培养基模拟灌装验证培训

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其他取样试验： 1、管制注射剂瓶无菌试验：无菌操作，灌 装前中后段分别取10只无菌空瓶至已灭菌的样 品瓶中，加入培养基不少于100ml（培养基应 能浸没管制瓶），置20-25℃培养7天，置3035℃培养箱培养7天。 2、胶塞无菌试验：无菌操作，灌装前中后 段分别取10只洁净胶塞至已灭菌的样品瓶中， 加入培养基100ml置30-35℃培养箱培养14天。
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微生物侵入试验：
●目的：灌入培养基的西林瓶，在正常的生产线上压塞和压盖，然后将 西林瓶的密封面浸入高浓度运动性菌液中，取出，培养并检查是否有微生 物侵入，以确认西林瓶密封的完好性。 ●操作：用于密封性试验的样品100瓶与其它模拟灌装的产品在 23℃~28℃培养7天、30℃~35℃培养7天。所有样品培养14天均应不长菌， 再进行以下培养。 1、将轧盖密封性试验的样品80瓶，完全浸入大肠埃希菌Escherichia coli （≥106cfu/ml）菌液的容器中并加压到0.05~0.1Mpa，浸泡4小时后取出， 用乙醇（75%）消毒，并用适量的水清洗外表面3次。将得到的样品置于 30℃~35℃中培养14天，应无细菌生长。如果有细菌生长，需要鉴定细菌 的菌属，调查是否为浸入的细菌。（使用完毕的菌液经过灭菌后弃去） 2、将轧盖密封性试验的样品10瓶，每瓶接种大肠埃希菌 Escherichia coli （10~100cfu/ml），作为阳性对照，置于30℃~35℃培养3天，应有明显 细菌生长。
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微生物侵入试验（续）： 3、轧盖密封性试验的样品各取10瓶，不经处理，作为阴 性对照，置30~35℃培养14天，应无菌生长。 4、培养基培养结束后营养试验：将培养结束的没有微生物 生长的轧盖密封性试验的样品10瓶，接种试验菌（大肠埃希菌） 10~100cfu/m1，置30~35℃中培养3天，应有明显的细菌生长。 ●接受标准：只有前述各项均符合要求，且经菌液浸泡的 样品不得长菌，挑战试验才有效。如果挑战试验中有微生物生 长的现象，需要记录长菌的样品数，如果样品中出现长菌现象， 需要进一步调查长菌原因，检查瓶口或胶塞是否有缺损，造成 微生物侵入。如果任何挑战试验中长菌的样品，不是由于瓶口 或胶塞明显的物理性缺损所致，则挑战试验失败。
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抑菌风险分析（一）
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抑菌风险分析（二）
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抑菌风险分析（三）
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抑菌风险分析（四）
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接受标准：摘自《药品生产验证指南2003版》
泊松分布：95%可信限的控制上限（B）/ 模拟分装的瓶数*100%=污染率%
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结果的观察：
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注意事项： 在培养基灌装完成后，应对密封好的最终产品进 行检查。所有完好的灌装样品都应培养，对于与密封 性无关缺陷（如外观缺陷）的灌装样品也应进行培养， 不得剔除。有密封性缺陷的样品可作废品剔除，但应 当记录剔除数量和原因。 在培养过程中，任何发现损坏的样品也应列入培 养基灌装的批记录数据中。如果要将这类已培养的样 品从最后的结果判定计算中剔除，则必需充分说明理 由，并在培养基灌装报告中对偏差做出解释。假如难 以判断微生物污染是由损坏引起还是本身就存在，则 应进行调查以确定原因。
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最差条件举例： 1、使用的原料、设备、器具在灭菌后于无菌 工艺区保留时间超过期限。 2、超过灌装工艺所需的人员数量。 3、增加设备消毒完成到开始模拟之间的时间 间隔。 4、在工艺模拟实验中使用促生长的培养基或 安慰剂，而不是具有抑菌性的物料。 5、在最后的生产完成后进行无菌工艺模拟试 验。
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培养基灌装中止或失效：
