应用巢式PCR方法检测牛支原体肺炎_李大伟

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支原体pcr检测方法

支原体pcr检测方法支原体PCR检测方法。

支原体是一类细菌，可以引起多种感染性疾病，如支原体肺炎、支原体性关节炎、支原体性尿道炎等。

支原体感染对人体健康造成威胁，因此及时准确地检测支原体感染至关重要。

PCR（聚合酶链式反应）是一种高灵敏度的检测方法，已被广泛用于支原体的检测。

首先，准备样本。

支原体PCR检测的样本通常为患者的呼吸道分泌物、尿液、生殖道分泌物等。

收集样本时，需注意避免污染，保证样本的纯净度和完整性。

其次，提取DNA。

支原体是一种细菌，其遗传物质为DNA。

因此，在进行PCR检测前，需要从样本中提取支原体的DNA。

DNA提取的关键在于保证提取的DNA完整，避免污染和降解。

接下来，进行PCR反应。

PCR反应是在特定的温度条件下，通过DNA聚合酶将DNA扩增成百万甚至亿倍。

在PCR反应中，需设计特异性的引物，以确保扩增的是支原体的DNA而非其他微生物的DNA。

PCR反应的条件和参数需要严格控制，以确保扩增的准确性和稳定性。

最后，进行PCR产物的检测。

PCR反应后，得到的产物可以通过凝胶电泳、实时荧光定量PCR等方法进行检测。

凝胶电泳可以直观地观察PCR产物的大小和数量，而实时荧光定量PCR则可以定量地检测PCR产物的数量。

通过检测PCR产物，可以判断样本中是否存在支原体感染，以及感染的程度。

总的来说，支原体PCR检测方法具有高灵敏度、高特异性、操作简便等优点，已成为支原体感染检测的重要手段。

然而，在进行支原体PCR检测时，需严格控制实验条件，避免污染和假阳性结果的产生。

同时，对PCR产物的检测也需要选择合适的方法，以确保结果的准确性和可靠性。

希望本文介绍的支原体PCR检测方法能够为相关人员提供参考，帮助他们更好地开展支原体感染的检测工作。

牛支原体肺炎流行RT-PCR方法的初步诊断

显示，牛支原体阳性样品７份，牛生殖道支原体、牛眼支原体和牛丝状支原体全部为阴性；测序结果显示，所测样品核酸序列与牛
支原体和无乳支原体核酸序列都具有很高的同源性。对核酸序列进行遗传进化树分析表明，相对于无乳支原体而言，所测核酸序
２３序列比对结果．
天气、通风不良、度拥挤、输等将加剧病情［过运习。患有牛支原体的病牛可通过鼻腔分泌物排出牛
支原体，健康牛可通过近距离接触病牛而感染发病。
牛支原体在环境中存活力差，但在无阳光情况下可存活数天，如４℃下可在海绵中或牛奶中存活２个月，或水中存活２周以上；０℃存活ｌ２周，或３２￣７℃存
１３方法．
ｐ，Ｖ０５ｐ，ＬＭＬ．Ｌ上游引物（Ｍ）Ｌ下游引物２２ｐ１，０
（０ｐ２Ｍ）１ｐＲｎｓｒｅＨＥ１．５ｐＬ，ａｅｆｅＯ４１Ｌ。
反应程序：首先４２℃ ４ｉ；０ｍｎ接着９５℃变性３ｍｉ；然后９ｎ４℃ ３，５℃ ４，２℃ ４３个循０５ｓ０ｓ７０，５ｓ
１３２ＩＡ提取．．
主要特征的呼吸道传染病，病牛出现咳嗽，食欲不振，消瘦等症状，有的病牛出现继发性关节炎或腹泻［］１。－２
本实验室对山东某一牛交易市场部分牛群进行鼻腔棉拭子采样，采用ＰＲ方法对引起牛发生类似症状Ｃ的主要支原体进行了检测。

支原体PCR检测方法的建立和应用

ｉｆｎｉｓｈｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）ｗｅｒｅ１００％．ＴｈｉｓｍｅｔｈｏｄｃａｎｇｒｅａｔｌｙｒｅｄｕｃｅｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆＭｙｃｏｐｌａｓｍａｉｎｖａｃｃｉｎｅ
２０１３，４７（５）：１９— ２２／巢伟，等
中国兽药杂志
・１９・
支原体ＰＣＲ检测方法的建立和应用
巢伟，张桂红，徐雷
（湖南省中岸生物药业有限公司，长沙４１０１００）
［收稿日期］２０１２— ０９一ｌ３［文献标识码］Ａ［文章编号］１００２—１２８０（２０１３）０５— ００１９—０４［中图分类号］￥８５２．６２
视法对其进行检测，而且它对细胞的生长率影响较小，不易引起注意。目前已有多种方法可检测细胞
界分布十分广泛。细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是世界性问题。国内外研究表明，目前
已知的２０多种细胞污染支原体中，９５％的的来源于口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、发酵支原体、莱氏无胆甾原体。支原体感染发生后能改变细胞的ＤＮＡ／ＲＮＡ及蛋白表达，但不能通过可
［摘

