黄芪甲苷的测定方法

黄芪甲苷含量测定几种常用方法的比较

黄芪甲苷为黄芪的主要活性成分之一。能抗炎降压、镇痛镇静和促进再生肝DNA水平。现代药理研究表明，黄芪甲苷具有改善白细胞变形能力、改善心肌收缩及舒张功能、促进胰岛素分泌和清除自由基等药理作用。近年来，对黄芪甲苷的含量测定方法的研究很多。本人就几种常用方法作一比较。

1高效液相色谱法(I-R_C法)

HPLC法因其分离度好、灵敏性高，适用范围广等优点，已广泛用于黄芪甲苷的含量测定、稳定性、药理和临床研究中。

1．1 HPLC—uv法黄芪甲苷属于四环三萜类皂苷，紫外末端吸收f max200．8 nm)。紫外检测灵敏度低，干扰因素多，目前HPLC法是最常用的检测器是紫外检测器。苏瑞强Ⅲ等采用HPLC法测定黄芪甲苷的含量，色谱柱为YWG—C18柱0．9 mm x250 mm，5 m)，流动相为乙腈一水(1：2．3)，检测波长为203nm，结果线性范围为0．86—5．27 I,L g／mL，加样回收率为97．52％，RSD为3．10％。

1．2 HPLC一示差折光检测法由于黄芪甲苷在紫外区仅有微弱的末端吸收，溶剂噪音对结果有较大的影响，且其前处理繁杂。池玉梅等四应用HPLC示差折光检测法测定黄芪精12I服液中黄芪甲苷的含量，色谱柱为Hypersi|ODS 2(4．6ram X 200ram，5 I,Lm)，流动相为甲醇一水(67：33)，结果黄芪甲苷线性范围是1-5 g／ml，回收率为98．1％，RSD为2．02％。该法简单方便，重现性好，灵敏度高，结果准确、可靠。

1．3 RP—HPLC法路玫等[3j采用RP—HPLC法测定黄芪注射液中黄芪甲苷的含量。色谱柱为Nova—PakC18柱0．9ram xl5Omm，4la,m)，流动相为乙腈一水一磷酸(1：2：O．1)，检测波长为203nm，柱温为40％。实验中将样品蒸干，采用水饱和的正丁醇溶解，用氨试液洗涤后蒸干，残渣用甲醇溶解。结果加样回收率为94．7％，RSD为2．6％。该法简便、稳定性好、重珊陆好、灵敏度高，且由于在流动相中加入磷酸，可使基线平稳，样品峰与其他峰达到基线分离。郑志仁等H将药材置索氏提取器提取1 h后采用RP—HPLC法测定提取液中黄芪甲苷的含量，色谱柱为Nueleosil c 18柱，流动相为乙腈一水(1：2)，检测波长为205rim。结果黄芪甲苷线性范围是l0．64～53．20I．L g／mL，加样回收率为92．66％。

1．4 HPLC—ELSD法蒸发光散射检测原理是使流动相溶剂喷雾汽化，进入加热管后溶剂挥发；被分析检测的物质颗粒经镭射光产生散射，散射光由光电倍增管收集得到响应，光散射检测器的响应大小决定由被分析物质的颗粒的数量和大小，而不受流动相溶剂的干扰；不要求被检测组分有特定的化学结构。赵灵芝等15]采用HPLC—ELSD法测定黄芪中黄芪甲苷的含量，以Blite—ODS柱为色谱柱，乙腈一水(36：64)为流动相，流速为0．8ml／rain；ELSD参数中漂移管温度为100℃，N 流速为2．74ml／min。结果黄芪甲苷线性范围是2．016～12．096g，加样回收率为97．43％，RSD为1．57％。该法灵敏度高，分离度好，干扰少，前处理简便，回收率高，重现性好。周春玲等对甲醇一水(4o：6o)、四氢呋喃一水(25：75)及乙腈一水(1：21等不同流动相进行了试验，并考察了黄芪甲苷的分离情况及检测灵敏度，同时通过观察峰面积、基线噪音和信噪比，研究了漂移管温度和气体流速等ELSD参数条件。结果表明，采用乙腈一水(1：2)为流动相时，分离情况最好；最佳的测定参数是漂移管温度为105 oC，气体流速为2．96L／rain；样品加样回收率为100．5％，RSD为3．23％。该法分离度好，精密度和重珊性俱佳，回收率高。

1．5 HPLC—MS法高效液相一质谱(HPLC—Ms)联用仪是当前天然药物的成分、药理与临床研究中最重要的联用仪器，能解决复杂成分样品的定性、定量问题。顾泳川等[61建立HPLC—MS法测定大鼠尿中黄芪甲苷的含量，并对其尿药动力学进行研究。采用Diamonsil TMC18柱为色谱柱；乙腈一水(40：60)为流动相；电喷雾离子化接口的四级质谱检测器，内标为地高辛，选择性离子检测(sIM1。实验中尿样加入地高辛混匀离心后，上清液通过已活化的固相萃取小柱，用3ml水淋洗，残渣用2ml甲醇洗脱，N：吹干后用流动相溶解。该法专属性好，方法灵敏度高，最低检测限为lOng／ml，杂质干扰小，操作简便，是检测体内黄芪甲苷的一种新型有效的分析方法。

2 薄层扫描法fLcs法)

