CHO细胞表达抗体
CD80鼠-人嵌合抗体的CHO细胞表达及体外生物学功能的初步研究
ＣＥ Ｈ ＮＭｉ － ｉ ＱＵ 一 ｎ Ｘｎ， Ｉ ｇ
．ｎｔｕ Ｉｓｔ ｅ ｆＭｅｉ ｌ ｉｅｈｏ ｇ ， ｏｃｏ ｎｖ ｓｙ，ｕｈｕ２ ５０ ， ｈ ａ ｉｔ ｏ ｄ ａ ｏ ｃｎｌ ｙ Ｓｏｈｗ Ｕ ｉｒｔ Ｓｚｏ １０ ７ Ｃ ｉ ｃ Ｂｔ ｏ ｅｉ ｎ
ｌ ｂｔ ｃ］ Ｏ ｊｃｖ ：ｏｅｐ ｓ ｈｍ ｎｍ ｕｅｃｉｅｉ ａｔｏｙａａ ｓ ｈｍ ｎＣ ８ ｃ４ ５ａｔｏｙ ｎＣ Ｏ ｃｌ，ｎ — ｓ ａｔ Ａ ｒ ｂｅｔ ｅ Ｔ ｘｒ ｓ ｕ ａ－ ｏｓ ｈｍ ｒ ｎｂｄ ｇｉ ｔ ｕ ａ Ｄ ０（ｈ Ｅ ｎｂｄ ）ｉ Ｈ ｅｓａｄｔ ｒ ｉ ｅ ｃ ｉ ｎ ｉ ｌ ｏｅ
ｃ ４Ｅ ｏ ｃ ｎ ｔｕ ｔｓａ ｌ ｅｌｌ ｅ ｓｃ ｅｉｇ ｃ ｉ ｒｃ ｎ ｔｂ ｄ Ｔｈ ｈ Ｅ５ ａ ｔ ｏ ｙ ｗａ ｕ ｆ ｄ ｆｏ ｃ ｌｕｅ ｓ ｐ ｍａａ ｔｗｉ ｏ ｔｆｔｌｃ ｌ ｈ ５ ｔ ｏ ｓｒｃ ｔｂｅ ｃ ｌ ｉ ｅ ｒｔｎ ｈｍｅ ａ ｉｏ ｙ． ｅ ｃ ４ ｎｉ ｄ ｓ ｐ ｒｉ ｒｍ ｕｔｒ ｕ ｅ ｔ ｔ ｕ ｅａ ａｆ ｎ ｉ ｂ ｉ ｅ ｎ ｈ
中国 图 书 分类 号 Ｒ ９ ． ３ ２１ 文献标识码 Ａ 文章编号 １０－８Ｘ（０ ９０－１４０ ００４４ ２０ ）２０１．４
［ 摘
要 ］ 目的： Ｈ Ｃ Ｏ细胞表达抗人 Ｃ ８ Ｄ ０鼠一 人嵌合抗体 ｃ４ ５ 并研究 其在体外阻断 Ｃ ８ ｈＥ ， Ｄ ０介导的共刺激信号转导 的生
物学功能 。方法： 构建 含有嵌合重 、 轻链基因的表 达载体 ｐＲ Ｓ ｃ４ ５ 表达载体先转染 ２３ ＩＥ ／ ｈＥ ； ９Ｔ细胞 ，Ｃ Ｆ Ｍ检测到 ｃ４ ５抗体 的 ｈＥ 瞬时表达后 ， 表达载体再转染 Ｃ Ｏ细胞 ， Ｈ 构建稳定表达细胞株 Ｃ Ｏｃ４ ５ Ｐｏ ｉ Ｇ亲和层析法从 Ｃ Ｏ ｃ４ ５ Ｈ —ｈＥ ；ｒ ｅ ｔｎ Ｈ —ｈＥ 细胞无血清培养 上清 中纯化 ｃ４ ５ ｈ Ｅ 抗体 ，Ｃ Ｆ Ｍ检测 ｃ４ ５抗体对膜型 Ｃ ８ ｈＥ Ｄ０的识别 ； 以丝裂霉素处理 的正常人外周血单核细胞 Ｐ Ｍ ｓ Ｂ Ｃ 为刺激细 胞， 以异体正常人外周血淋 巴细胞 Ｐ ｋ 为反应细胞 ， Ｍ Ｆ Ｂ 用 Ｔ 法分析 ｃ４ ５抗体的阻断作用。结果 ：ｈＦ ｈＥ ｃ４５抗 体在 ２３ ＿ ９Ｔ细胞 的
CHO细胞基本知识
CHO细胞基本知识引言CHO细胞（Chinese Hamster Ovary cells）是一种常见的哺乳动物细胞系，常被用于生物技术领域的研究和应用。
CHO细胞具有诸多优点，如易于培养、较高的复制速度和稳定性等，使其成为生物药物生产的重要工具。
本文将介绍CHO细胞的基本知识，包括其来源、特点、培养条件和应用等方面。
来源CHO细胞最初来源于中国仓鼠卵巢组织，1957年被美国科学家狄利克(Dilworth)和哈普斯特(Hamster)首次成功培养。
经过多年的研究和改进，CHO细胞逐渐成为工业界主要采用的细胞系之一。
现在，CHO细胞已经被广泛应用于生物制药行业，特别是重组蛋白的生产。
特点CHO细胞有许多特点使其成为生物药物生产的理想细胞系。
1.易于培养：CHO细胞相对容易培养，可以在常规的培养基中生长。
其生长要求较为简单，包括适当的培养基、温度、pH值、营养物质等。
2.高繁殖速度：CHO细胞的繁殖速度较快，在适宜的培养条件下，细胞数量可以迅速增加。
这对于大规模的生物药物生产非常有利。
3.稳定性：CHO细胞在长期培养过程中具有较高的遗传和表达稳定性。
这对于生物药物的一致性和稳定性非常重要。
4.多样性：CHO细胞可以表达多种重组蛋白，包括抗体、生长因子、酶等。
这使得CHO细胞在生物制药领域有广泛的应用前景。
培养条件CHO细胞的培养条件对于细胞的生长和表达产物的质量具有重要影响。
以下是一些常用的培养条件：1.培养基：CHO细胞通常使用含有葡萄糖和氨基酸的培养基，如DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medi um）或RPMI 1640。
培养基中还可以添加胎牛血清（FBS）或人血清蛋白（HSA）等血清成分，以提供细胞所需的营养和生长因子。
2.温度和湿度：CHO细胞通常在37摄氏度的恒温箱中培养，相对湿度约为90%。
温度和湿度的控制对细胞的生长和代谢活性至关重要。
3.pH值：CHO细胞在培养过程中的最适pH值通常在7.0-7.6之间。
CHO细胞培养生产抗体药物的工艺优化与放大研究工程
文献综述
CHO细胞大规模培养技术是近年来发展起来的真核细胞表达系统，被广泛应用 于单克隆抗体的生产。根据文献报道，影响CHO细胞大规模培养的主要因素包 括细胞培养基质、培养条件、细胞株选择和下游分离纯化工艺等。通过优化这 些因素，可有效提高CHO细胞培养的效率和单克隆抗体的产量。
研究方法
本研究采用CHO细胞系进行大规模培养，通过优化细胞培养基质、培养条件以 及下游分离纯化工艺，实现高效表达和纯化单克隆抗体。具体实验方法如下：
一、引言
乙肝疫苗是预防乙型肝炎病毒感染的重要手段。其中，重组CHO细胞乙肝疫苗 是一种高效、安全、易于生产的疫苗。然而，随着疫苗需求的不断增加，提高 生产效率和产品质量成为了亟待解决的问题。因此，本次演示将对重组CHO细 胞乙肝疫苗的生产工艺进行优化。
二、材料与方法
1、材料
重组CHO细胞乙肝疫苗生产所需材料包括CHO细胞、培养基、血清、胰蛋白酶、 葡萄糖、谷氨酰胺等。
参考内容二
摘要
本次演示旨在探讨重组CHO细胞乙肝疫苗生产工艺的优化。通过对现有生产工 艺的分析和研究，我们提出了一系列工艺优化方案，并对其进行了实验验证。 实验结果表明，优化后的生产工艺显著提高了乙肝疫苗的生产效率和产品质量。
关键词：重组CHO细胞乙肝疫苗， 生产工艺，优化
This article aims to explore the optimization of production process for recombinant CHO cell hepatitis B vaccine. Through the analysis and research of existing production processes, we propose a series of process optimization plans and experimentally verify them. The experimental results show that the optimized production proces
cho细胞表达系统及筛选原理
cho细胞表达系统及筛选原理Cho细胞表达系统及筛选原理一、引言Cho细胞表达系统是一种常用的哺乳动物细胞表达系统，被广泛应用于重组蛋白的生产。