西昌某牛场疑似牛支原体肺炎RT-PCR方法的诊断

ｐＤ１ — ＶｅｔｒＭ８— ＴｃｏｌＬｕ
样品采自西吕市某牛场，共采集４，份全部为鼻腔棉拭子。其中，份肺炎病牛样品，份临床健康２２
牛样品。１２酶、剂和主要仪器．试
ＰＲ扩增产物Ｃ
ｄｄＨ２ＯＳｌｔｏｏｕｉｎＩ
西昌某牛场疑似牛支原体肺炎Ｒ — ＣＴＰＲ方法的诊断
尹灿友
（昌市西乡乡畜牧兽医站，西四川西昌６５１）１０３
【摘要】应用Ｒ－Ｃ方法对西昌市某牛场采集的２ＴＰＲ份疑似牛支原体肺炎鼻腔拭子进行检测，显示，样品均扩结果两份增出预期大小（０ｂ）Ｎ３０ｐ的ＤＡ片段。将其纯化回收、克隆、测序，结果表明，两份样品均与ＧｎａｋｅＢｎ中牛支原体（ｙｏｌｓａＭｃｐａｍ
２结果与分析
２１Ｒ — ＣＲ扩增结果．ＴＰ
两份病牛鼻腔拭子经Ｒ —ＣＴＰＲ扩增出预期约
物Ｐ：’ＣＴＡＧＴＧＡＣ ¨ＴＣ一 ’ ２５一ＧＣＡＧＡＣＴＡｒ３。提交上
３０ｐ０ｂ片段，临床健康牛及空白对照无条带出现，具体见图１。
ｂｖｓ１ＳＲＡｏｉ）６ｒＮ序列（ｅＢｎ登录号：Ｆ３７４同源性为９％牛支原体可能是导致牛发生肺炎的原因之一。ＧｎａｋＡ３２５）９；
【关键词】牛支原体； — Ｃ；ＲＰＲ诊断Ｔ【中图分类号Ｉ８８３．【ｓ５．６２３文献标识码】【Ａ文章编号】６３１９（０００—０２０１７—８１２１）１０２—２

应用巢式POR方法检测牛支原体肺炎

Ａｂｔ￣：ＢａｅｎｔｅｒｐｒｎｅｕｎｅｕｌｈｄｎｓｒａｓｄｏｈｅｏｔａｄｓｑｅｃｓｐｂｉｅｉＧｅｂｎ，ｔａｒｆｓｅｉｃｒｍｅｓｗｅｅｄｓｎｄａｃｒｉｇｓｓｎａｋｗｏｐｉｏｐｃｆｐｉｒｒｅｉｅｃｏｄｎｓｉｇ
ＸＩＯＮＧｏｇｌｎ３ＡＮｈ — ｕｎＺｈｎ — ａｇ，ＲｉＺｉａｇ，ＧＵＡＮｉｇｙａＡＮｅ— ｉｇｇＰｎ — ｕｎ，ＦＷｉｘｎ
（．ＩｎｒＭｏｇｌｒｕｔｒｌＵｉｅｓｙＨｈｏ１０８Ｃｉａ．ＣｉａＡｉｌＨａｔａｄＥｉｅｏｏｙＣｎｅｉｇａ１ｎｅｎｏｉＡｇｉｌａｎｖｒｔ，ｕｈｔ００１，ｈｎ；ｈｎｎｍａｅｌｎｐｄｍｉｌｇｅｔｒｎｄｏａｃｕｉ２ｈ，Ｑ
ｓｏｄｔａｏｆａｍｅｔｗｈｌｄｔｃｉｇＭｙｏｌｓｃｉｅｕｓ．ｃｉｅｍａｌＣｏｏｙＴｐｎｙｏｌｓｇｌｅｉｅｈｗｅｔｎｒｇｎｉｅｅｔｃｐａｍａｍｙｏｄｓｓｂｐｍｙｏｄｓｓｌｈｅｎｌｎｙｅａｄＭｃｐａｍａａａａｔ．ａＲｅｕｔｆｓｎｉｖｔｓｏｄｔｅｅｅｔｎｌｔｏｈｓｍｅｈｄｗａ１ ‘ ｇｍ１ｓｌｏｅｓｔｉｓｉｙｈｗｅｈｄｔｃｉｉｆｔｉｔｏｓ０７／．Ａｕｏｉｖａｌｓｏｍｉｕｐｓｔｅｓｍｐｅｗｅｅｍｐｉｅｔｈｓｉｒａｌｄｗｉｔｉｉｆｈ

牛支原体和牛病毒性腹泻病毒二重二温式PCR检测方法的建立

牛支原体和牛病毒性腹泻病毒二重二温式PCR检测方法的建立谢志勤，范　晴，谢芝勋，张民秀，谢丽基，黄娇玲，张艳芳，曾婷婷，王　盛，罗思思，邓显文，李　孟，李　丹，刘加波（广西壮族自治区兽医研究所，广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁，　530001）摘　要：为建立一种牛支原体（Mycoplasma bovis，MB）和牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）的快速鉴别诊断方法，针对MB的uvr C基因和BVDV的5'端非编码区（5'-UTR）保守基因序列，分别设计两对特异引物，并将三温式PCR扩增程序简化为二个温度梯度，建立了鉴别MB和BVDV的二重二温式PCR方法。

该方法能同时扩增MB和BVDV，扩增产物大小分别为412和170 bp。

特异性试验结果显示，该方法对参试的所有毒株只扩增MB和BVDV基因组，对其它牛病原体无扩增；敏感性试验结果显示，该方法最低能同时检测到104拷贝的两种目的核酸；干扰性试验结果显示，该方法能同时检测两个模板不同浓度的组合，试验结果不受模板影响。

