
绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶都能够 识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序 列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列 内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫 核酸内切酶的切割位点或靶序列。
5’-GG CC-3’源自5’-GG- -CC-3’-CC GG-5’
33’’-CC- -GG-5’
5’粘性末端（如EcoR Ⅰ）
5’-GAATTC-3’
5’-G- -AATTC-
3’-CTTAAG-
33’’-CTTAA- -
5’
G-5’
3’粘性末端（如Pst Ⅰ）
同裂酶：来源不同的限制酶识别相同的核 苷酸靶序列。产生同样的切割，形成同样 的末端。 如：HpaⅡ和MspⅠ均可切割C CGG。
同尾酶：来源不同，识别的核苷酸靶序列 也不相同，但切割后DNA分子产生的粘性 末端相同的限制性核酸内切酶。
5’-GGATCC3’
3’-CCTAGG5’ BamHⅠ
5’-TGATCA3’
3’-ACTAGT5’ BclⅠ
链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进 行切割的一种酶。 功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。
根据限制性核酸内切酶的限制修饰活性、 相对分子量大小、酶蛋白结构、切割位点 及限制作用所需的辅助因子等，将限制性 核酸内切酶分为三类：I型酶，II型酶，III型 酶。
（DDT：二硫苏糖醇 BSA：牛血清蛋白）
在DNA分子双链的特异性识别序列部位， 切割DNA分子，产生链的断裂。
2个单链断裂部位在DNA分子上的分布， 通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的 DNA片段，具有互补的单链延伸末端。
绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶都能够 识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序 列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列 内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫 核酸内切酶的切割位点或靶序列。
5’-GG CC-3’源自5’-GG- -CC-3’-CC GG-5’
33’’-CC- -GG-5’
5’粘性末端（如EcoR Ⅰ）
5’-GAATTC-3’
5’-G- -AATTC-
3’-CTTAAG-
33’’-CTTAA- -
5’
G-5’
3’粘性末端（如Pst Ⅰ）
同裂酶：来源不同的限制酶识别相同的核 苷酸靶序列。产生同样的切割，形成同样 的末端。 如：HpaⅡ和MspⅠ均可切割C CGG。
同尾酶：来源不同，识别的核苷酸靶序列 也不相同，但切割后DNA分子产生的粘性 末端相同的限制性核酸内切酶。
5’-GGATCC3’
3’-CCTAGG5’ BamHⅠ
5’-TGATCA3’
3’-ACTAGT5’ BclⅠ
生物技术课件-02基因工程常用工具酶
基因工程的起源可以追溯到20世纪70年代，当时科学家们开始探索限制性内切酶和DNA连接酶等工具酶在分子生物学中的应用。
随着技术的不断发展，基因工程经历了从简单到复杂的过程，从最初的重组DNA技术到现在的基因编辑技术，基因工程的应用范围和影响力不断扩大。
医学领域
农业领域
工业领域
基础生物学研究
01
02
DNA聚合酶的最主要功能是催化脱氧核糖核酸链的合成。
DNA聚合酶存在于生物体的各种细胞中，包括原核生物和真核生物。其中最重要的有E· coliDNA聚合酶Ⅰ、T4DNA聚合酶、真核生物DNA聚合酶α、β、γ等。
碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基。
聚合酶
这类酶能够催化DNA的聚合反应，是PCR技术中常用的工具酶之一。根据来源不同，可以分为Taq酶和T7噬菌体聚合酶等。
工具酶的应用与展望
限制性核酸内切酶用于切割DNA，产生具有特定黏性末端的片段，连接酶将这些片段连接起来，形成重组DNA。
聚合酶用于DNA复制，通过检测特定基因的PCR产物，可以鉴定基因的存在和表达水平。
01
02
在基因工程中，末端转移酶可以用来在DNA片段的3'端加上多聚腺苷酸尾巴，从而增加外源基因在宿主细胞中的转录效率。
末端转移酶是一种能够将单个脱氧核糖核苷酸或脱氧寡核苷酸附加到核酸分子末端的酶。
工具酶的分类与特性
来源于动物细胞
这类工具酶是从动物细胞中提取得到的，如碱性磷酸酶、限制性核酸内切酶等。它们在基因克隆、DNA修饰等方面有广泛应用。
限制性核酸内切酶
这类酶能够识别并切割DNA的特异序列，是基因工程中常用的工具酶之一。根据识别序列的不同，可以分为限制性内切酶和特异性内切酶。
随着技术的不断发展，基因工程经历了从简单到复杂的过程，从最初的重组DNA技术到现在的基因编辑技术，基因工程的应用范围和影响力不断扩大。
医学领域
农业领域
工业领域
基础生物学研究
01
02
DNA聚合酶的最主要功能是催化脱氧核糖核酸链的合成。
DNA聚合酶存在于生物体的各种细胞中，包括原核生物和真核生物。其中最重要的有E· coliDNA聚合酶Ⅰ、T4DNA聚合酶、真核生物DNA聚合酶α、β、γ等。
碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基。
聚合酶
这类酶能够催化DNA的聚合反应，是PCR技术中常用的工具酶之一。根据来源不同，可以分为Taq酶和T7噬菌体聚合酶等。
工具酶的应用与展望
限制性核酸内切酶用于切割DNA，产生具有特定黏性末端的片段，连接酶将这些片段连接起来，形成重组DNA。
聚合酶用于DNA复制，通过检测特定基因的PCR产物，可以鉴定基因的存在和表达水平。
01
02