本文将介绍Cho细胞表达系统的原理以及其在蛋白质筛选中的应用。
二、Cho细胞表达系统的原理Cho细胞是一种中国仓鼠卵巢细胞系，具有较高的生长速度和蛋白质表达能力。
Cho细胞表达系统主要包括以下几个关键步骤。
1. 转染将目标基因导入Cho细胞中，通常使用质粒转染法或病毒载体转染法。
质粒转染法通过将目标基因插入质粒DNA中，然后利用转染试剂将质粒DNA导入细胞内。
病毒载体转染法则通过构建携带目标基因的病毒载体，将其感染到Cho细胞中。
2. 选择性筛选为了确保只有转染成功的细胞能够表达目标蛋白，通常在培养基中添加适当的选择性抗生素，如G418或葡萄糖酸钾。
只有转染成功的细胞才能抵抗抗生素的作用，存活下来。
3. 扩增和表达经过筛选的细胞将被扩增培养，以获得足够数量的细胞进行大规模蛋白质表达。
通常选择合适的培养基和培养条件，以提高细胞的生长速度和蛋白质表达水平。
4. 蛋白质纯化经过表达的目标蛋白质需要进行纯化，以去除其他杂质。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
通过这些方法，可以获得高纯度的目标蛋白质。
三、Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中的应用Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中具有以下优势。
1. 高表达水平Cho细胞具有较高的蛋白质表达能力，能够快速产生大量目标蛋白。
这对于需要大量蛋白质的研究和工业应用非常有利。
2. 真核细胞表达与原核细胞表达系统相比，Cho细胞表达系统能够实现真核细胞蛋白质表达。
这使得Cho细胞表达系统适用于需要进行正确的蛋白质翻译修饰、蛋白质折叠和组装的蛋白质研究。
3. 可选择性筛选通过添加适当的选择性抗生素，可以筛选出成功表达目标蛋白的细胞。
这样可以确保筛选后的细胞具有较高的表达水平和纯度。
4. 灵活性Cho细胞表达系统可以应用于多种类型的蛋白质，包括单链抗体、重组蛋白、酶等。
CHO细胞表达抗体ppt课件
启动子下游有真核的 核糖体进入位点，通 常为GCCGCC A/GCCAUGG+4的 共有序列
IRES具有较强的起始 翻译的能力，研究发 现，某些动物的基因 前存在类似IRES的序 列，可以独立启动翻 译，并且翻译效率很 高，可称之为翻译型 增强子
CHO Cell CHO-K1 GS基因表达系统 瑞士的Lonza公司
宿主细胞：CHO-K1SV 质粒：PEE12.4（Amp抗性，GS标记 基因，￥2000） 筛选试剂：MSX（氨基亚砜蛋氨酸） 宿主细胞：CHO-s® Cells (cGMPbanked) 质粒：pCHO1.0（嘌呤霉素和DHFR标 记基因，￥10000） 筛选试剂：Puromycin/MTX（氨甲喋5 呤）
质粒：PEE12.4 筛选试剂：MSX（氨基亚砜蛋氨酸）
PEE12.4
12
PEE12.4 4 12.4
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GS（谷氨酰胺合成酶）筛选原理
L-谷氨酸+氨+ATP
GS
L-谷氨酰胺+ADP+Pi
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DHFR系统
宿主：CHO-S Cell （cGMP-banked） 培液：CD-FortiCHO Medium 限制性内切酶： AvrII/BstZ17I ，EcoRV /Pacl 线性化酶：NruI 转化：Neon® electroporation Transfection
表 达 盒
抗体基因表达盒的组织形式 已较为固定，但其中各元件 的选择仍有值得探讨的地方
9
PcDNA3.3/Poptiv
CHO细胞表达系统研究进展
生物技术进展２０１６年㊀第６卷㊀第４期㊀２３９~２４３ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１进展评述Ｒｅｖｉｅｗｓ㊀收稿日期:２０１６￣０２￣２２ꎻ接受日期:２０１６￣０４￣０４㊀作者简介:郑惠惠ꎬ技术员ꎬ主要从事真核重组抗原研发研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｓｈａｎｊｖｑｉｕｍｉｎｇ＠１６３.ｃｏｍꎮ∗通信作者:江洪ꎬ工程师ꎬ主要从事重组抗原研发研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｊｉａｎｇ＠ｗｏｎｄｅｒｇｅｎ.ｃｏｍＣＨＯ细胞表达系统研究进展郑惠惠ꎬ㊀江㊀洪∗北京万达因生物医学技术有限责任公司ꎬ北京１４１０１７摘㊀要:ＣＨＯ细胞表达系统是目前重组糖蛋白生产的首选系统ꎮ随着无血清悬浮培养技术㊁基因工程技术和大规模培养技术的应用和不断发展ꎬＣＨＯ细胞表达系统已经成为生物技术药物最重要的表达或生产系统ꎬ并被广泛应用于抗体㊁重组蛋白药物和疫苗等产品的研发和生产中ꎮ近年来ꎬ针对ＣＨＯ细胞表达系统在某些重组蛋白的表达和大规模生产中存在的不足ꎬ研究者们通过利用基因工程技术手段ꎬ结合重组蛋白表达机制的研究成果ꎬ为优化和应用ＣＨＯ细胞表达系统做出了不懈努力ꎮ从培养基的优化㊁高产重组ＣＨＯ细胞株的构建㊁大规模培养三个方面综述了ＣＨＯ细胞表达系统的最近研究进展ꎬ以期为ＣＨＯ细胞表达系统的研究与应用提供参考ꎮ关键词:ＣＨＯ细胞培养ꎻ细胞改造ꎻ重组抗原表达ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.２０９５￣２３４１.２０１６.０４.０３ＰｒｏｇｒｅｓｓｏｆＣＨＯＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍＺＨＥＮＧＨｕｉ￣ｈｕｉꎬＪＩＡＮＧＨｏｎｇ∗ＢｅｉｊｉｎｇＷｏｎｄｅｒｇｅｎＢｉｏ￣ｍｅｄｉｃｉｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ.Ｌｔｄ.ꎬＢｅｉｊｉｎｇ１４１０１７ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:ＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｓｔｈｅｐｒｅｆｅｒｒｅｄｓｙｓｔｅｍｆｏｒｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ.Ｗｉｔｈｔｈｅｅｖｏｌｖｉｎｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄｔｈｅｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅｃｕｌｔｕｒｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓꎬＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｈａｓｂｅｃｏｍｅｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｐｒｏｄｕｃｔｓ.Ｔｈｉｓｓｙｓｔｅｍｉｓｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｉｎｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓꎬｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｖａｃｃｉｎｅｓ.Ｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓꎬｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓｈａｖｅｍａｄｅｇｒｅａｔｅｆｆｏｒｔｓｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｕｓｉｎｇｌａｔｅｓｔｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍ.ＴｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｂｒｉｅｆｌｙｒｅｖｉｅｗｅｄｔｈｅｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｎｔｈｒｅｅａｓｐｅｃｔｓ:ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍꎬｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＣＨＯｓｔｒａｉｎｓｆｏｒｈｉｇｈ￣ｌｅｖｅｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅｃｕｌｔｕｒｅｒｅｓｅａｒｃｈꎬｗｈｉｃｈｗａｓｅｘｐｅｃｔｅｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＣＨＯｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅꎻｃｅｌｌｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎻｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｎｔｉｇｅｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ㊀㊀ＣＨＯ细胞是由Ｐｕｃｋ于１９５７年建成的中国仓鼠卵巢成纤维细胞系ꎮ发展至今ꎬＣＨＯ细胞已成为生物技术药物最重要的表达或生产系统ꎮ随着无血清悬浮培养技术㊁基因工程技术㊁生物反应器设计放大与强化技术㊁大规模高密度流加和连续灌注培养技术等的发展ꎬＣＨＯ细胞系统被广泛应用于抗体㊁基因重组蛋白质药物㊁病毒疫苗等生物技术产品的研究开发和工业化生产中ꎮＣＨＯ细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系ꎮ因为它具有准确的转录后修饰功能ꎬ表达的蛋白在分子结构㊁理化特性和生物学功能方面更接近于天然蛋白分子ꎮ但ＣＨＯ细胞在无血清培养基中会出现活力差㊁分泌外源蛋白能力弱等问题ꎮ所以建立稳定㊁高产的重组ＣＨＯ细胞成为很多研究者的目标ꎮ近年来ꎬ研究者从细胞营养㊁代谢㊁凋亡㊁信号传导等角度ꎬ结合蛋白表达机制等研究成果ꎬ对这一目标的实现做出了很多努力ꎮ本文从培养基优化㊁高产重组ＣＨＯ细胞株的构. All Rights Reserved.建㊁大规模培养三个方面综述了ＣＨＯ细胞表达系统的最新研究进展ꎬ以期为ＣＨＯ细胞表达系统的应用提供参考ꎮ１㊀培养基的优化研究发现ꎬ不同的细胞株甚至克隆对营养成分的需求都有差别ꎮ通过筛选比较不同培养基成分对重组抗原生产的影响ꎬ并开发适用于不同重组ＣＨＯ细胞株的培养基ꎬ成为很多研究者提高ＣＨＯ细胞表达系统产量的重要方式ꎮ为了维持细胞在无血清培养基中的正常生长ꎬ需要在基础培养基中添加很多其他因子ꎬ如激素㊁生长因子㊁蛋白水解物等ꎮ蛋白质水解物含有丰富的营养成分ꎬ可有效缩短细胞对无血清培养基的适应过程ꎮＤａｖａｍｉ等[１]通过组合比较不同来源的蛋白水解物对细胞密度及表达产量的影响ꎬ优化得到更适于ＤＧ４４的培养基ꎮ酵母水解物作为一种成本较低的非动物源蛋白水解物ꎬ可以使细胞密度增加的同时ꎬ使重组表达抗体的表达量大幅提高[２]ꎮ大豆水解物等都可以被添加到基础培养基中[１ꎬ３ꎬ４]ꎮ由于蛋白水解物的构成复杂ꎬ且批间差异大ꎬ因此蛋白水解物的添加会影响细胞培养基批次间的稳定性ꎮ如果去除培养基中的蛋白质水解物ꎬ需要添加氨基酸或微量元素等ꎬ通过优化调整其比例ꎬ仍能支持高密度的ＣＨＯ细胞培养[５]ꎮ刘兴茂等[６]采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ￣Ｂｕｒｍａｎ实验对影响细胞生长的培养添加成分进行了考察ꎬ确定了腐胺㊁胰岛素及转铁蛋白对１１Ｇ￣Ｓ细胞的悬浮培养有明显的生长促进作用ꎮ设计的培养基可以使细胞最大生长密度达到４.１２ˑ１０６ｃｅｌｌｓ/ｍＬꎮＸｕ等[７]采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ￣Ｂｕｒｍａｎ设计与支持向量机(ＳＶＭ)预测并实验确定了硫酸锌㊁转铁蛋白及ＢＳＡ对ＣＨＯ￣Ｋ１细胞的生长有促进作用ꎮ另有研究表明ꎬ使用柠檬酸铁作为转铁蛋白的替代物ꎬ可以使细胞的密度达到７.０ˑ１０６ｃｅｌｌｓ/ｍＬꎬ但是会降低转染效率[８]ꎮＭｉｋｉ等[９]研究发现ꎬ添加生长因子ＩＧＦ￣１和脂类信号分子溶血磷脂酸(ＬＰＡ)也可以有效加速ＣＨＯ细胞生长ꎮ优化培养基能有效提高重组ＣＨＯ细胞的培养密度ꎮ高密度的ＣＨＯ细胞培养是ＣＨＯ细胞表达系统实现工业化生产应用的必要条件之一ꎮ与大肠杆菌和酵母表达系统相比ꎬＣＨＯ细胞有生长较慢㊁培养周期较长㊁产量较低等缺点ꎮ为了提高重组蛋白产量㊁扩大ＣＨＯ细胞表达系统的生产应用范围ꎬ研究者们在优化培养基的实验基础上ꎬ构建高产的重组ＣＨＯ细胞系ꎬ为大规模的重组蛋白生产提供基础ꎮ２㊀高产重组ＣＨＯ细胞株的构建研究者们利用发展迅速的基因编辑技术对ＣＨＯ细胞进行筛选和改造ꎬ得到高产的重组细胞株ꎮ研究者们通过过量表达或敲除某个基因ꎬ调整代谢途径㊁延缓细胞凋亡㊁增强转录表达效率ꎬ有效的增加了重组蛋白产量ꎮ通过结合全基因组测序和基因敲除技术的研究成果ꎬ研究者们为得到反应性更好的糖基化重组蛋白做出了不懈努力ꎮ２.