综上，本研究所建立的二重二温式PCR方法特异、敏感、快速、简便，可应用于MB 和BVDV临床鉴别诊断和流行病学调查。

关键词：二重二温式PCR；牛支原体；牛病毒性腹泻病毒；检测中图分类号：S854.43 文献标识码：A 文章编号：1005-944X（2019）01-0070-06DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2019.01.018Development of Two-temperature Duplex PCRfor Detection of Mycoplasma bovis and Bovine Viral Diarrhea VirusXie Zhiqin，Fan Qing，Xie Zhixun，Zhang Minxiu，Xie Liji，Huang Jiaoling，Zhang Yanfang， Zeng Tingting，Wang Sheng，Luo Sisi，Deng Xianwen，Li Meng，Li Dan，Liu Jiabo（Guangxi Veterinary Research Institute，Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Nanning，Guangxi　530001，China）Abstract：In order to establish a rapid identiﬁcation and detection method for Mycoplasma bovis（MB）and bovine viral diarrhea virus（BVDV），two pairs of specific primers were designed based on the conserved sequences of MB uvrC gene and BVDV 5'-UTR，and a new modified two-temperature duplex PCR was developed from three-temperature conventional PCR. According to the results，the developed assay could amplify the genes of both MB and BVDV simultaneously，and the PCR products were 412 bp for MB and 170 bp for BVDV，respectively. The speciﬁcity test results showed no cross-reaction with other bovine pathogens was observed. The sensitivity test results showed that the detection limit was 104 copies of nucleic acids of two target genes. The interference test results showed the combination of different concentrations of the two templates could be detected by the method，and the experimental results were not affected by the template concentrations. In conclusion，the developed two-temperature duplex PCR assay was speciﬁc，sensitive，rapid and simple，and it could be applied in differential diagnosis for clinical samples and epidemiological investigation.Key words：two-temperature duplex PCR；Mycoplasma bovis；bovine viral diarrhea virus； detection收稿日期：2018-10-30修回日期：2018-11-23基金项目：广西科技重大专项（桂科AA17204057）；广西科技重点研发计划（桂科AB16380003）通信作者：谢芝勋2019年第36卷第1期牛支原体（Mycoplasma bovis，MB）和牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）都能引起牛呼吸系统疾病。

牛支原体双重PCR检测方法的建立

牛支原体双重PCR检测方法的建立牛支原体（Mycoplasma bovis）是一种常见的病原微生物，它引起的牛支原体感染常导致牛的呼吸道疾病、乳腺炎、关节炎等严重疾病。

牛支原体感染对养殖业造成的经济损失巨大，因此快速和准确地检测牛支原体感染对于疾病的防控和治疗至关重要。

目前常用的检测方法包括传统培养法、血清学检测、PCR等。

然而，传统培养法需要耗费大量时间，并且易受外界因素的影响，血清学检测虽然能够快速检测，但存在较高的假阳性和假阴性率。

相比之下，PCR技术具有快速、敏感、特异性高等优点，成为目前牛支原体检测的主要方法。

为了建立牛支原体双重PCR检测方法，首先需要设计引物。

引物的设计是检测方法成功与否的关键因素。

牛支原体是一种细菌，其基因组中有多个可作为靶标的基因。

在选择引物时，需要选择高保守性的基因片段，以确保检测方法的特异性。

常用的靶基因包括16S rRNA基因、Hsp70基因等。

通过比对和分析多个牛支原体菌株的基因序列，可以筛选出适合的引物对。

根据选定的引物对，可以进行PCR反应。

首先，需要提取牛支原体的DNA。

这可以通过采用商业DNA提取试剂盒或传统方法来实现。

提取到的DNA需要进行定量和质量检测，确保反应中的DNA含量和质量的稳定性。

在进行PCR反应之前，需要确定PCR反应体系的组成和优化。

反应体系包括引物、DNA模板、dNTPs、酶、缓冲液等。

反应温度和时间的选择对于PCR反应的成功与否至关重要。

根据引物的碱基组成和长度，可以选择合适的退火温度和延伸时间。

为了最大限度地提高PCR反应的特异性和敏感性，可以尝试不同的反应条件，包括酶浓度、Mg2+浓度、嵌套PCR等。

PCR反应结束后，可以利用琼脂糖凝胶电泳等方法进行PCR产物的分析。

通过与已知大小的DNA标准物进行比较，可以确定PCR产物的大小。

可视化的PCR产物可以通过染色剂（如EtBr）染色，然后在紫外光下观察。

此外，也可以使用进一步的分子生物学技术，如测序或限制性酶切等方法来确认PCR产物的准确性。

巢式PCR在动物疫苗支原体污染检测中的应用

ｓａｍｐｌｅ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｈａｓｆａｓｔ，ｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｇｏｏｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｗｈｉｃｈｃａｎｏｆｆｅｒａｔｅｃｈｎｉｃａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
学术研究
ｄｏｉ：ｌＯ．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１９
巢式ＰＣＲ在动物痘苗支原体污染检测中的应用
蒙业军
（广西正康种猪有限公司广西柳州５４５００２）
ｏｒｆｄｅｃｔｉｏｎｏｆＭｙｃｏｐｌａｓｍａｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｖａｃｃｉｎｅｃｕｌｔｕｒｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ；ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅ；ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｐｌｉｆｉｅｄｓｐａｃｅｒｒｅｇｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎ１６Ｓａｎｄ２３ＳｒＲＮＡｇｅｎｅｏｆＭｙｃｏｐｌａｓｍａ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｕｌｔ，ｗｅｃａｎｄｅｔｅｃｔｃｏｍｍｏｎＭｙｃｏｐｌａｓｍａｓｐｅｃｉｅｓｗｈｉｃｈｃａｕｓｅｃｅｌｌｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｂｙｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄ，ｗｅｄｅｔｅｃｔｅｄｏｆｔｈｒｅｅｂａｔｃｈｅｓｏｆｓａｍｐｌｅｓａｎｄｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｓ，ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｐｅｃｉｉｆｃｔａｒｇｅｔｂａｎｄｓ，ｓｈｏｗｅｄｔｈｅｔｈｒｅｅｂａｔｃｈｅｓｏｆｖａｃｃｉｎｅｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｎｅｇａｔｉｖｅｆｏｒｍｙｃｏｐｌａｓｍａ．Ｔｈｅｒｅｗａｓａ２００－４００ｂｐｓｐｅｃｉｉｆｃｔｒｇａｅｔｂａｎｄｉｎｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ

牛支原体研究现状

行治疗如环丙沙星、泰妙菌素等。接种疫苗是防
２１年第３饲料博览４７０１期
治本病有效的方法，但目前我国还没有商品化的
疫苗。
３遗传稳定性 ’
苗具有重要意义，也对临床有效防治牛支原体病，保障养牛业的健康、快速发展具有重要意义。
支原体全菌蛋白作包被抗原的间接ＥＩＡ是最主ＬＳ
要的血清学检测方法；特异性ＰＲ可以对牛支原Ｃ体进行检测，但因牛支原体与牛无乳支原体有很高的同源性，早期采用ＰＲ扩增是很难区分，且套Ｃ式ＰＲ检测敏感性是一般ＰＲ的１，故目前ＣＣ０倍
【７］石磊，龚瑞，尹争艳，肉牛传染性牛支原体肺炎流行的初步等．
诊断｝Ｊ华中农业大学学报，０８２（：７．Ｊ．２０，７４）５２
【］ＫｓｕａＬＪｊｎｙＢｒｓ．ｎｒａｉｒｖｌｃｆｙ８ｕｉｋ，ｏｅｉｉ，ＦｉＦＩｃｅｓｇｐｅａｅｅｏ — ｌｉＮｎｎｍｃｐａｍａｂｒｎＤｎｓａｔ］．ｔＶｔＳａｄ２０，１ｏｌｓｏｉｉａｉｃｔｅ］Ａｅｅｅｎ，００４：ｓｈｌＪａ
分离物可直接从受感染牛的肺病灶中获得，也可以从受感染牛的淋巴结组织中获得。由于缺乏细胞壁，故对外界环境的抵抗力与细菌等其他原核细胞型微生物有较大的区别，对热的抵抗力与细菌相似，对高温敏感，随着温度的升高存活力下降，６ｌ２ｍｉ、７５Ｃｎ０℃ １ｍｉＣｎ即可失活，但４～

一种快速直接PCR检测牛肺炎支原体的试剂盒及其应用[发明专利]

专利名称：一种快速直接PCR检测牛肺炎支原体的试剂盒及其应用
专利类型：发明专利
发明人：徐引弟,李海利,王治方,朱文豪,张青娴,焦文强,郎利敏,王克领,索延乐,宋振宇
申请号：CN201710089520.8
申请日：20170220
公开号：CN106811527A
公开日：
20170609
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种试剂盒及其应用，尤其涉及一种快速直接PCR检测牛肺炎支原体的试剂盒及其应用，属于生物技术领域。

本发明的试剂盒包含以下试剂：PCR扩增试剂，阳性对照和阴性对照。

该试剂盒能快速、准确的检测出牛肺炎支原体。

应用时，可对牛支原体肺炎感染的单个样品检测，也可对临床病例中混合感染的检测，可用于牛肺炎支原体普查、分子流行病学调查及疫苗筛选和监测。

申请人：河南省农业科学院畜牧兽医研究所
地址：450002 河南省郑州市金水区花园路116号
国籍：CN
代理机构：南京苏科专利代理有限责任公司
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牛支原体病PCR检测方法的建立及初步应用

贵州农业科学2019,47(5):66〜69Guizhou Agricultural Sciences［文章编号］1001-3601(2019)05-0160-0066-04 Animal Husbandry・VeteFinary・Fishery・Resource Insect牛支原体病PCR检测方法的建立及初步应用吴位玮1，徐景峨1，余波1*，张涛1，余国富$，杨莉1，冯明祥彳，孙启跃刘镜黄波杨茂生姜玲玲1(1.贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵州贵阳550005；2.清镇市动物疫病预防控制中心，贵州清镇551400；3.贵州省关岭自治县畜牧服务中心，贵州关岭561300)［摘要］为快速确诊肉牛牛支原体病，根据牛支原体OPPD/F基因序列设计1对引物，通过反应条件的优化，建立牛支原体PCR诊断方法。

结果表明：该方法可从牛肺、鼻拭子临床样本和其临床样本的培养物中直接检测到牛支原体病病原核酸，该方法可检测的病原核酸最小浓度约为1X1CT7yg,整个检测过程仅需3.5h。

该方法具有快速、灵敏性高、特异性强等特点，对牛支原体感染的诊断、防治与预后评估具有重要意义。

［关键词］牛支原体;OPPD/F基因；PCR［中图分类号］Q953+.3；S856［文献标识码］AEstablishment and Preliminary Application of PCR Assay for theDetection of Mycoplasma bovinaWU Weiheng1,XU Jingle1,YU Bo1*,ZHANG Tao1,YU Guofu2,YANG Li1,FENG Mingxiang3, SUN Qiyue1,LIU Jing1,HUANG Bo1,YANG Maosheng1JIANG Lingling1(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Guizhou Academy of Agricultural Sciences,Guiyang,Guizhou550005； 2.Animal Disease Control and Prevention Centre of Qingzhen City,Qingzhen,Guizhou551400；3.Animal Husbandry Service Center of Guanling Autonomous County in Guizhou Province,Guanling,Guizhou,561300,C加加)Abstract:To rapidly diagnose Mycoplasma bovinain beef cattle,a pair of primers were designed according to the OPPD/F gene sequence of M.bovina,and the PCR diagnosis method of M.bovina was established by optimizing the reaction conditions.Results：The method could detect the pathogenic nucleic acid of M.bovina directly from the clinical samples of bovine lung and nose swabs and the culture of the clinical samples.Minimum detectable concentration was1X10-7ptg?and the detecting time was 3.5h.It was concluded that the established PCR assay was rapid,highly specific and sensitive?which could be important in disease diagnosis9control applications and prognostic estimation of M.bovina・Key words:Mycoplasma bovina；OPPD/F Gene；PCR牛支原体是危害养牛业的一种主要致病性支原体，除能导致牛肺炎、乳腺炎、关节炎外，还导致眼结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种疾病工O 1961年,美国人HALE⑵首次从患乳腺炎的牛乳中分离得到牛支原体,1976年报道其与牛呼吸系统疾病有关。