在基因工程中，末端转移酶可以用来在DNA片段的3'端加上多聚腺苷酸尾巴，从而增加外源基因在宿主细胞中的转录效率。
末端转移酶是一种能够将单个脱氧核糖核苷酸或脱氧寡核苷酸附加到核酸分子末端的酶。
工具酶的分类与特性
来源于动物细胞
这类工具酶是从动物细胞中提取得到的，如碱性磷酸酶、限制性核酸内切酶等。它们在基因克隆、DNA修饰等方面有广泛应用。
限制性核酸内切酶
这类酶能够识别并切割DNA的特异序列，是基因工程中常用的工具酶之一。根据识别序列的不同，可以分为限制性内切酶和特异性内切酶。
基因工程2—工具酶中国药科大学生物工程所有-PPT课件
10
1. 来源 原核生物。
2.性质 内切酶。
即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 3. 功能
自我保护作用。
细菌的限制和修饰系统（R/M体系） 11
（1）限制（Restriction） 限制性内切酶将侵入细菌体内的外 源DNA切成小片断。
12
（2）修饰（Modification）
细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化 修饰所保护，不能被自身的限制性内切 酶识别切割。
I类酶的切割位点与识别位点通常相距1,000-5,000bp，切 割位点的序列并不表现出严格的特异性，两条DNA链上的 断裂位点相距70-75个核苷酸，因此切开的DNA分子末端 是单链形式。
21
如果识别位点是全甲基化的，则ATP使酶-SAM复合物脱离 DNA双链；如果识别位点是半甲基化的(即只有一条链甲基 化)，则酶-SAM复合物在ATP的帮助下使非甲基化的DNA链 甲基化，同时SAM转变为相应的S-腺苷高半胱氨酸(SAH)； 如果识别位点没有甲基化，ATP可使酶分子再次变构，暴 露出限制性内切酶的活性部位，先释放SAM，然后以一种 未知的机制在切割位点处将双链DNA切断，同时消耗ATP。
Xma I 5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’
Sma I 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
33
（6）同尾酶(Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。 如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等
BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
24
II类酶分类
绝大多数的II类酶均在其识别位点内切割DNA，切 割位点可发生在识别序列的任何两个碱基之间。 一部分酶识别相同的序列，但切点不同，这些酶 称为同位酶（Isoschizomers），其中识别位点与 切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶，如 SstI与SacI、HindIII与HsuI等。有些酶识别位点 不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列，这 些酶称为同尾酶（Isocandamers）。
1. 来源 原核生物。
2.性质 内切酶。
即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 3. 功能
自我保护作用。
细菌的限制和修饰系统（R/M体系） 11
（1）限制（Restriction） 限制性内切酶将侵入细菌体内的外 源DNA切成小片断。
12
（2）修饰（Modification）
细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化 修饰所保护，不能被自身的限制性内切 酶识别切割。
I类酶的切割位点与识别位点通常相距1,000-5,000bp，切 割位点的序列并不表现出严格的特异性，两条DNA链上的 断裂位点相距70-75个核苷酸，因此切开的DNA分子末端 是单链形式。
21
如果识别位点是全甲基化的，则ATP使酶-SAM复合物脱离 DNA双链；如果识别位点是半甲基化的(即只有一条链甲基 化)，则酶-SAM复合物在ATP的帮助下使非甲基化的DNA链 甲基化，同时SAM转变为相应的S-腺苷高半胱氨酸(SAH)； 如果识别位点没有甲基化，ATP可使酶分子再次变构，暴 露出限制性内切酶的活性部位，先释放SAM，然后以一种 未知的机制在切割位点处将双链DNA切断，同时消耗ATP。
Xma I 5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’
Sma I 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
33
（6）同尾酶(Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。 如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等
BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
24
II类酶分类
绝大多数的II类酶均在其识别位点内切割DNA，切 割位点可发生在识别序列的任何两个碱基之间。 一部分酶识别相同的序列，但切点不同，这些酶 称为同位酶（Isoschizomers），其中识别位点与 切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶，如 SstI与SacI、HindIII与HsuI等。有些酶识别位点 不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列，这 些酶称为同尾酶（Isocandamers）。
基因工程操作的工具酶
也称为Kronberg酶，是Kronberg等1956年发 现的第一个DNA聚合酶。
具有三种酶活性
a、5’ ---3’DNA聚合酶活性
CCGATA-OH E.coli DNA pol I CCGATAGCCT
GGCTATCGGA Mg2+ dNTP
GGCTATCGGA
.
