第六章 微生物代谢调控育种(4-29)

9、条件突变株的选育
10、营养缺陷型 ●生物素缺陷型 ●油酸缺陷型 ●甘油缺陷型
细胞膜渗透性
11、温度敏感菌株
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8.3.1、组成型突变株的选育
1、限量诱导物恒化培养 2、循环培养 3、弱诱导型底物 4、诱导抑制剂 5、鉴别性培养基
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组成酶变异株的筛选 许多水解酶是诱导酶，只有在含有底物或底 物类似物的培养环境中，微生物才会合成这些 酶类，所以，诱导酶的生产不仅需要诱导物， 而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的 影响。 具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和 诱导抑制物法。
第8章 推理育种
8.1 微生物代谢
一、代谢产物的分类
1、初级代谢产物
分解代谢体系的酶及产物
素材性生物合成体系的酶及底物
结构性生物合成体系的酶及产物
2、次级代谢产物 根据其作用，可将其分为 抗生素、激素、 生物碱、毒素及维生素色素等类型。
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8.1.1、次级代谢产物与次级代谢调节
1.初级代谢和次级代谢
初级代谢：与生物生存有关的，涉及能量产生和能量消 耗的代谢类型。 生存必需；始终生产；不同种，相同；环境敏感性小； 酶专一。 次级代谢：某些生物为避免某种代谢物积累造成不利作 用而产生的一类有利生存的代谢。 根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素 及维生素色素等类型。 并非必需，但有一定价值；某一时产；不同种，不同； 受环境敏影响大；酶专一性不强。
成酶的阶段，两类菌株的生长就不同步，组成酶变异株所占的
比例将逐渐增大。
３、组成型突变株筛选
诱导型依赖诱导物。组成型不依赖诱导物。
突变发生在调节基因或操纵基因,解除对 诱导物的依赖,可获组成型突变株。 筛选方法：设计条件使组成型优势生长， 或通过菌落分辨。
①加诱导酶合成抑制物
②交替培养法 ③显色反应法
8.3.2 抗分解调节突变株的选育
8.3.3、营养缺陷型突变株的筛选及应用
1、诱发突变 2、中间培养 3、淘汰野生型
青霉素浓缩法
过滤浓缩法
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4、营养缺陷型的检出 逐个测定法
夹层检出法
限量补充培养基检出法 影印平板法
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5、生长谱的确定
缺陷型菌株平皿的制备
缺陷营养类别的确定 单一营养因素缺陷型生长因素的确定
①酶合成的诱导调节 有些酶也是诱导酶，以底物或底物类似物（内 源、外源）为诱导剂。 ②反馈调节 次级代谢物的自身反馈抑制和反馈阻遏
末端产物反馈调节；生产能力与抑制浓度正相关。
分解代谢产物的调节
葡萄糖等一些碳、氮源及代谢产物有反馈抑制、阻遏作用。
初级代谢产物的调节；
A有共用合成途径，反馈抑制；B初产物参与次合成，自反馈而影响。
筛选方法
①加诱导酶合成抑制物
如：加邻硝基-β-D-岩藻糖苷，抑制-β半乳糖苷酶合成。 诱导型不能利用乳糖，不长；组成型产酶，能利用乳糖， 生长，被富集。
②交替培养法
含诱导物（乳糖）中培养——组成型快——不含诱导 物（葡萄糖）中培养——诱导型失酶——反复。
③显色反应法
不含诱导物平板培养——加底物——分解（有颜色变
初级代谢的调节控制
1、酶合成的调节
诱导 阻遏
2、酶活性的调节
直线式代谢途径中的反馈抑制； 分支代谢途径中的反馈抑制： 优先合成、协同反 馈抑制、合作反馈抑制、 累积反馈抑制、同工酶调节、顺序反馈抑制。
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8.2.2.2次级代谢产物的诱导调节
1、次级代谢的诱导调节
诱导物→刺激影响初级代谢造成代谢流改变→大量生
抑制
中间产物Ⅰ
中间产物 中间产物Ⅱ α-酮戊二酸 抑制 谷氨酸脱氢酶 NH4+
谷氨酸
高丝氨酸 脱氢酶
高丝氨酸
甲硫 氨酸 苏氨酸
+
赖氨酸
微生物的代谢的人工控制
目的 最大限度的积累对人类有用的代谢产物 改变微生物细胞膜的通透性 措施 改变微生物的遗传特性（诱变、重组等） 控制发酵条件（如温度、PH、O2等） 概 通过微生物的培养，大量生产各种 念 代谢产物的过程 1、固体发酵和液体发酵 发酵 种 2、抗生素发酵、维生素发酵、氨基 类 酸发酵等 3、需氧发酵和厌氧发酵
1) 恒化器法：常被用于微生物的“驯化”。
在培养基中添加不能起诱导作用的低浓度底
物，菌生长速率极慢，而群体中少数组成型 变异株则可合成有关的酶，分解利用该底物， 生长速率较快。 为了提高组成酶变异株的优势，即它在群体 中的比例，可以应用恒化器培养技术。随着 恒化器培养中不断加入新鲜基质而逐渐增大
微生物代谢的人工控制—— 改变膜的透性
合 谷 成 氨 谷 酸 中间产物 氨 棒 酸 状 的 α-酮戊二酸 杆 途 谷氨酸脱氢酶 菌 径 NH +
4
葡萄糖
抑制
改变细胞 膜的透性， 使谷氨酸迅 速排放到细 胞外面，解 除谷氨酸的 抑制作用。
谷氨酸
微生物代谢的人工控制—— 改变遗传特性 黄色短杆菌合成赖 氨酸的途径