巢式PCR在动物疫苗支原体污染检测中的应用____

支原体污染是动物疫苗特别是动物细胞苗研制过程中的一个十分棘手的问题，给动物疫苗生产企业带来不小的损失。

支原体的种类较多，据报道常见的有：发酵支原体（M.fermentans）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）、口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）和莱氏无胆甾原体（Acholeplasma laid-lawii）占支原体污染的98%[1]，唾液支原体（M.sali-varium）、人型支原体（M.hominis）和梨型支原体（M. pirum）也是较为常见的污染菌[2]。

在细胞苗的研制过程中，由于细胞培养是一个长期动态的过程，给支原体污染控制带来很大的困难。

细胞培养物中的支原体污染如果不能及时被发现，会给疫苗生产企业带来很大损失。

常用的支原体检测方法有：形态学检查、支原体培养、抗原检测、血清学方法和分子生物学方法等。

一般来说，前面几种方法要么灵敏度不够而导致检出率不高，要么只能用于某种特定支原体的检测而导致适用谱较窄。

建立在分子生物学基础上的PCR检测法，目前国内外有相当多的报道，有专一性检测某种支原体的方法和广谱性检测多种支原体的方法。

由于常见的支原体种类较多，本文参考有关文献[3]的方法，经过多次试验试图建立一种广谱、高度灵敏、特异性强的巢式PCR检测doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2013.07.009巢式PCR在动物疫苗支原体污染检测中的应用蒙业军（广西正康种猪有限公司广西柳州545002）摘要：在动物疫苗研制过程中，应用巢式PCR方法，设计两套引物，扩增支原体16S与23S rRNA基因间隔区序列，可以检测造成细胞污染的常见支原体种类。

本试验应用该方法检测三批样品和阴性对照均无特异性目标条带，即三批疫苗样品支原体检测均为阴性。

阳性对照样品在200~400bp之间出现特异性目标条带，实验表明所建立的巢式PCR方法是一种快捷、灵敏、准确的检测方法，可以用于检测动物疫苗细胞培养物中支原体污染。

巢式PCR技术检测生殖道致病性支原体的临床应用

巢式PCR技术检测生殖道致病性支原体的临床应用王伟平;闫李侠;张仙森【期刊名称】《检验医学》【年(卷),期】2010(025)011【摘要】目的探讨巢式酶链聚合反应(PCR)技术快速检测泌尿生殖道致病性支原体在临床上的应用.方法以支原体16S～23S保守区域基因为扩增靶序列设计通用引物,采用巢式PCR方法扩增微小脲原体(Up)、解脲脲原体(Uu)、生殖支原体(Mg)和人型支原体(Mh)4种支原体.结果巢式PCR检测灵敏度高于一步PCR(χ2=5.857,P<0.05),巢式PCR扩增出4种支原体的标准株,对1份生物样品可同时检测出4种致病性支原体,避免了误诊、漏诊,提高诊治效率.结论巢式PCR技术能快速、敏感、准确检测出Up、Uu、Mg和Mh引起的单一感染和混合感染,对于临床感染性尿道炎的早期诊断有重要意义.【总页数】4页(P875-878)【作者】王伟平;闫李侠;张仙森【作者单位】温州医学院附属台州市第一人民医院检验科,浙江台州,318020;温州医学院附属台州市第一人民医院检验科,浙江台州,318020;温州医学院附属台州市第一人民医院检验科,浙江台州,318020【正文语种】中文【中图分类】Q503【相关文献】1.PCR技术检测泌尿生殖道生殖支原体(MG)感染的研究 [J], 李明成;黄键文;王丽华2.FQ-PCR技术检测女性生殖道沙眼衣原体、解脲支原体感染 [J], 段建平;艾军;李琰;贺延红3.PCR技术在泌尿生殖道支原体检测中的应用 [J], 吴移谋4.PCR技术检测生殖道分泌物的解脲支原体的初步研究 [J], 徐继琴5.巢式PCR技术检测泌尿生殖道标本中沙眼衣原体的研究 [J], 朱伟严;吴移谋;黄澍杰;尹卫国;余敏君因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

巢式PCR-RFLP法检测奶牛隐孢子虫及虫种鉴定

巢式PCR-RFLP法检测奶牛隐孢子虫及虫种鉴定曾晓华;陈铁桥;王权;李建;李安平【期刊名称】《畜牧与兽医》【年(卷),期】2008()4【摘要】采进口奶牛粪样200份,收集每份样品中的卵囊液,采用巢式PCR检测隐孢子虫(Cryptosporidium)18S rRNA基因,并用RFLP进行虫种鉴定,将目的片段克隆到pEGM-T easy vector,测序并进行同源性分析以进一步佐证虫种鉴定结果。

结果表明,进口奶牛隐孢子虫阳性率为3.5%(7/200),514bp的目的片段不能被EcoT14 Ⅰ酶切。

测序分析表明,获得的18S rRNA基因序列与NCBI上公布的微小隐孢子虫(C.parvum)相应序列同源性高达99.4%~100%,与安氏隐孢子虫(C.andersoni)同源性仅为91.1%。