46
b、3’ ---5’ 外切酶活性
.
44
3. DNA聚合酶
分为两类： ①依赖于DNA的DNA聚合酶，包括大肠杆菌
DNA聚合酶I（全酶）、大肠杆菌DNA聚合 酶I的Klenow大片段酶、T4 DNA聚合酶、 T7DNA聚合酶和耐高温的DNA聚合酶等。 ②依赖于RNA的DNA聚合酶，有逆转录酶。
.
45
DNA聚合酶
(1)大肠杆菌DNA聚合酶I （E.coli DNA pol I)：
.
21
常见的限制性内切酶
限制性核酸内切酶名称 识别序列和切割点
EcoR Ⅰ
G↓AATTC
HindⅡ
GTPy↓PuAC
Hind Ⅲ
A↓AGCTT
BsuR I
GG↓CC
.
22
Pst Ⅰ Sma Ⅰ Xba Ⅰ Xho Ⅰ BamHⅠ Not Ⅰ
CTGCA↓G CCC↓GGG
T↓CTAGA C↓TCGAG G↓GATCC
.
14
限制性酶的识别序列一般为4~8个核苷 酸，这些序列大多呈回纹结构。
Eco RⅠ识别6个核苷酸序列，在特定的G-A 之间切割DNA分子。 5’ … G↓A –A- T –T – C … 3’ 3’ … C – T –T –A –A↑G … 5’
.
15
Pst Ⅰ酶切 5’ … C – T –G –C–A↓G … 3’ 3’ … G↑A–C – G–T– C… 5’
《基因工程》第二章工具酶
•E.coli 菌株中的 DNA 甲基化程度并不完全相同。pBR322 DNA 能 被完全修饰（因此完全不能被 MboI 切割），而 λDNA 只有大约 50% 的 Dam 位点被甲基化，这是因为在 λDNA 被包装到噬菌体头 部之前，甲基化酶还没来得及将 DNA 完全甲基化。因此，被 Dam 或 Dcm 甲基化完全阻断的酶却能对这些 λDNA 进行部分切割。
•5’……G*A-A-T-T- C……3’ •3’……C- T- T-A-A*G……5’
PPT文档演模板
《基因工程》第二章工具酶
讨论:下面的序列中可能含有多 少个潜在的酶切位点?
•1
•2
•3
•4
•5
•GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAG
A
•6
PPT文档演模板
《基因工程》第二章工具酶
•一、DNA限制性内切酶 •二、甲基化酶 • 三、分子克隆过程中所需要的另一些酶
Hale Waihona Puke PPT文档演模板《基因工程》第二章工具酶
•（一）DNA聚合酶 •（二）RNA聚合酶 •（三）反转录酶 •（四）核酸外切酶 •（五）核酸酶S1
•（六）DNA酶 •（七）RNA酶 •（八）连接酶 •（九）末端转移酶 •（十）碱性磷酸酶
•1．大肠杆菌DNA聚合酶（E.Coli DNA polymerase）主要有3种 作用：
•①5’→3’的聚合作用。但不是复制染色体而是修补DNA，填 补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。 •②3’→5’的外切酶活性。消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。
•③5’→3’外切酶活性。切除受损伤的DNA。
PPT文档演模板
•DNA 甲基化酶普遍存在于原核和真核生物中， 能将 S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到腺嘌呤或者 是胞嘧啶上。
•5’……G*A-A-T-T- C……3’ •3’……C- T- T-A-A*G……5’
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《基因工程》第二章工具酶
讨论:下面的序列中可能含有多 少个潜在的酶切位点?