组成酶变异株的优势，这样就能够比较容易
地做进一步的纯化分离。
2) 循环培养法：利用不含诱导物的培养环境和含有诱导物的培
养环境进行交替循环培养待分离的菌悬液，从而使组成酶变异 株得到富集。

当接种到不含诱导物而含有其它可利用碳源的培养基中时，
两种类型菌株同样能较好地生长，但在此环境中组成型突变株 已能合成有关的水解酶，而诱导型菌株就不能合成。 将它们转接入含诱导物的培养基中时，变异株能迅速利用 诱导底物进行生长繁殖，而诱导型出发菌株需经历一个诱导合
三、抗反馈调节抗性突变株的获取及应用
1、基本概念 （1）什么是抗反馈调节突变株
一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。
（2）抗反馈调节突变株的特点
目标产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产；
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（3）抗反馈调节的基本类型
抗馈突变型：结构基因突变使变构酶不能与代谢
终产物相结合；
抗阻遏突变型：调节基因突变引起调节蛋白不能和
微生物的生长
生长 细菌数 目的对 曲线 数 时间 调整期
适应新 环境
时间
对数期
适应了环 境后，条 件适宜、 营养物质 充足等
稳定期
衰亡期
成因
应用 长短与菌 可作为菌 及其 种、培养 种也可作 他 条件有关 科研材料
营养物质消 生存条件极 耗、有毒代 度恶化，有 谢产物积累、毒代谢产物 积累过，生 PH值的变化， 种内斗争加 存斗争最剧 烈 剧 制取代谢产 物特别是次 级产物，
为什么耐前体毒性突变株可以获得高产？
如何筛选耐前体突变株？
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四、细胞膜透性突变株
1、营养缺陷型突变株导致细胞膜透性改变； 2、温度敏感突变株导致细胞膜透性改变； 3、溶菌酶敏感突变株导致的细胞膜透性改变
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谷氨酸棒状杆菌合 成谷氨酸的途径
葡萄糖
黄色短杆菌合成赖氨 酸的途径
天冬氨酸
天冬氨酸激酶
代谢终产物结合而失去阻遏作用；或操纵基因突变不
能与活性阻遏蛋白结合。
（4）筛选方法
浓度梯度平板法
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（2）回复突变引起的抗反馈调节株
什么是回复突变株？ 回复突变的基因型有哪几类？ 该类菌株高产的原理是什么? 如何筛选该类菌株？
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（3）累积前体和耐前体突变株的选育
什么是累积前体和耐前体突变株？
第8章 微生物优良菌种的选育
微生物发酵的一般流程
培养基配制 种子扩大培养 空气除菌 发酵设备
培养基灭菌
发酵生产
下游处理
提纲
微生物优良生产菌种的特征 自然突变选育 诱变选育
原理 基本方法 放线菌 霉菌 酵母菌
杂交育种
细菌
原生质体融合 基因工程技术
基因表达系统 利用大肠杆菌的基因表达系统 利用酵母菌的基因表达系统 基因工程菌的稳定性
磷酸盐调节；
A抑制酶的作用；B导致细胞能荷变化；C竞争某些金属离子的作用。
8.1.2
初级代谢产物与次级代谢
一般认为，次级代谢指微生物在一定生长时 期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微 生物生命活动无明确功能的物质的过程，即 为次级代谢产物。 次级代谢与初级代谢关系密切，初级代谢的 关键性中间产物往往是次级代谢的前体，如， 糖降解过程中的乙酰CoA是合成四环素、红 霉素的前体；
8.2 微生物代谢调节
8.2.1 次级代谢的调节机制 8.2.1.1分解代谢中酶合成的调节
1、酶合成的调节
诱导 阻遏
2、酶活性的调节
直线式代谢途径中的反馈抑制； 分支代谢途径中的反馈抑制： 优先合成、协同反 馈抑制、合作反馈抑制、 累积反馈抑制、同工酶调节、顺序反馈抑制
8.2.1 次级代谢的调节类型
优良菌种应具备的特征
选择生产菌种应注意的因素
1.原料方面：广，转化率高； 2.产物方面：目的产物含量高，副产物少； 3.菌体方面：生长快、繁殖力强，耐受力强，抗污 染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定 4. 设备方面：产泡沫少，适宜大罐生产。
（培养条件异，周期短，需氧量小，抗污染能力强）
一、自然选育
化）——检出。
４.抗（敏感）性突变株筛选
包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体 ①抗生素抗性突变：提高产量； ②抗噬菌体突变：消除噬菌体污染；
（与噬菌体存在与否无关）
③条件抗性突变：如温度，可提高产量；
（温度敏感突变，高温呈营养缺陷表型）
④物敏突变：
如：氟乙酸抑制顺乌头酸酶，氟乙酸敏感突变型， 顺乌头酸酶活性极低，更敏感，异柠檬酸产量 少，柠檬酸积累。
到大量积累有益产物的目的。
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常见的微生物代谢控制育种措施
调节体系 育种措施
1、组成型突变株 2、抗分解调节突变株的选育 ●解除碳源分解调节突变株 ●解除氮源分解调节突变株 ●解除磷酸盐分解调节突变株