说明进口牛粪样中检测出的隐孢子虫为微小隐孢子虫。

【总页数】4页(P15-18)【关键词】隐孢子虫;巢式PCR-RFLP;奶牛粪便【作者】曾晓华;陈铁桥;王权;李建;李安平【作者单位】湖南农业大学动物医学院;中国农业科学院上海兽医研究所;上海出入境检验检疫局【正文语种】中文【中图分类】S858.23【相关文献】1.应用巢式PCR-RFLP方法鉴别我国常见的几种隐孢子虫 [J], 李巍;张西臣;李建华;李淑红;宫鹏涛;杨举2.18S rRNA基因巢式PCR-RFLP分析两株牛源隐孢子虫分离株 [J], 刘晖;袁忠英;沈玉娟;冯耀宇;曹建平3.应用巢式PCR-RFLP方法鉴别微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫和火鸡隐孢子虫的研究 [J], 姚龙泉;张西臣;Lihua Xiao;李建华;尹继刚4.牛源隐孢子虫上海分离株的巢式PCR鉴定 [J], 袁忠英;沈玉娟;曹建平;刘晖;陈盛霞5.隐孢子虫SSU rRNA基因的巢式PCR-RFLP分析 [J], 姚龙泉 ;张西臣 ;Lihua Xiao ;吴涛 ;李建华 ;尹继刚因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

牛支原体快速PCR检测方法的建立r及其应用

牛支原体快速PCR检测方法的建立r及其应用徐引弟;李海利;王治方;张青娴;索延乐;宋振宇【期刊名称】《中国奶牛》【年(卷),期】2017(0)6【摘要】The aim of this study was to develop a rapid and direct PCR method to detect Mycoplasma bovis from diseased materials. A pair of primers were designed according to the sequence of 16S rRNA gene of Mycoplasma bovis, and the system of direct PCR amplification was prepared. After simple treatment, the samples were added into the system for amplification and electrophoresis. A 1390 bp fragment was amplified, and the specificity and sensitivity were tested. The results showed that the method was specific and sensitive. The method was applied to detect clinical samples, and the detection rate was 100% conform with the traditional PCR. The method can directly detect Mycoplasma bovis from clinical samples and can be used for the detection of a large number of clinical samples of Mycoplasma bovis.%本试验旨在建立一种可直接从病料中快速检测牛支原体的PCR方法,并且应用于临床.根据牛支原体16S rRNA基因设计一对引物,配制PCR扩增体系,样品经简单处理后加入体系进行扩增,最终扩增出1390bp片段,进一步的试验证明该方法具有良好的特异性和敏感性.临床样品检测结果显示,该方法的检出率与传统PCR的符合率为100%.试验表明,该方法能快速直接从临床样品中检测出牛支原体,可用于牛支原体的大量临床样品的检测.【总页数】4页(P41-44)【作者】徐引弟;李海利;王治方;张青娴;索延乐;宋振宇【作者单位】河南省农业科学院畜牧兽医研究所,郑州 450002;河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室,郑州 450002;河南省农业科学院畜牧兽医研究所,郑州450002;河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室,郑州 450002;河南省农业科学院畜牧兽医研究所,郑州 450002;河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室,郑州450002;河南省农业科学院畜牧兽医研究所,郑州 450002;河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室,郑州 450002;济源市动物卫生监督所,济源 459000;济源市动物卫生监督所,济源 459000【正文语种】中文【中图分类】S858.23【相关文献】1.牛支原体、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒三重二温式PCR检测方法的建立及应用 [J], 范晴;罗思思;邓显文;刘加波;庞耀珊;谢芝勋;谢志勤;谢丽基;黄莉;黄娇玲;张艳芳;曾婷婷;王盛2.牛多杀性巴氏杆菌和牛支原体双重PCR检测方法的建立及应用 [J], 于新友;李天芝;王金良;沈志强3.牛支原体、巴氏杆菌A型和化脓隐秘杆菌多重PCR快速检测方法的建立 [J], 肖淦文;陈颖钰;彭清洁;胡长敏;崔朋;巴晓亮;陈焕春;郭爱珍4.牛支原体病PCR检测方法的建立及初步应用 [J], 吴位珩;黄波;杨茂生;姜玲玲;徐景峨;余波;张涛;余国富;杨莉;冯明祥;孙启跃;刘镜5.牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌和牛结核分枝杆菌三重PCR快速检测方法的建立[J], 杨莉;唐远江;余国富;邹茂华;吴位珩;余波;张涛;姜玲玲;刘镜;杨丽娟;孙启跃;徐景峨;龙玲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

牛支原体及其支原体病诊断技术研究进展

牛支原体及其支原体病诊断技术研究进展范媛;谢光武;陈忠琼;黎晓敏【期刊名称】《饲料博览》【年(卷),期】2012(000)006【摘要】With the development of cattle movement, Mycoplasma bovis has been became an important patho-gen to damage to the breeding. Associated with a number of bovine diseases, Mycoplasma boris is the most common-ly implicated in pneumonia and mastitis, form which arthritis may result, so that it bright a huge economic loss. This paptes summaried the experiment methods of detecting Mycoplasma boris included isolation, biochemical character- istic, immunology and nucleic acid analysis.%随着规模化养牛业的不断发展，牛支原体已经成为危害养牛业的一种重要致病性支原体，可导致牛肺炎、乳腺炎、关节炎等多种疾病，造成巨大经济损失。