１㊀调整代谢途径乳酸作为糖酵解产生的代谢产物会影响细胞生长ꎮＺｈｏｕ等[１０]使用ｓｉＲＮＡ技术降低乳酸脱氢酶Ａ(ＬＤＨａ)和丙铜酸脱氢酶激酶(ＰＤＨＫｓ)基因的表达ꎬ使乳酸的产生降低了９０％ꎬ并增加了单抗的产量ꎮＴｏｕｓｓａｉｎｔ等[１１]通过在ｒＣＨＯ中表达酵母丙酮酸羧化酶(ＰＹＣ２)ꎬ改变了流加培养方式中葡萄糖的代谢速率ꎬ增长了细胞的对数生长期ꎬ从而增加了细胞密度及产量ꎮ２.２㊀延缓细胞凋亡为了延长细胞培养的时间从而增加产量ꎬ有研究者建立了能表达抗凋亡基因的ＣＨＯ细胞系ꎮＭａｊｏｓ等[１２]通过在ＣＨＯ中表达１个Ａｓｐ２９Ａｓｎ突变的抑制凋亡基因ꎬ有效延缓了细胞凋亡ꎮ也有研究者通过敲除细胞中的促凋亡基因来延缓细胞凋亡ꎬ如Ｃｏｓｔ等[１３]敲除了ＢＣＬ２相关蛋白Ｘ(ＢＡＸ)和ＢＡＫ的基因ꎬ使单克隆抗体产量增加了５倍ꎮＲｉｔｔｅｒ等[１４]发现８号染色体端粒区的缺失也可以使产物产量成倍增加ꎮ２.３㊀增强转录表达效率有研究者在细胞信号通路研究成果的基础上ꎬ通过表达转录及翻译过程中的相关蛋白ꎬ增强转录和表达效率ꎬ以增加目的重组蛋白的产量ꎮＬｅＦｏｕｒｎ等[１５]通过在ＣＨＯ中表达人信号受体蛋白ＳＲＰ１４ꎬ成功增加了分泌表达的重组蛋白的产０４２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.量ꎮＰｅｎｇ等[１６]通过表达转录翻译相关蛋白ＳＬＹ１㊁ＭＵＮＣ１８Ｃ和ＸＢＰ１ꎬ使ＩｇＧ的产量提高了２０倍ꎻＲａｈｉｍｐｏｕｒ等[１７]在ＣＨＯ细胞中表达神经酰胺转移蛋白(ＣＥＲＴ)的突变基因使ｔ￣ＰＡ的产量增加了３５％ꎮ２.４㊀表达糖基化酶能产生糖基化的重组蛋白是ＣＨＯ细胞表达系统重要的优势ꎬ研究者们通过建立能表达Ｎ￣糖基化途径中不同酶类的细胞系以增加糖基化重组蛋白的反应性ꎮ如Ｇｏｈ[１８]建立的一个含有Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖转移酶Ｉ基因的突变体ＣＨＯ￣ｇｍｔ４细胞系ꎬ其表达的重组葡萄糖脑苷脂酶将不需要多糖重构可直接用于治疗戈谢病患者ꎮＺｈａｎｇ等[１９]通过ＣＨＯ￣ｇｍｔ５细胞株表达的重组抗体ꎬ其Ｆｃ的Ｎ￣多糖缺少岩藻糖和唾液酸能增强ＡＤＣＣ的作用ꎮ根据ＣＨＯ￣Ｋ１的基因组信息ꎬＹａｎｇ等[２０]通过锌指核酸酶(ＺＦＮｓ)基因敲除的方法ꎬ研究了１９种包括作用于Ｎ￣糖基链分支㊁半乳糖基㊁聚ＬａｃＮＡｃ延伸㊁唾液酸化加盖的Ｎ￣糖基转移酶对Ｎ￣糖基化作用的影响ꎬ为更准确的表达特定糖基化方式的重组蛋白提供了重要参考ꎮ重组ＣＨＯ细胞表达重组蛋白能力的高低ꎬ不能简单的归结为某些关键基因的作用ꎮ为了得到高产的重组细胞株ꎬ需要研究者们综合考虑细胞的代谢情况㊁培养条件㊁蛋白表达效率和蛋白加工修饰能力等诸多因素ꎮ３㊀大规模培养研究基因工程技术㊁细胞融合技术及抗体类药物的迅速发展ꎬ推进了生物反应器培养技术在生物制药中的应用ꎮ由于ＣＨＯ细胞能以悬浮培养的方式高密度培养ꎬ培养体积可达１０００Ｌ以上ꎬ所以在大规模培养和重组蛋白的高产量生产中ꎬＣＨＯ细胞表达系统拥有广阔的发展前景ꎮ在大规模生产中ꎬ通常采用流加培养方式ꎬ通过添加营养物质来延长培养时间ꎬ增加细胞密度和目的产品的浓度ꎮ为了更大程度的提高重组蛋白的生产效率ꎬ研究者们需要根据不同细胞株的生长代谢特点ꎬ选择和优化起始培养基㊁补料培养基及补料策略ꎮ现代计算机技术㊁数学算法及理论的应用ꎬ也为研究者对细胞流加培养的优化提供了很大帮助ꎮ３.１㊀优化培养参数选择合适的培养基㊁优化细胞培养的参数(如温度㊁ｐＨ㊁溶氧㊁ＣＯ２浓度㊁渗透压等)对生产至关重要ꎮ同时ꎬ流加工艺参数(如流加培养基成分㊁流加时间等)均需根据不同的细胞株及反应器的特点来设计优化ꎮＦａｎ等[２１]采用分批补料方式培养ＣＨＯ细胞ꎬ实验显示培养基中的氨基酸和葡萄糖浓度对细胞的生长㊁ＩｇＧ浓度和Ｎ￣糖基化生成都很重要ꎮＫｉｍ等[２２]使用分批补料培养使ＩｇＧ的产量达到２.３ｇ/Ｌꎮ通过用小麦蛋白水解物(ＷＧＨ)代替补料中的谷氨酰胺可以使ｔ￣ＰＡ的产量达到４２２ｍｇ/Ｌ[２３]ꎮ３.２㊀应用新的培养技术微载体培养是一种动物细胞大规模培养技术ꎮ培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面ꎬ从而可实现细胞的高密度培养ꎮ胡显文等[２４]在搅拌式反应器中无血清培养分泌ｕ￣ＰＡ的ＤＮＡ重组ＣＨＯ细胞ꎬ通过部分更换Ｃｙｔｏｐｏｒｅ多孔微载体ꎬ解决了大规模细胞培养中细胞凋亡的问题ꎮ并使用周期变压刺激技术使ｕ￣ＰＡ的产量提高了１０倍ꎬ且可以降低葡萄糖厌氧代谢产生乳酸的转化率ꎮＶｅｎｔｉｎｉ等[２５]通过Ｃｙｔｏｄｅｘ微载体培养ＣＨＯ￣ｈＴＳＨ细胞的实验表明ꎬ培养基中微载体的数量及在ｒｈＴＳＨ合成期开始时的细胞浓度是提高目的蛋白产量的重要参数ꎮ李智等[２６]利用ＣＨＯ细胞能在培养过程中自然结团的特性ꎬ采用超声沉降柱二合一灌流系统促进细胞结团和加强截留的特性ꎬ用无血清培养基连续灌流培养基因重组ＣＨＯ细胞ＭＫ３￣Ａ２株ꎬ分泌表达的ｒｈＴＮＫ￣ｔＰＡ生产率平均为８９ｍｇ/Ｌ ｄꎮ３.３㊀添加保护剂聚醚Ｆ６８可以有效减少生物反应器中搅拌对细胞产生的机械损伤ꎮ针对Ｆ６８对某些细胞株的生长及产量降低的情况ꎬ研究者发现０.０５％或０.０７５％的５００ｋＤａ的γＰＧＡ可以替代Ｆ６８应用于ＣＨＯＤＧ４４细胞的培养中[２７]ꎮ在细胞培养工艺逐级放大的过程中ꎬ每一步都需要研究者们监控细胞在生长和表达方面的相关指标ꎮ生物反应器在线监控ｐＨ㊁溶氧等参数的功能㊁色谱和在线蛋白分解监测等技术为大规模培养的过程控制提供了帮助ꎮ１４２郑惠惠ꎬ等:ＣＨＯ细胞表达系统研究进展. All Rights Reserved.４ 展望ＣＨＯ细胞是表达外源蛋白最多也是最成功的一类细胞ꎬ有其不可比拟的优点ꎬ同时也存在现行技术手段不能弥补的不足之处ꎮ结合生物信息学㊁细胞生物学㊁基因工程技术和生物反应器技术的研究成果ꎬ研究者们可以通过综合考虑细胞代谢特性㊁蛋白表达特性等影响因素ꎬ通过研发个性化培养条件及培养工艺ꎬ构建高表达载体ꎬ筛选稳定高产的重组细胞株ꎬ改造宿主细胞等角度继续优化ＣＨＯ细胞表达系统ꎬ为产业化生产重组蛋白提供基础ꎮ用于产业化生产的重组ＣＨＯ细胞ꎬ需要具备生长特性良好㊁能在无血清培养基中高密度培养㊁表达重组蛋白能力强㊁能正确的进行翻译后修饰等特点ꎮ糖基化是蛋白翻译后最重要的修饰之一ꎬ直接影响重组蛋白的空间结构㊁生物活性㊁稳定性㊁免疫原性和生物反应性等ꎮ对重组蛋白的糖基化研究一直是研发和生产真核重组蛋白的热点课题ꎮ随着基因编辑技术的发展ꎬ研究者们通过表达特定糖基化相关酶从而得到完整㊁准确的特定形式的糖链结构ꎬ为糖基化蛋白在免疫诊断㊁临床治疗等领域的持续发展奠定了基础ꎮ随着基因技术的不断发展ꎬ对细胞代谢㊁信号传导等方面研究的持续深入ꎬ构建能表达准确修饰的糖基化重组蛋白的高产重组ＣＨＯ细胞株仍将成为研究热点ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＤａｖａｍｉＦꎬＥｇｈｂａｌｐｏｕｒＦꎬＮｅｍａｔｏｌｌａｈｉＬꎬｅｔａｌ..ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｐｅｐｔｏｎｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａｏｎｇｒｏｗｔｈꎬｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣＨＯＤＧ４４ｃｅｌｌｓ:ａｎｅｗｉｎｓｉｇｈｔｉｎｔｏａｍｉｎｏａｃｉｄｐｒｏｆｉｌｅｓ[Ｊ].Ｉｒａｎ.Ｂｉｏｍｅｄ.Ｊ.ꎬ２０１５ꎬ１９(４):１９４－２０５.[２]㊀ＳｕｎｇＹＨꎬＬｉｍＳＷꎬＣｈｕｎｇＪＹꎬｅｔａｌ..Ｙｅａｓｔｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅａｓａｌｏｗ￣ｃｏｓｔａｄｄｉｔｉｖｅｔｏｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎｉｎｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ａｐｐｌ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２００４ꎬ６３(５):５２７－５３６.[３]㊀ＤａｖａｍｉＦꎬＢａｌｄｉＬꎬＲａｊｅｎｄｒａＹꎬｅｔａｌ..ＰｅｐｔｏｎｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｈａｓｖａｒｉａｂｌｅｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｉｎｔ.Ｊ.Ｍｏｌ.ＣｅｌｌＭｅｄ.ꎬ２０１４ꎬ３(３):１４６－１５６.[４]㊀ＣｈｕｎＢＨꎬＫｉｍＪＨꎬＬｅｅＨＪꎬｅｔａｌ..Ｕｓａｂｉｌｉｔｙｏｆｓｉｚｅ￣ｅｘｃｌｕｄｅｄｆｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｓｏｙｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓｆｏｒｇｒｏｗｔｈａｎｄｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓｉｎｐｒｏｔｅｉｎ￣ｆｒｅｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ[Ｊ].Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ.Ｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２００７ꎬ９８(５):１０００－１００５.[５]㊀张大鹤ꎬ易小萍ꎬ张元兴ꎬ等ꎬ适于重组ＣＨＯ细胞培养的无血清培养基的制备[Ｊ].中国生物制品学杂志ꎬ２０１１(１０):１１５２－１１５６.[６]㊀刘兴茂ꎬ刘红ꎬ叶玲玲ꎬ等ꎬＣＨＯ工程细胞无血清悬浮分批培养的生长代谢特征及动力学模型[Ｊ].生物工程学报ꎬ２０１０ꎬ(１):８５－９２.[７]㊀ＸｕＪꎬＹａｎＦＲꎬＬｉＺＨꎬｅｔａｌ..Ｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎｔｒｉａｌｄｅｓｉｇｎａｎｄｓｕｐｐｏｒｔｖｅｃｔｏｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｍｅｄ.Ｒｅｓ.Ｉｎｔ.ꎬ２０１４ꎬｄｏｉ:１０.１１５５/２０１４/２６９３０５. [８]㊀ＥｂｅｒｈａｒｄｙＳＲꎬＲａｄｚｎｉａｋＬꎬＬｉｕＺ.Ｉｒｏｎ(ＩＩＩ)ｃｉｔｒａｔｅｉｎｈｉｂｉｔｓｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｉｅｎｔｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓｉｎｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ[Ｊ].Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２００９ꎬ６０:１－９.[９]㊀ＭｉｋｉＨꎬＴａｋａｇｉＭ.Ｄｅｓｉｇｎｏｆｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｇｅｎｅｒａｌｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｍｅｄｉａ[Ｊ].Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ６７(４):６８９－６９７.[１０]㊀ＺｈｏｕＭꎬＣｒａｗｆｏｒｄＹꎬＮｇＤꎬｅｔａｌ..ＤｅｃｒｅａｓｉｎｇｌａｃｔａｔｅｌｅｖｅｌａｎｄｉｎｃｒｅａｓｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒＯｖａｒｙｃｅｌｌｓ(ＣＨＯ)ｂｙｒｅｄｕｃｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅａｎｄｐｙｒｕｖａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｋｉｎａｓｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１１ꎬ１５３(１－２):２７－３４.[１１]㊀ＴｏｕｓｓａｉｎｔＣꎬＨｅｎｒｙＯꎬＤｕｒｏｃｈｅｒＹ.ＭｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓｔｏａｌｔｅｒｌａｃｔａｔｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｄｕｒｉｎｇｆｅｄ￣ｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１５ꎬ２１７:１２２－１３１.[１２]㊀ＭａｊｏｒｓＢＳꎬＣｈｉａｎｇＧＧꎬＰｅｄｅｒｓｏｎＮＥꎬｅｔａｌ..Ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｍａｍｍａｌｉａｎａｎｔｉ￣ａｐｏｐｔｏｓｉｓｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｓｏｍａｔｉｃｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ.Ｄｅｓ.Ｓｅｌ.ꎬ２０１２ꎬ２５(１):２７－３８.[１３]㊀ＣｏｓｔＧＪꎬＦｒｅｙｖｅｒｔＹꎬＶａｆｉａｄｉｓＡꎬｅｔａｌ..ＢＡＫａｎｄＢＡＸｄｅｌｅｔｉｏｎｕｓｉｎｇｚｉｎｃ￣ｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅｓｙｉｅｌｄｓａｐｏｐｔｏｓｉｓ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔＣＨＯｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１０ꎬ１０５(２):３３０－４０. [１４]㊀ＲｉｔｔｅｒＡꎬＶｏｅｄｉｓｃｈＢꎬＷｉｅｎｂｅｒｇＪꎬｅｔａｌ..Ｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆａｔｅｌｏｍｅｒｉｃｒｅｇｉｏｎｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ８ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＣＨＯｃｅｌｌｌｉｎｅｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１６ꎬ１１３(５):１０８４－１０９３.[１５]㊀ＬｅＦｏｕｒｎＶꎬＧｉｒｏｄＰＡꎬＢｕｃｅｔａＭꎬｅｔａｌ..ＣＨＯｃｅｌｌｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｏｐｒｅｖｅｎｔｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎ[Ｊ].Ｍｅｔａｂ.Ｅｎｇ.ꎬ２０１４ꎬ２１:９１－１０２.[１６]㊀ＰｅｎｇＲＷꎬＦｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒＭ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｅｘｏｃｙｔｉｃｖｅｓｉｃｌｅｔｒａｆｆｉｃｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２００９ꎬ１０２(４):１１７０－１１８１.[１７]㊀ＲａｈｉｍｐｏｕｒＡꎬＶａｚｉｒｉＢꎬＭｏａｚｚａｍｉＲꎬｅｔａｌ..ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎｓｅｃｒｅｔｏｒｙｐａｔｈｗａｙｆｏｒｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｉｓｓｕｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓ:ｅｆｆｅｃｔｓｏｆＣＥＲＴａｎｄＸＢＰ１ｓｇｅｎｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１３ꎬ２３(８):１１１６－１１２２. [１８]㊀ＧｏｈＪＳꎬＬｉｕＹꎬＣｈａｎＫＦꎬｅｔａｌ..ＰｒｏｄｕｃｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｅｎｈａｎｃｅｄｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎｕｓｉｎｇＣＨＯ￣ｇｍｔ４ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄꎬ２０１４ꎬ５２４２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.(４):２６９－２７３.[１９]㊀ＺｈａｎｇＰꎬＨａｒｙａｄｉＲꎬＣｈａｎＫＦꎬｅｔａｌ..ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｌｅｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅＧＤＰ￣ｆｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒＳＬＣ３５Ｃ１ｕｓｉｎｇａｎｏｖｅｌＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｍｕｔａｎｔ[Ｊ].Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１２ꎬ２２(７):８９７－９１１.[２０]㊀ＹａｎｇＺꎬＷａｎｇＳꎬＨａｌｉｍＡꎬｅｔａｌ..ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＣＨＯｃｅｌｌｓｆｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｄｉｖｅｒｓｅꎬｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｎａｔ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１５ꎬ３３(８):８４２－８４４.[２１]㊀ＦａｎＹꎬＪｉｍｅｎｅｚＤｅｌＶａｌＩꎬＭｕｌｌｅｒＣꎬｅｔａｌ..Ａｍｉｎｏａｃｉｄａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｆｅｄ￣ｂａｔｃｈＣＨＯｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅａｆｆｅｃｔｓａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１５ꎬ１１２(３):５２１－５３５.[２２]㊀ＫｉｍＢＪꎬＺｈａｏＴꎬＹｏｕｎｇＬꎬｅｔａｌ..Ｂａｔｃｈꎬｆｅｄ￣ｂａｔｃｈꎬａｎｄｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｃｕｌｔｕｒｅｓｗｉｔｈＣＨＯｃｅｌｌｌｉｎｅｓｉｎａｐｒｅｓｓｕｒｅ￣ｃｙｃｌｅｄｒｉｖｅｎｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１２ꎬ１０９(１):１３７－１４５.[２３]㊀ＫｉｍｄｏＹꎬＣｈａｕｄｈｒｙＭＡꎬＫｅｎｎａｒｄＭＬꎬｅｔａｌ..