•1
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•GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAG
A
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《基因工程》第二章工具酶
•一、DNA限制性内切酶 •二、甲基化酶 • 三、分子克隆过程中所需要的另一些酶
Hale Waihona Puke PPT文档演模板《基因工程》第二章工具酶
•（一）DNA聚合酶 •（二）RNA聚合酶 •（三）反转录酶 •（四）核酸外切酶 •（五）核酸酶S1
•（六）DNA酶 •（七）RNA酶 •（八）连接酶 •（九）末端转移酶 •（十）碱性磷酸酶
•1．大肠杆菌DNA聚合酶（E.Coli DNA polymerase）主要有3种 作用：
•①5’→3’的聚合作用。但不是复制染色体而是修补DNA，填 补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。 •②3’→5’的外切酶活性。消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。
•③5’→3’外切酶活性。切除受损伤的DNA。
PPT文档演模板
•DNA 甲基化酶普遍存在于原核和真核生物中， 能将 S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到腺嘌呤或者 是胞嘧啶上。
第二章 基因工程工具酶[可修改版ppt]
![第二章 基因工程工具酶[可修改版ppt]](https://img.taocdn.com/s3/m/1ddfa8de52ea551811a68797.png)
5′ … G C T G A A T T C G A G … 3′ 3′ … C G A C T T A A G C T C … 5′
5’ G↓G-A-T-C-C 3’ 3’ C-C-T-A-G↑G 5’
切点大多数在识别序列之内，也有的在序列两侧
Sau3AⅠ EcoRⅡ NciⅠ EcoRⅠ
5′ … ↓GATC … 3′ 5′ … ↓CCWGG… 3′ 5′ … CC↓SGG … 3′ 5′ … G↓AATTC … 3′
②粘性末端标记
凸出的5 ’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。凸出的 3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如 AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 ③ 补平成平齐末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。
（6） 同位酶、同尾酶与同裂酶
同位酶：具有相同的识别序列，但是酶切位点不同。
生物体内普遍存在的限制修饰现象。限制是restriction,修饰 modification,所以把这一系统叫做：R/M体系。 限制与修饰是由两种酶引起的，一种是甲基转移酶，一种是核 酸内切酶。
限制与修饰存在两 方面的作用：一是 保护自身的DNA不 受限制，即不被切 割；二是破坏外源 DNA使之迅速降解。
种名 株系 编号 母。
（5）限制性核酸内切酶的特征
特异的识别序列、严格切割位点
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5′ … G C T G A A T T C G A G … 3′
3′ … C G A C T T A A G C T C … 5′
识别序列 与DNA的 来源无关
Cleavage sites
1 1
限制（Restriction）
基因工程的工具酶幻灯片
基因工程的工具酶 幻灯片
优选第二章基因工程的工具 酶
二. 寄主的限制和修饰现象
❖ 限制(Restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制 性内切酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌 体的寄主幅度受到限制。
❖ 限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维 和同尾酶连接的策略实现多基因片段的重组。 2. 同尾酶技术在构建疟疾多价重组DNA疫苗中的应用。
杂种位点（hybrid site）：由一对同尾酶分别产 生的粘性末端共价结合形成的位点。
由于切割的随机性， 不能得到目的片段。
Ⅲ型酶:
这类酶可识别特定碱基序列，并在这识别位点下游的 3’端 24~26 bp处切开DNA，所以它的切割位点也是没有特异性的。
Ⅱ型酶（重点）
★1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血d株中分离出来的限制酶。 ★分子量通常较小，只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在。反应 只需Mg2+的存在。 ★特点： （1）识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对 称结构上。 （2）许多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于 DNA片段的重组。
切割位点位于识别序列的
对称轴上，这样形式的断
裂切割是位形点成位具于有对平称末轴端的的两 D侧NA，片产断生，突不出易末重端新，环在化适。 当温度下，产生的末端可 以退火互补，重新连接。
5’ C C C G G G Sma I G G G C C C 5’
5’ C C C GGG
GGG C C C 5’
将双链DNA切断。 （DNA分子转化细胞：受体细胞去掉hsdR基因位点） 3） hsdM编码产物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位点 的碱基甲基化反应。 4） hsdS表达产物的功能是---协助限制性核酸内切酶和甲基 化酶，识别特殊的作用位点。
优选第二章基因工程的工具 酶
二. 寄主的限制和修饰现象
❖ 限制(Restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制 性内切酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌 体的寄主幅度受到限制。
❖ 限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维 和同尾酶连接的策略实现多基因片段的重组。 2. 同尾酶技术在构建疟疾多价重组DNA疫苗中的应用。