文章综述了牛支原体的分离培养法、免疫学方法和核酸诊断技术。

【总页数】3页(P44-46)【作者】范媛;谢光武;陈忠琼;黎晓敏【作者单位】西南大学动物科技学院,重庆400715 重庆市万州动物卫生监督所,重庆404020;西南大学动物科技学院,重庆400715 重庆市万州动物卫生监督所,重庆404020;西南大学动物科技学院,重庆400715;西南大学动物科技学院,重庆400715【正文语种】中文【中图分类】S823;S814【相关文献】1.牛支原体病诊断技术研究 [J], 董亚旗;朱习芳;李程;陈颖钰;索朗斯珠;郭爱珍2.牛支原体病研究进展郭雨丝1,2，陈颖钰3，赵刚1,2，郭爱珍1,2 [J], 郭雨丝;陈颖钰;赵刚;郭爱珍3.牛支原体病的研究进展及防控措施 [J], 何治富;郑慧慧;王万;曹永斌4.牛支原体病分子生物学诊断方法研究进展 [J], 张新兰;马金锐;康吉草;张旭东;安振;武小椿5.牛支原体病流行病学及其诊断技术研究进展 [J], 王天宇;李继东;张志诚;郭亚男因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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中国动物检疫2010年第27卷第4期近年来，山东、湖北、湖南、重庆、贵州等１６个省发现了牛支原体肺炎疫情。

经验证是由牛支原体引起的牛支原体肺炎，临床以呼吸系统症状为主，主要表现为发热、咳嗽、流鼻涕。

犊牛和体质弱的牛发病严重，在不治疗的情况下死亡率可达４０％－８０％，部分病例出现关节炎，少数病例出现结膜炎；剖检病变主要集中在胸腔与肺部，肺和胸膜轻度粘连，有少量积液；心包积水，液体黄色澄清；肺部病变的严重程度在不同病牛表现出差异，与病程有关。

严重者可见肺部广泛分布有干酪样或化脓性坏死灶，俗称“烂肺病”。

我们已从发病牛场病牛肺组织中检测到了牛支原体特异性核酸片段，并分离到了牛支原体。

排除了牛传染性胸膜肺炎（牛肺疫）感染的可能性。

在我国，牛支原体肺炎是一种新发传染病，近几年才有相关报道，具体的流行情况和流行趋势还有待调查。

而且牛支原体存在牛体的下呼吸道，所以鼻腔粘膜和口腔内的病原含量很低，常规的检测方法很难做出检测。

而我们建立的巢式ＰＣＲ检测方法，其敏感性是单一ＰＣＲ方法的１０３倍，并且具有鉴别牛肺疫和无乳支原体的特异性。

可以用于活体检测和流行病学调查。

1材料与方法1.1对照菌株与病料丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体基因组由哈尔滨兽医研究所提供，阳性病料采自５省市５个典型的发病牛场。

1.2主要试剂Ｔａｑ酶为宝生物工程（大连）有限公司产品，ＤＮＡＭａｒｋ－ｅｒ为天根生化公司产品，ｄＮＴＰｓ为ＭＢＩ公司产品，引物由上海生工合成。

1.3主要仪器设备低温台式高速离心机为ＳＩＧＭＡ公司产品；ＹＹ２Ⅲ－８Ｂ稳压稳流型电泳仪为北京六一仪器厂产品，ＰＴＣ２００ＰＣＲ仪为ＢＩＯ－ＲＡＤ公司产品；凝胶成像系统为美国通用电器公司产品。

1.4基因组提取病料经常规处理，采用ＤＮＡ提取试剂盒提取模板，购自上海华舜生物技术有限公司。

1.5引物设计根据ＧｅｎＢａｎｋ发表牛支原体基因序列设计２对引物，扩增片段长度分别为１９１２ｂｐ、４２２ｂｐ。

引物由上海生工合成。

经高压灭菌超蒸水配制成５０ｐｍｏｌ／Ｌ，－２０℃保存。

用时稀释成１００ｐｍｏｌ／Ｌ。

第一轮引物：Ｐ１：５'－ＴＴＴＴＡＧＴＣＴＴＴＴＴＧＡＡＣＡＡＡＴ－３'；Ｐ２：５'－ＧＧＣＴＣＴＣＡＴＴＡＡＧＡＡＴＧＴ－３'第二轮引物：Ｐ３：５'－ＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＣＴＴＡＴＡＣＡＴＧＡＧＣＧＣ－３'；Ｐ４：５'－ＴＧＡＣＴＣＡＣＣＡＡＴＴＡＧＡＣＣＧＡＣＴＡＴＴＴＣＡＣＣ－３'1.6巢式ＰＣＲ第一轮ＰＣＲ扩增２５ｕμＬ反应体系（模板２．５μＬ，引物各１μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ，ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，Ｔａｑ酶０．５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１５．５μＬ）经过优化试验得到应用巢式PCR 方法检测牛支原体肺炎李大伟1,2，张彦明2，黄灿平2，谢建华3，熊仲良3，冉智光3，关平原1，范伟兴2（1．内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特011118；2．中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266032；3．重庆市疫病预防控制中心，重庆渝北401100）摘要：根据G enbank 发表的牛支原体全基因序列，设计2对特异性引物，建立了诊断牛支原体肺炎的巢式PC R 方法，第一轮引物P1、P2扩增片段长度为1912bp,第二轮引物P3、P4扩增片段长度为422bp ：该方法特异性试验未扩增出丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体特异性条带；敏感性试验证明扩增DN A 最低含量达到10-7μg/m L ，是单一PC R 的103倍；用该方法对阳性病料进行检测，均扩增出特异性片段。