Ｆｅｄ￣ｂａｔｃｈＣＨＯｃｅｌｌｔ￣ＰＡｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｆｅｅｄｇｌｕｔａｍｉｎｅｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｔｏｒｅｄｕｃｅａｍｍｏｎｉａｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｐｒｏｇ.ꎬ２０１３ꎬ２９(１):１６５－１７５.[２４]㊀胡显文ꎬ肖成祖ꎬ高丽华ꎬ等.用多孔微载体大规模长期培养动物细胞的方法[Ｊ].生物技术通报ꎬ２００１ꎬ(１):４５－４８. [２５]㊀ＶｅｎｔｉｎｉＤＣꎬＤａｍｉａｎｉＲꎬＳｏｕｓａＡＰꎬｅｔａｌ..ＩｍｐｒｏｖｅｄｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｗｉｔｈＣＨＯ￣ｈＴＳＨｃｅｌｌｓｏｎｈｉｇｈｅｒｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｐｒｏｖｉｄｅｓｈｉｇｈｅｒｏｖｅｒａｌｌｂｉｏｍａｓｓａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｆｏｒｒｈＴＳＨ[Ｊ].Ａｐｐｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１１ꎬ１６４(４):４０１－４０９.[２６]㊀李智ꎬ肖成祖ꎬ杨琴ꎬ等.ＣＨＯ细胞无血清结团灌流培养:超声－沉降柱二合一灌流系统[Ｊ].中国生物工程杂志ꎬ２００８ꎬ(４):５３－５８.[２７]㊀ＣｈｕｎＢＨꎬＬｅｅＹＫꎬＣｈｕｎｇＮ.Ｐｏｌｙ￣ｇａｍｍａ￣ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓｉｎｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｌｅｔｔ.ꎬ２０１２ꎬ３４(１０):１８０７－１８１０.３４２郑惠惠ꎬ等:ＣＨＯ细胞表达系统研究进展. All Rights Reserved.。
CHO细胞表达体系特点及CHO细胞表达疫苗
CHO细胞表达体系特点及CHO细胞表达疫苗来源：易生物实验浏览次数：533 网友评论0 条CHO细胞表达体系特点及CHO细胞表达疫苗关键词：细胞疫苗CHO细胞表达体系CHO细胞表达分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。
在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。
它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。
本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。
1、CHO细胞表达体系及其特点CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。
也可以悬浮生长。
目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-) 突变株CHO。
近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。
另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在sFM 中生长良好。
与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。
且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。
2、CHO细胞表达疫苗（1）乙肝疫苗CHO细胞表达疫苗的种类不多，多数处于研究阶段。
目前只有CHO表达乙肝疫苗已投入生产，这是除酵母表达乙肝疫苗以外，唯一已用于人类使用的基因工程亚单位疫苗。
cho高效瞬时表达方法
cho高效瞬时表达方法
CHO细胞高效瞬时表达方法是一种用于瞬时转染真核细胞的方法，该方法使用一种重组的腺病毒或质粒载体将外源基因瞬时转染入CHO细胞。
这种方法的优点是转染效率高，能够实现大规模的基因表达和生产，并且可以在短时间内完成实验。
CHO细胞高效瞬时表达方法的具体步骤包括：
1.准备重组质粒或腺病毒载体：将目的基因克隆到质粒或腺病毒载体中，并进行测序验证。
2.转染CHO细胞：将重组质粒或腺病毒载体与CHO细胞混合，通过特定的转染试剂将其导入细胞中。
3.筛选阳性克隆：在转染后的一段时间内，通过特定的筛选方法，如抗生素筛选或荧光激活细胞分选（FACS），从众多的细胞中筛选出阳性克隆。
4.扩大培养：将筛选出的阳性克隆进行扩大培养，以获得更多的目的基因产物。
5.收集产物：在目的基因产物积累到一定量后，收集产物并进行纯化和质量检测。
CHO细胞高效瞬时表达方法的应用范围广泛，可以用于抗体、重组蛋白、siRNA等生物制品的生产和研究。
cho细胞
cho细胞CHO细胞：介绍、应用和挑战概述CHO细胞是在实验室中广泛应用的哺乳动物细胞系之一。
CHO细胞是一类来源于中国仓鼠卵巢的细胞，因其对于重组蛋白质的表达以及可伸缩性等特征而备受关注。
本文将介绍CHO细胞的起源、重要应用以及在生物工艺领域中面临的挑战。
CHO细胞的起源CHO细胞最早是在20世纪60年代末由美国科罗拉多州的科学家T.T. Puck和Philip I. Marcus分离和培养的。
他们从中国仓鼠（Cricetulus griseus）的卵巢中提取细胞，并对细胞进行了培养和传代。
此后，CHO细胞被广泛用于细胞生物学、生物医学研究和生物工艺学等领域的实验室研究。
CHO细胞的应用CHO细胞的重要性和广泛应用可归因于其多种优势。
首先，CHO细胞对于许多外源蛋白质的表达非常高效，包括抗体、生长因子和其他治疗性蛋白质。
其次，CHO细胞在培养过程中的可伸缩性较高，可以根据需求进行扩大培养。
此外，CHO细胞的遗传稳定性也使其成为表达复杂蛋白质的理想选择。
在药物研发领域中，CHO细胞被广泛应用于重组蛋白质的产生。
这些蛋白质包括抗体、细胞因子和其他蛋白质药物。
CHO细胞在这个过程中提供了高表达和生产能力，使其成为制造高质量生物药物的理想平台。
此外，CHO细胞还被用于制造病毒疫苗，如流感疫苗等。
与传统小鼠辐照融合细胞相比，CHO细胞不会带来可能的安全风险，这使得CHO细胞成为开发和生产疫苗的首选模式。
许多已上市的疫苗，例如乙肝疫苗和人类乳头瘤病毒疫苗，都是由CHO细胞生产的。
CHO细胞在基因工程、疾病研究和计算机辅助设计等领域也具有广泛应用。
例如，CHO细胞被广泛用于研究肿瘤生长和转移机制，以及治疗癌症的新药开发。
此外，CHO细胞还被用于生物药物的药代动力学和毒理学研究。
