应用巢式PCR方法检测牛支原体肺炎_李大伟

中国动物检疫2010年第27卷第4期

近年来，山东、湖北、湖南、重庆、贵州等１６个省发现了牛支原体肺炎疫情。经验证是由牛支原体引起的牛支原体肺炎，临床以呼吸系统症状为主，主要表现为发热、咳嗽、流鼻涕。犊牛和体质弱的牛发病严重，在不治疗的情况下死亡率可达４０％－８０％，部分病例出现关节炎，少数病例出现结膜炎；剖检病变主要集中在胸腔与肺部，肺和胸膜轻度粘连，有少量积液；心包积水，液体黄色澄清；肺部病变的严重程度在不同病牛表现出差异，与病程有关。严重者可见肺部广泛分布有干酪样或化脓性坏死灶，俗称“烂肺病”。我们已从发病牛场病牛肺组织中检测到了牛支原体特异性核酸片段，并分离到了牛支原体。排除了牛传染性胸膜肺炎（牛肺疫）感染的可能性。

在我国，牛支原体肺炎是一种新发传染病，近几年才有相关报道，具

体的流行情况和流行趋势还有待调

查。而且牛支原体存在牛体的下呼吸道，所以鼻腔粘膜和口腔内的病原含量很低，常规的检测方法很难做出检测。而我们建立的巢式ＰＣＲ检测方法，其敏感性是单一ＰＣＲ方法的１０３倍，并且具有鉴别牛肺疫和无乳支原体的特异性。可以用于活体检测和流行病学调查。1材料与方法

1.1对照菌株与病料丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体基因组由哈尔滨兽医研究所提供，阳性病料采自５省市５个典型的发病牛场。1.2主要试剂Ｔａｑ酶为宝生物工程（大连）有限公司产品，ＤＮＡＭａｒｋ－ｅｒ为天根生化公司产品，ｄＮＴＰｓ为ＭＢＩ公司产品，引物由上海生工合成。1.3主要仪器设备低温台式高速离心机为ＳＩＧＭＡ公司产品；ＹＹ２Ⅲ－８Ｂ稳压稳流型电泳仪为北京六一仪器厂产品，ＰＴＣ２００ＰＣＲ仪为ＢＩＯ－ＲＡＤ公司产品；凝胶成像系统为美国通用

电器公司产品。

1.4基因组提取病料经常规处理，采用ＤＮＡ提取试剂盒提取模板，购自上海华舜生物技术有限公司。1.5引物设计根据ＧｅｎＢａｎｋ发表牛支原体基因序列设计２对引物，扩增片段长度分别为１９１２ｂｐ、４２２ｂｐ。引物由上海生工合成。经高压灭菌超蒸水配制成５０ｐｍｏｌ／Ｌ，－２０℃保存。用时稀释成１００ｐｍｏｌ／Ｌ。

第一轮引物：Ｐ１：５'－ＴＴＴＴＡＧＴＣＴＴＴＴＴＧＡＡＣＡＡＡＴ－３'；Ｐ２：５'－ＧＧＣＴＣＴＣＡＴＴＡＡＧＡＡＴＧＴ－３'

第二轮引物：Ｐ３：５'－ＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＣＴＴＡＴＡＣＡＴＧＡＧＣＧＣ－３'；Ｐ４：５'－ＴＧＡＣＴＣＡＣＣＡＡＴＴＡＧＡＣＣＧＡＣＴＡＴＴＴＣＡＣＣ－３'

1.6巢式ＰＣＲ第一轮ＰＣＲ扩增２５ｕμＬ反应体系（模板２．５μＬ，引物各１μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ，ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，Ｔａｑ酶０．５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１５．５μＬ）经过优化试验得到

应用巢式PCR 方法检测牛支原体肺炎

李大伟1,2，张彦明2，黄灿平2，谢建华3，熊仲良3，冉智光3，关平原1，范伟兴2

（1．内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特011118；

2．中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266032；3．重庆市疫病预防控制中心，重庆渝北401100）摘要：根据G enbank 发表的牛支原体全基因序列，设计2对特异性引物，建立了诊断牛支原体肺炎的巢式PC R 方法，第一轮引物P1、P2扩增片段长度为1912bp,第二轮引物P3、P4扩增片段长度为422bp ：该方法特异性试验

未扩增出丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体特异性条带；敏感性试验证明扩增D

N A 最低含量达到10-7μg/m L ，是单一PC R 的103倍；用该方法对阳性病料进行检测，均扩增出特异性片段。该体系的成功构建，可以为牛支原体肺炎的活体检测，和流行病学调查提供技术支持。

关键词：牛支原体；巢式PC R ；活体检测

中图分类号：S852.62文献标识码：A 文章编号：1005－944X （2010）04－0028－02

A nested PCR method for detecting mycoplasma bovis pneumonia

LI Da-wei 1,2,ZHANG Yan-ming 2,HUANG Can-ping 2,XIE Jian-hua 3,

XIONG Zhong-liang 3,RAN Zhi-guang 3,GUAN Ping-yuan 1,FAN Wei-xing 1

(1.Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China;2.China Animal Health and Epidemiology Center,Qingdao 266032China;3.Chongqing Center for Animal Disease Control and Prevention,Chongqing 401120,China)

Abstract :Based on the reports and sequences published in Genbank,two pairs of specific primers were designed according to the conservative compass.The primers were designed for the establishment of the nested PCR.The amplificated product of primer P1and P2was about 1912bp,and the amplificated product of primer P3and P4was about 422bp.The specific tests showed that no fragment while detecting Mycoplasma mycoides subsp.mycoides small Colony Type and Mycoplasma agalactiae.Results of sensitivity showed the detection limit of this method was 10-7ug/ml.Au positive samples were amplified with this method.This specific and sensitive method is suitable for the detection of living body Mycoplsma bovis pneumonia and gived proofs for the research of epidemiological analysis.Key words :Mycoplsma bovis;nested-PCR ；detection of living body

本栏目主持人：胡藕祥zgdwjy@

通讯作者：关平原

试验研究

－28－