该体系的成功构建，可以为牛支原体肺炎的活体检测，和流行病学调查提供技术支持。

关键词：牛支原体；巢式PC R ；活体检测中图分类号：S852.62文献标识码：A 文章编号：1005－944X （2010）04－0028－02A nested PCR method for detecting mycoplasma bovis pneumoniaLI Da-wei 1,2,ZHANG Yan-ming 2,HUANG Can-ping 2,XIE Jian-hua 3,XIONG Zhong-liang 3,RAN Zhi-guang 3,GUAN Ping-yuan 1,FAN Wei-xing 1(1.Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China;2.China Animal Health and Epidemiology Center,Qingdao 266032China;3.Chongqing Center for Animal Disease Control and Prevention,Chongqing 401120,China)Abstract :Based on the reports and sequences published in Genbank,two pairs of specific primers were designed according to the conservative compass.The primers were designed for the establishment of the nested PCR.The amplificated product of primer P1and P2was about 1912bp,and the amplificated product of primer P3and P4was about 422bp.The specific tests showed that no fragment while detecting Mycoplasma mycoides subsp.mycoides small Colony Type and Mycoplasma agalactiae.Results of sensitivity showed the detection limit of this method was 10-7ug/ml.Au positive samples were amplified with this method.This specific and sensitive method is suitable for the detection of living body Mycoplsma bovis pneumonia and gived proofs for the research of epidemiological analysis.Key words :Mycoplsma bovis;nested-PCR ；detection of living body本栏目主持人：胡藕祥zgdwjy@通讯作者：关平原试验研究－28－中国动物检疫2010年第27卷第4期ＰＣＲ条件为：９４℃１１．５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，４８℃６０ｓ，７２℃１５０ｓ，共进行３５个循环；７２℃延伸５ｍｉｎ，最后置４℃保存。

第二轮ＰＣＲ以第一轮扩增产物为模板，反应体系相同；扩增条件为：９４℃１１．５ｍｉｎ；９４℃４５ｓ，５４℃６０ｓ，７２℃１２０ｓ，共进行３０个循环；７２℃延伸５ｍｉｎ。

最后置４℃保存。

1.7特异性试验分别以牛支原体、无乳支原体、丝状支原体丝状亚种小克隆基因组为模板，进行巢式ＰＣＲ扩增。

同时设阴性对照。

1.8敏感性试验提取阳性病料总基因组，经紫外分光光度计测得ＤＮＡ含量为１００μｇ／ｍＬ，然后按１０倍梯度倍比稀释到１０－７μｇ／ｍＬ。

以此为模板进行ＰＣＲ扩增。

1.9样品检测对部分病料提取ＤＮＡ，用巢式ＰＣＲ方法进行检测。

2结果2.1特异性试验结果两轮巢式ＰＣＲ扩增的产物经１％琼脂糖凝胶电泳观察，发现只有牛支原体扩增出４２２ｂｐ条带（见图１）。

2.2敏感性试验结果第１轮ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳观察，发现ＤＮＡ稀释度从１０－１～１０－４扩增产物在１９１２ｂｐ附近有一条与预计大小相符的条带；第２轮ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳观察，发现ＤＮＡ从１０－３～１０－９ｍｇ／ｍＬ时扩增产物在４２２ｂｐ附近有一条与预计大小相符的条带（见图２、图３）。

2.3临床样品检测结果经实验室检测确定部分牛支原体阳性病料，用确定的巢式ＰＣＲ方法进行扩增，以下是经过２轮ＰＣＲ扩增后的结果（见图４、图５）。

3讨论牛支原体于１９６１从患乳房炎病牛中首次分离到［３］，随着牛群的调运扩散到大部分国家和地区：西班牙（１９６７年）、澳大利亚（１９７０年）、韩国（１９８９年）、北爱尔兰（１９９３年）、智利（２０００年）等。

目前已遍及到包括欧洲在内的世界大部分地区［５］。

本病已在欧洲和北美和欧洲造成了严重的经济损失［７］。

我国自２００２年以来部分省市每年都有新引入牛只“疑似牛肺疫”的零星报道。

经我中心人畜共患病监测室与重庆动物疫控中心的监测和调查，山东、湖北、重庆等１６个省发现“疑似牛肺疫”疫情为牛支原体肺炎。

本试验建立的巢式ＰＣＲ检测方法通过使样品核酸累加，提高了检测的敏感性。

在活体检测中可以通过采取鼻拭子的方法鉴定是否存在牛支原体感染。

试验也证明，该方法具有较高的特异性，能够区别丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体。

因此巢式ＰＣＲ方法可以用于活体检测和流行病学调查。

参考文献：［１］Hale H H,Helmboldt C F,Plas-tridge W N,et a1.Bovine mastitis caused by Mycoplasma species [J].Cor-nell Veterinarian,1962,52:582-591.［２］Butler J e of arbitrarily primed polymerase chain reaction to investigate Mycoplasma bovis outbreaks [J].VeterinaryMicrobiology ，2001，78：175-181.［３］Arcangioli M A,Duet A,Meger G,et al.The role of Mycoplasma bovis in bovine respiratory disease outbreaks in veal calf feedlots [J].The Veterinary Journal ，2008，177：89-93.［４］吴移谋，叶元康．支原体学［Ｍ］．北京：人民卫生出版社，２００８：１６－２５．［５］Nicholas R A J,Ayling R D.My-coplasma bovis:disease,diagnosis,and control [J].Veterinary Science,2003,74:105-112.［６］Bashiruddin J B,Frey J.Evaluation of PCR systems for the identification and dif-ferentiation of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis:A collaborative trial [J].The Veterinary Journal,2005,169:268-275.［７］Rosengarten R,Citti C.The role of ru-minant Mycoplasmas in systemic infection.[M]//Rosengarten S L,Frey J.Mycoplas-masofruminants:pathogenicity,diagnostics,epidemiologyandmoleculargenetics.Euro-pean Com mission:Brussels,1999:14-17.［８］石磊，龚瑞，尹争艳，等．肉牛传染性牛支原体肺炎流行的诊断［Ｊ］．华中农业大学学报，２００８，２７（５）：６２９－６３３．试验研究－29－。