如培养基促生长试验失败 在无菌生产区域的物理条件发生问题（如断 电、高效泄漏） 灌装过程中出现一些违反规程的操作，这些 操作可能造成批生产中止或报废 培养基灌装可能因为上述的任何一个或所有 类似其他原因造成失效，这些问题可能造成灌装 的中止或失效。 培养基灌装中止或失效的整台件均需要有详 细的说明记录（充分说明理由的支持性文件）。
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黄炼昌
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内容 1、培养基模拟灌装的目的 2、法规要求 3、冻干产品制剂工艺的培养基灌装（最差条件） 4、方案设计 5、风险分析 6、接受标准 7、偏差调查
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无菌工艺模拟试验定义： △无菌工艺模拟试验 Process Simulation Testing (PST) △培养基灌装 Media Fill 采用培养基代替药品进行无菌灌装对 无菌工艺进行验证。此模式工艺称之为 “培养基灌装”
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接受标准：摘自《药品生产验证指南2003版》
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接受标准：摘自EU-GMP
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接受标准：《无菌药品-药品GMP实施指南》
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结果的观察： 1、应每天检查灌装产品的长菌情况并准确记录。 2、应由经过培训并有检查培养基灌装瓶污染经验的人员 对样品进行逐个目视检查。 3、 当培养基灌装出现阳性结果时，不管是否符合合格标 准，都必须进行调查。 4、分离到的微生物应鉴别到种。调查过程中应详细分析 可能的产生阳性结果的原因。（菌种鉴定） 5、制定的CAPA需要针对污染的原因或不良无菌 操作行为。 6、对于超标的结果，应当在调查清楚原因后再次进行培 养基灌装。 7、评估工艺可靠性以及上市产品可能存在的风险。
●某些情况下厌氧菌培养基FTM
（硫乙醇酸盐培养基）
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方案设计： 、培养条件：（两个温度段一般相差10℃）
培养条件： 20-25℃条 件下培养7 天（培养真 菌）和在 30-35℃条 件下培养7 天（培养细 菌）
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培养条件（续）： ●足够的培养时间，以确保那些脆弱的或受损的微 生物也能得到恢复并增殖（不少于14天） ● 培养期间温度不超过20-35℃范围。 ● 如果用两个温度培养，从较低的温度开始，中 间要观察结果。 △每瓶（单元）容器在培养前和培养中间阶段都要 来回翻转，这样确保Biblioteka Baidu器的内表面和密封件（如胶塞） 内表面跟培养基完全接触。 方案设计：
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培养基无菌性试验： ●目的：证明用于模拟无菌灌装试验的培养基是 无菌的，以排除培养基无菌性对此项验证试验的影响， 从而确认模拟灌装试验中的污染来源于灌装过程。 ●前提条件： 除菌过滤前后，滤芯完整性测试结果>0.332MPa。 过滤压力为≦0.1MPa。 过滤持续时间≦8h。 除菌过滤前的微生物负荷≦10cfu/100ml。 ●接受标准：培养14天无菌应合格。
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培养基灵敏度试验：
●目的：确认培养基能满足微生物生长的需要，能检出污染 菌。 ●操作：从每批灌装好的培养基中随机抽取12支，按照中国 药典无菌检查法中的培养基灵敏度检查法，分别向培养基中接 入试验菌悬液（金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、 生孢梭菌、黑曲霉菌、铜绿假单胞菌），每个菌株接种两瓶灌 装培养基，每瓶接种量为10~100个菌。将接有上述微生物的培 养基置于相应温度下培养。 ●接受标准：每种菌株在7d内应至少有一瓶（50%）出现明 显生长，否则可复试一次。如果灵敏度检查结果不合格，该批 培养基灌装试验无效，须重新试验。
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方案设计：1、流程图：
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方案设计： 2、培养基： 选择： ●适应广谱微生物生长
（应能促进革兰阳、阴性菌；酵母菌和霉菌的生长）
●较好的澄清度，较小的粘度 ●可以采用可除菌过滤 ●常用培养基3%的TSB TSA?