TLCS法多采用双波长扫描法，能消除有机成分的干扰及操作误差，使测定的灵敏度和准确度提高，一般有内标法和外标法。

2．1普通TLCS法实验中样品用氢氧化钾液提取除去酸性成分，以正丁醇萃取使背景干扰少，用大孔树脂分离皂苷除去样品中糖类等水溶性杂质，并在层析缸中放一小杯氨水，使斑点分离明显；采用硅胶G板，以氯仿一甲醇一水(65：35：lO) 为展开剂，在氨饱和蒸气环境下展开，喷以10％硫酸乙醇溶液后加热显色。加样回收率为97．39％，RSD为1．4％。将样品超声提取后，在硅胶GF254板上以氯仿一醋酸乙酯一甲醇(8：

6：0．8)展开，254 BITI紫外光灯下定位，双波长( s=228 nm，It=370 nm)反射式锯齿扫描测定，平均加样回收率为99．5％，RSD为2．5％。该法能准确快速地测定提取液中的黄芪甲苷含量，取样量少，提取过程简单，可不经显色直接扫描测定，且方法重现性好，操作简单易行。

2．2高效TLCS法普通TLCS法的稳定性、重现性相对较差，灵敏度较低。将样品置索氏提取器中加甲醇回流提取，乙醚脱脂，无水正丁醇提取后蒸干，残渣用甲醇溶解，在高效硅胶G板上以三氯甲烷一甲醇一水(65：35：10)为展开剂展开，硫酸乙醇显色定位。结果加样回收率为98．9％，RSD为2．0o％。该法简便、可靠，重现性和稳定性均较好，且采用索氏提取分层明显，薄层展开斑点清晰。

2．3薄层光密度法将样品用水饱和正丁醇萃取，用1％氢氧化钠液洗涤后挥干，残渣用甲醇溶解，在硅胶G板上以三氯甲烷一甲醇一水(7：3：9)为展开剂展开，反射法单波长(525nm) 锯齿扫描，狭缝1．2mrnx1．2mm，背景补偿，线性校正CH=9，SX=3。结果黄芪甲苷线性范围为1．58～7．9 g，加样回收率为97．28％，RSD为1．o6％。该法重现陆好，斑点颜色在2h内稳定。

3比色法

比色法利用了黄芪甲苷与显色剂发生显色反应生成有色物质，使之能用可见分光光度法测定的原理，常见显色剂有香草醛一硫酸、香草醛一高氯酸、香草醛一冰醋酸等。

3．1采用香草醛一硫酸比色法测定黄芪甲苷的含量。该法利用在浓硫酸介质中，黄芪甲苷的酚羟基与香草醛醛基进行羟醛缩合反应的原理，将样品用乙醇溶解后，加入香草醛液和硫酸液，加热15rain，于578nm处测定吸收度，操作简单，反应灵敏度高，重现陛好，且无使用仪器的限制。

3．2采用香草醛一冰醋酸比色法对黄芪甲苷的含量进行了测定，将样品用乙醇溶解后，加入香草醛液和冰醋酸液，加热15rain，于578nm处测定吸收度。该法具有试剂的空白吸收值较小、对分析样品干扰小等优点。

4荧光法

4．1茴香酸一硫酸体系荧光法杜呜等【7】利用黄芪甲苷在浓硫酸介质中能与茴香酸反应，其反应产物有强烈荧光的特点，对血清中黄芪甲苷的含量进行测定。结果黄芪甲苷与茴香酸的反应产物的最大激发波长为Ex=320nm，最大发射波长为Em=387nm，线性范围为0．2～40．Omg／L，最低检测限为0．02rag／L。该法具有灵敏度高、选择性好、检出限度低、线性范围宽、操作简便、无干扰等优点。游文玮等【蚓采用荧光分光光度法，针对大鼠血清中内源性杂质干扰严重的特点，用固相萃取净化和富集血样，再用化学衍生荧光分光光度法测定黄芪甲苷的含量。最大激发波长为Ex=3lOnm，最大发射波长为Em=376nm，平均回收率为97．1％，RSD为2．6％。该法采用固相萃取技术，有效地富集和净化样品，并利用了荧光光度法灵敏度高的优点。

4．2香草醛一磷酸体系荧光法杜鸣等利用黄芪甲苷在磷酸条件下与香草醛反应的产物具有荧光的特性，建立了香草醛一磷酸体系荧光分光光度法测定黄芪甲苷的含量。结果黄芪甲苷与香草醛的反应产物的最大激发波长为Ex=365nm，最大发射波长为Em=430nm，线性范围为O．20—20．0mg ／L，最低检测限为0．106mg／L。该法具有操作简便、专属性强、重现性好、空白值较低等优点，且样品不必经过薄层分离即可直接测定。

综上所述，对黄芪甲苷的分析方法很多，但大多数制剂由于成分复杂，干扰严重，HPLC法和TLCS法因操作简单、快速、灵敏度高、重现性好而优于其他方法。近年来，随着新型检测器如ELSD等的不断出现，使原本无紫外吸收的黄芪甲苷也得以很好的分离；而将色谱与质谱联用(如HPLC—MS)，化学衍生化与荧光相结合，则各取所长，能同时对成分复杂的样品进行定性定量分析，尤其在药理、临床研究中是新型有效的方法。