杂种位点（hybrid site）：由一对同尾酶分别产 生的粘性末端共价结合形成的位点。
由于切割的随机性， 不能得到目的片段。
Ⅲ型酶:
这类酶可识别特定碱基序列，并在这识别位点下游的 3’端 24~26 bp处切开DNA，所以它的切割位点也是没有特异性的。
Ⅱ型酶（重点）
★1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血d株中分离出来的限制酶。 ★分子量通常较小，只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在。反应 只需Mg2+的存在。 ★特点： （1）识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对 称结构上。 （2）许多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于 DNA片段的重组。
切割位点位于识别序列的
对称轴上，这样形式的断
裂切割是位形点成位具于有对平称末轴端的的两 D侧NA，片产断生，突不出易末重端新，环在化适。 当温度下，产生的末端可 以退火互补，重新连接。
5’ C C C G G G Sma I G G G C C C 5’
5’ C C C GGG
GGG C C C 5’
将双链DNA切断。 （DNA分子转化细胞：受体细胞去掉hsdR基因位点） 3） hsdM编码产物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位点 的碱基甲基化反应。 4） hsdS表达产物的功能是---协助限制性核酸内切酶和甲基 化酶，识别特殊的作用位点。
第二章基因工程中常用的工具酶
第二章 基因工程中常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA 分子的特异切割分子的特异切割DNA 甲基化酶—用于DNA 分子的甲基化分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA 和RNA 的连接的连接核酸聚合酶—用于DNA 和RNA 的合成的合成核酸酶—用于DNA 和RNA 的非特异性切割的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA 和RNA 的末端修饰的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
§2-1 核酸内切限制酶定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。
双链结构的核酸内切酶。
到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。
种以上不同的核酸内切限制酶。
核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）一 、限制修饰系统的种类（图）限制修饰系统的种类（图）二、 限制性内切酶的定义、命名1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II 型限制酶。
型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
例如：Hin d Ⅲ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae ，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
表示分离到的第三个限制酶。
Eco RI RI——Escherichia coli RI RI Hin d Ⅲ—Haemophilus influensae d ⅢSac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA 分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp 的地方可以随机地切割DNA 分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。
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同尾酶BamHI和BglII
AGATCT GGATCC
TCTAGA CCTAGG
BglⅡ
BamHI
A
GATCC
TCTAG
G
T4连接酶
AGATCC （连接后的切点均不能被上述两种酶切）
TCTAGG
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一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
1.三种活性 （1）5’-3’聚合酶活性（在有dNTP时） （2）3’外切酶活性 （无dNTP时大亚基活性） （3）5’外切核酸酶活性（无dNTP时小亚基活
温度
二、DNA分子的体外连接
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二、DNA分子的体外连接
1．粘性末端DNA片段的连接和单切点的 磷酸化
2．平末端DNA片段的连接
（1）T4DNA连接酶法 （2）同聚物加尾法
（3）用化学合成的衔接物连接DNA分子
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第三节 其他工具酶
一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）
1.RT-PCR 使mRNA逆转录成cDNA 2.制备探针。
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五、末端脱氧核苷酰转移酶
可催化DNA片段上的3’-OH端加接脱氧 核糖核苷酸。
常用于同种碱基多聚体接尾反应 核素标记DNA片段的3’端
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六、核酸酶S1
可以降解单链DNA和RNA
(1)将DNA切成平末端。有些限制性内切核酸酶 可可切以除将DDNNAA末切端成的粘单性链末。端生，成经平过末核端酸D酶NSA1。降解
EcoRⅠ切 GAATTC EcoRⅠ*切 pupuATpypy 或AATT
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第二节
DNA连接酶和DNA分子的 体外连接
一、DNA连接酶
DNA连接酶（Ligase）是一种能 够催化在双股DNA链的3′-OH和5′-P 之间形成磷酸二酯键的酶，可连接互 补粘性末端或平端以及缺口修复，不 能连接单链DNA或裂口.