（胰酪胨大豆肉汤培养基：浓度30mg/ml ）
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停滞实验： ●目的：表明用于培养的培养基是作用的。 ●操作：从每批培养结束没有染菌的培养 基中随机抽取60瓶做以下试验，每10瓶分别接 种<100cfu/0.1ml的金黄色葡萄球菌、铜绿假单 胞菌、生梭胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、枯 草芽孢杆菌，接种后盖塞，封口。金黄色葡萄 球菌、铜绿假单胞菌置、枯草芽孢杆菌 30~35℃培养7天，黑曲霉、白色念珠菌置 20~25℃培养7天，7天内所有接种的培养基均 出现明显的微生物生长。如果停滞试验检查结 果不合格，该验证无效，应重新验证。
最差条件：
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普遍存在的最差条件： 一、人员： 最多的人员数量 最多的人员类型（维修、QA、QC） 人员更衣后的最长洁净服、口罩、手套等 使用时间
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二、设备： 清洗、灭菌后最长保留时间 最快的分装速度（最小的规格西林瓶）-最 不易控制。 最慢的分装速度（最大的规格西林瓶）-最 长的单位产品暴露时间 设备最复杂的组装方式（组合件等）
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法规要求
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培养基模拟灌装的先决条件 ☻洁净室/设备的验证状态确认 ☻经过重大维修或变更后进行了生产线的 运行确认或性能确认 ☻参与培养基灌装的人员接受了培训
无菌操作 洁净室行为 培养基灌装方案
☻明文规定的工艺过程及最差条件
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最差条件： 在制药工艺验证时使用“最差条件” 是很有用的技术。使用“最差条件”是为 了挑战工艺可能出现在日常操作边缘的状 况。如果在最差条件，结果是可以接受的， 那么表明在正常日常条件下，系统就有更 高的可靠性。最差条件并不是说要人为地 创造一个可能导致环境超出允许操作条件 的或可能导致系统失效的情况。
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进行培养基模拟灌装的目的：
1、验证一个无菌工艺 对无菌工艺过程无菌保证水平的综合评价（包括设 备、人员、操作、灭菌过程、生产环境等） 2、对无菌操作人员进行资格确认 3、确认进行重大变更后对无菌工艺的影响 4、作为问题调查的手段（全程录像） 5、综合反映生产线整估的无菌保证情况，无法体现 具体某批产品或某个产品的无菌性。
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如何寻找最差条件：
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如何寻找最差条件：
鱼骨图： 使用鱼骨图方法是寻找最差条件的最简洁有力的 工具之一，我们可以通过人、机、料、法、环等各方 面过行分析可以找到最差条件发生的具体方面。 有时我们也会鱼骨图和FMEA联合使用。
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鱼骨图
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偏差调查内容：（至少应包括） 1、生产环境中微生物监测数据； 2、生产环境中悬浮粒子监测数据； 3、人员污染的监测数据； 4、高效过滤器的完整性检测、粒子、风速等； 5、操作间的空气流向、压差； 6、操作人员的操作方法、培训情况； 7、模拟分装过程中的异常情况； 8、无菌室生产工具及其他用品的存储状况； 9、鉴别污染微生物的种、属、以寻找污染源的线索； 10、无菌室的清洁、清洁规程的培训及执行情况；
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偏差调查内容（续）： 11、无菌生产用设备的控制系统和监测系统的校正； 12、生产前、生产后过滤器的完整性检测结果； 13、相关产品、相关生产过程存在的问题等。
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五、操作（固有干预和纠正干预） 最大数时的纠正干预,如：倒瓶、卡瓶、卡 塞、凋整针头（调整装量）、设备故障维修等。 最大数量的固有干预，如：物料转移（人 员越少，对应每个人移动次数越多）、添加物 料（如胶塞）、环境取样、产品转移，更换配 件等。
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五、操作（续） 生产过程的持续时间： 1、产品配制后到除菌过滤完成的时间 2、产品最长的灌装时间 3、冻干时间（模拟进出箱操作，气流运 动） 4、最长开放操作的持续时间等
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三、物料： 最大的容器（最长的单位产品暴露时间） 最小的容器（最快的分装速度、最不易控 制。） 工器具、洁净服、手套等灭菌后最长的保 留时间。 消毒剂配制后最长的保留时间。
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四、环境： 清洁灭菌后到无菌工艺开始前的最长时间。 最长的无菌工艺持续时间（环境维持时间）