【学习课件】第二章基因工程中常用的工具酶

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同尾酶BamHI和BglII
AGATCT GGATCC
TCTAGA CCTAGG
BglⅡ
BamHI
A
GATCC
TCTAG
G
T4连接酶
AGATCC （连接后的切点均不能被上述两种酶切）
TCTAGG
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一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
1.三种活性 （1）5’-3’聚合酶活性（在有dNTP时） （2）3’外切酶活性 （无dNTP时大亚基活性） （3）5’外切核酸酶活性（无dNTP时小亚基活
二、基因工程的基本程序
a b 剪切
b
载体质粒
A 外源DNA片段
A
b
外源DNA插入
引入宿 主细胞
选出含有重 组DNA的细 胞扩增表达
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第二章 基因工程中常用的工具酶
第一节 限制性核酸内切酶与DNA 分子的体外切割 第二节 DNA连接酶和DNA分子的 体外连接 第三节 其他工具酶
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性）
2.在基因工程中的应用 ：缺口平移标记技术。
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二、DNA聚合酶Ⅰ大片段 （Klenow酶）
1.DNA聚合酶活性 （切除小亚基，保留大亚基）
2. 3’外切酶活性（无dNTP时）
3. 在基因工程中的应用
（1）标记粘性末端. -32P—dNTP
标记平末端 -32P—dNTP
（2）将5’端伸出的末端填平
第一节
限制性核酸内切酶与DNA 分子的体切割
限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链 DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切 割DNA双链结构的核酸内切酶。 一、寄主控制的限制与修饰作用如图2-1，图22 二、限制性核酸内切酶的制备方法
三、限制性核酸内切酶分类和命名
四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性
三、T4DNA聚合酶 四、逆转录酶
五、末端脱氧核苷酰转移酶
六、核酸酶S1 七、核酸酶BAL31 八、外切核酸酶Ⅲ
九、T4多聚核苷酸激酶 十、碱性磷酸酶
十一、 甲基化酶
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命名
HindⅢ
H: Haemophilus 嗜血杆菌属 in: influenzae 流感 d: Rd株 Ⅲ：该菌株中第三个被分离到的限制酶
1.RT-PCR 使mRNA逆转录成cDNA 2.制备探针。
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五、末端脱氧核苷酰转移酶
可催化DNA片段上的3’-OH端加接脱氧 核糖核苷酸。
常用于同种碱基多聚体接尾反应 核素标记DNA片段的3’端
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六、核酸酶S1
可以降解单链DNA和RNA
(1)将DNA切成平末端。有些限制性内切核酸酶 可可切以除将DDNNAA末切端成的粘单性链末。端生，成经平过末核端酸D酶NSA1。降解
五、影响限制性内切酶活性的因素
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分类： Ⅰ Ⅱ Ⅲ
Ⅰ ：识别和切割位点不固定，随机性。 Ⅲ ：核酸内切酶活性和甲基化活性是 不分开的。 Ⅱ：能在识别位点处切割DNA，切割位 点固定。核酸内切酶活性和甲基化活性 是分开的。常用。
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四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性
识别序列 ：1.4~7个核苷酸组成的特定核苷酸序 列 2.回文结构：两个顺序相同的拷贝 在DNA链上呈反向排列。 EcoRⅠ 5 ’-G AATTC-3 ’ 3 ’-CTTAA G-5 ’
温度
二、DNA分子的体外连接
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二、DNA分子的体外连接
1．粘性末端DNA片段的连接和单切点的 磷酸化
2．平末端DNA片段的连接
（1）Fra Baidu bibliotek4DNA连接酶法 （2）同聚物加尾法
（3）用化学合成的衔接物连接DNA分子
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第三节 其他工具酶
一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）
（3）可用来反转录合成双链cDNA。
（4）补平粘性末端。
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三、T4DNA聚合酶
具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶 活性。其外切酶活性比E.coli DNA聚合酶 I的活性高200倍。 取代反应
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四、逆转录酶
逆转录酶可以RNA为模板，逆转录成cDNA 第一链，又称依赖RNA的DNA聚合酶。 1.聚合酶活性 RNA或DNA为模板 2. 3’外切酶活性 能使DNA-RNA杂合链中的 RNA降解。 应用：
种酶 。如:Mbo Ⅰ和Sau3AⅠ共同识别序列GATC ，但对 GmeATC切点,前者不能切，后者能切。
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五、影响限制性内切酶活性的因素
1.DNA的纯度 2. DNA的甲基化 （1）基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌 （2）研究基因工程DNA的甲基化程度 （3）改变限制酶的识别特性 3.温度 4.分子结构 5.限制酶的缓冲液 星号活性
(2)切除cDNA中单链发夹状结构。反转录反应
合成的cDNA，可能形成单链发夹状结构，为
了得到平末端cDNA可用 无发夹结构的cDNA。
核酸
酶S1
分
解
，
生成
(3)可用 构。
核酸酶
S1
分析DNA·RNA
杂交
分
子的结
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十、碱性磷酸酶
该酶的功能是以单链或双链的DNA、 RNA为基质，将DNA或RNA片段5’端 的磷酸切除，产生5’-OH。
3’-CTTAA G-5’
3’-CTTAA G-5’
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2.平末端 如:SmaⅠ
5’-CCC GGG-3’
3’-GGG CCC-5’
两种特殊的限制酶
(1)同尾酶 识别位点不同，酶切后产生同样的粘性末段的
两种酶。如：BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ
(2)同裂酶 识别序列相同，对甲基化切点敏感性不同的两
EcoRⅠ切 GAATTC EcoRⅠ*切 pupuATpypy 或AATT
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第二节
DNA连接酶和DNA分子的 体外连接
一、DNA连接酶
DNA连接酶（Ligase）是一种能 够催化在双股DNA链的3′-OH和5′-P 之间形成磷酸二酯键的酶，可连接互 补粘性末端或平端以及缺口修复，不 能连接单链DNA或裂口.
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经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型
1.粘性末端
(1)3’-OH单链延伸的粘性末端.如：Pst Ⅰ
5’-CTGCA G-3’
5’-CTGCA G-3’
3’-G ACGTC-5’
3’-G ACGTC-5’
(2)5’-P单链延伸的粘性末端.如：EcoRⅠ
5’-G AATTC-3’
5’-G AATTC-3’