3’-CTTAA G-5’
3’-CTTAA G-5’
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2.平末端 如:SmaⅠ
5’-CCC GGG-3’
3’-GGG CCC-5’
两种特殊的限制酶
(1)同尾酶 识别位点不同，酶切后产生同样的粘性末段的
两种酶。如：BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ
(2)同裂酶 识别序列相同，对甲基化切点敏感性不同的两
五、影响限制性内切酶活性的因素
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分类： Ⅰ Ⅱ Ⅲ
Ⅰ ：识别和切割位点不固定，随机性。 Ⅲ ：核酸内切酶活性和甲基化活性是 不分开的。 Ⅱ：能在识别位点处切割DNA，切割位 点固定。核酸内切酶活性和甲基化活性 是分开的。常用。
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四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性
识别序列 ：1.4~7个核苷酸组成的特定核苷酸序 列 2.回文结构：两个顺序相同的拷贝 在DNA链上呈反向排列。 EcoRⅠ 5 ’-G AATTC-3 ’ 3 ’-CTTAA G-5 ’
第一节
限制性核酸内切酶与DNA 分子的体切割
限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链 DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切 割DNA双链结构的核酸内切酶。 一、寄主控制的限制与修饰作用如图2-1，图22 二、限制性核酸内切酶的制备方法
三、限制性核酸内切酶分类和命名
四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性
种酶 。如:Mbo Ⅰ和Sau3AⅠ共同识别序列GATC ，但对 GmeATC切点,前者不能切，后者能切。
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五、影响限制性内切酶活性的因素
1.DNA的纯度 2. DNA的甲基化 （1）基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌 （2）研究基因工程DNA的甲基化程度 （3）改变限制酶的识别特性 3.温度 4.分子结构 5.限制酶的缓冲液 星号活性
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经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型
1.粘性末端
(1)3’-OH单链延伸的粘性末端.如：Pst Ⅰ
5’-CTGCA G-3’
5’-CTGCA G-3’
3’-G ACGTC-5’
3’-G ACGTC-5’
(2)5’-P单链延伸的粘性末端.如：EG AATTC-3’
三、T4DNA聚合酶 四、逆转录酶
五、末端脱氧核苷酰转移酶
六、核酸酶S1 七、核酸酶BAL31 八、外切核酸酶Ⅲ
九、T4多聚核苷酸激酶 十、碱性磷酸酶
十一、 甲基化酶
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命名
HindⅢ
H: Haemophilus 嗜血杆菌属 in: influenzae 流感 d: Rd株 Ⅲ：该菌株中第三个被分离到的限制酶
二、基因工程的基本程序
a b 剪切
b
载体质粒
A 外源DNA片段
A
b
外源DNA插入
引入宿 主细胞
选出含有重 组DNA的细 胞扩增表达
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第二章 基因工程中常用的工具酶
第一节 限制性核酸内切酶与DNA 分子的体外切割 第二节 DNA连接酶和DNA分子的 体外连接 第三节 其他工具酶
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性）
2.在基因工程中的应用 ：缺口平移标记技术。
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二、DNA聚合酶Ⅰ大片段 （Klenow酶）
1.DNA聚合酶活性 （切除小亚基，保留大亚基）
2. 3’外切酶活性（无dNTP时）
3. 在基因工程中的应用
（1）标记粘性末端. -32P—dNTP
标记平末端 -32P—dNTP
（2）将5’端伸出的末端填平
（3）可用来反转录合成双链cDNA。
（4）补平粘性末端。
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三、T4DNA聚合酶
具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶 活性。其外切酶活性比E.coli DNA聚合酶 I的活性高200倍。 取代反应
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四、逆转录酶
逆转录酶可以RNA为模板，逆转录成cDNA 第一链，又称依赖RNA的DNA聚合酶。 1.聚合酶活性 RNA或DNA为模板 2. 3’外切酶活性 能使DNA-RNA杂合链中的 RNA降解。 应用：
(2)切除cDNA中单链发夹状结构。反转录反应
合成的cDNA，可能形成单链发夹状结构，为
了得到平末端cDNA可用 无发夹结构的cDNA。
核酸
酶S1
分
解
，
生成
(3)可用 构。
核酸酶
S1
分析DNA·RNA
杂交
分
子的结
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十、碱性磷酸酶
该酶的功能是以单链或双链的DNA、 RNA为基质，将DNA或RNA片段5’端 的磷酸切除，产生5’-OH。