CHO细胞的挑战尽管CHO细胞在生物工艺中的广泛应用，但其仍然面临一些挑战。
首先，CHO细胞的培养和维持成本相对较高。
当前，CHO细胞的培养是一项复杂的任务，需要高质量的培养基、血清和其他辅助物质。
CHO细胞表达抗体1
利用超滤膜将抗体从溶液中分离出来，适用于大规模生产中的抗体 纯化。
鉴定技术
1 2 3
ELISA法
酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的抗体 鉴定技术，通过抗原-抗体特异性结合的原理， 检测抗体的存在和浓度。
Western Blot法
Western Blot是一种将蛋白质从混合物中分离并 检测其特性的技术，适用于抗体特异性和亲和力 的鉴定。
诊断试剂领域
免疫诊断试剂
CHO细胞表达的抗体可用于免疫诊断试剂的制备，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光技术等，用于检测 生物样品中的特定抗原或抗体。
分子诊断试剂
CHO细胞表达的抗体可用于分子诊断试剂的制备，如PCR技术、基因芯片技术等，用于检测生物样品中的特定基 因或蛋白质。
科研领域
抗体库构建
稳定性检测
通过加速稳定性试验等方法检测抗体的稳定 性，确保抗体的长期保存和使用效果。
05
CHO细胞表达抗体的应用
生物医药领域
抗体药物研发
CHO细胞表达的抗体可用于抗体药物 的研发，包括单克隆抗体、双特异性 抗体等，用于治疗癌症、自身免疫性 疾病等。
细胞免疫治疗
CHO细胞表达的抗体可用于细胞免疫 治疗，如CAR-T细胞疗法，通过改造 患者自身的免疫细胞，使其能够特异 性识别并攻击肿瘤细胞。
抗体在科研领域的应用
抗体作为重要的研究工具，可用于研究细胞信号传导、蛋白质相互 作用等生命过程，推动生物医学领域的发展。
02
CHO细胞表达抗体技术
CHO细胞的特点
高效表达
01
CHO细胞具有高效的蛋白表达能力，能够稳定地生产大量的抗无血清培养基中生长，简化了培养过程，降低
CHO细胞表达系统的应用与研究
长生研
CHO细胞的五大应用优势
安全性高 蛋白的转录后修饰 与人体细胞相似
外源蛋白容易在CHO细胞 中合成并分泌到培养基中 可贴壁或者 悬浮培养
BHK
CHO
无血清培养时细胞 密度高于其它细胞
NSO
长生研
FDA批准的CHO细胞表达的生物技术药物
产品 商品名 公司
处于临床研究阶段：
临床前：
长生研
国内CHO细胞表达系统的两大技术瓶颈
表达量低
以tPA为例，达到年产量100克
表达量 g/(106cellsd) 中国 美国 5 50
生产100g/年 需要细胞罐（L） 5000L 500L
生产成本 （美元/克） 60000-100000 6000-10000
适应证
不孕症 不孕症 血清甲状腺球蛋白测试 急性心梗；肺栓塞，急性脑中风
粘多糖贮积病 Gaucher's病 艾杜糖硫酸酯酶缺乏症 Fabry's病 囊性纤维化 急性心梗 血友病B 血友病A 血友病A 多发性硬皮病 肾性贫血 肾性贫血 脊骨退行性病变的脊骨融合 胫骨骨折 转移性结肠癌或直肠癌 B-细胞慢性淋巴细胞白血病 转移性乳腺癌 慢性中重度银屑病 视网膜黄斑退化 CD20+ B细胞non-Hodgkin's淋巴瘤 中重度持续性哮喘 肾移植急性排斥 中重度银屑病 中重度类风湿关节炎；银屑病 脓毒症
长生研
改变细胞的能量代谢途径
引入基因
长生研cho国药集团长春生物制品研究所生物技术研究室200911wwwccibpcom长生研cho细胞表达系统的优势与国内外应用情况cho细胞的工程化构建cho细胞表达平台的意义和流程简介基因重组生物技术产品的表达系统及应用wwwccibpcom长生研基因重组生物技术产品的表达系统?大肠杆菌表达系统?酵母表达系统哺乳动物细胞表达系统分子量较小结构相对简单的蛋白质分子量较大结构较复杂较少糖基化的蛋白质结构复杂或糖基化对于活性非常重要的蛋白质wwwccibpcom长生研大肠杆菌表达系统的应用大肠杆菌表达的生物技术药物有20种分别是甲状旁腺激素利尿钠肽胰岛素及其两种突变体生长激素干扰素和gcsf白介素1ra白介素2白介素11rpa白喉毒素il2融合蛋白ospa脂蛋白等
cho细胞表达
cho细胞表达Cho细胞表达是指在生物学中，利用Cho细胞（Chinese Hamster Ovary cells）作为表达系统来表达外源蛋白质的过程。
Cho细胞是一种常用的哺乳动物细胞系，具有较高的蛋白质表达能力和稳定的遗传特性，因此被广泛应用于生物医学研究和制药工业中。
Cho细胞表达系统的优势在于其能够高效地表达外源蛋白质，并能够正确地折叠和修饰蛋白质。
Cho细胞具有相对简单的遗传背景和较低的背景蛋白质表达，可以避免其他细胞系统中常见的问题，如蛋白质聚集、不稳定、部分折叠等。
此外，Cho细胞的培养和维持相对容易，生长速度快，适应不同的培养条件，对不同的基因表达系统都具有较高的兼容性。
Cho细胞表达系统的应用范围广泛，包括生物医学研究、药物发现与研发、生物制药等领域。
在生物医学研究中，Cho细胞表达系统常被用于产生重组蛋白，如抗体、细胞因子、酶等，用于研究蛋白质功能、结构与机制。
在药物发现与研发中，Cho细胞表达系统被用于产生药物靶标蛋白、药物载体、药物代谢酶等，用于筛选和评价药物候选化合物。
在生物制药中，Cho细胞表达系统常被用于大规模生产重组蛋白药物，如单克隆抗体、重组蛋白等。
Cho细胞表达系统的建立和优化需要考虑多个因素。
首先，选择合适的载体和表达系统是关键。
常用的载体包括质粒、病毒载体等，表达系统可以是稳定转染系统或转染后选择稳定表达细胞的系统。
其次，选择合适的表达宿主细胞株和培养条件也十分重要。
Cho细胞的培养基和培养条件需要根据表达蛋白的特性和需求进行优化，包括培养基成分、温度、pH值、培养密度等。
此外，还需考虑到蛋白质折叠、修饰和纯化等后续步骤。
Cho细胞表达系统的优势也存在一些限制和挑战。
首先，Cho细胞是一种非人类细胞，因此相较于人类细胞，其表达的蛋白质可能存在差异。
其次，Cho细胞在遗传稳定性和蛋白质表达水平上存在一定的变异性，需要进行筛选和优化。
此外，Cho细胞的培养和维持相对费时费力，对于大规模的生产需求可能不太适用。
CHO细胞表达抗体讲义
启动子和相应的增强 子是最关键的元件 真核启动子含有TATA 盒（确定转录起始位 点）和下游富含GC的 序列（决定转录起始 频率）
常用的CHO细胞表达启 动子的转录活性依次
为CMV启动子> SV40 启
动子> LTR启动子
表达盒
抗体基因表达盒的组织形式 已较为固定 ， 但其中各元件 的选择仍有值得探讨的地方
宿主细胞：DG44 质粒：共转染PcDNA3.3（Neo抗
性基因 ， ￥2000） 和Poptivec（DHFR标 记基因 ，￥3500）
筛选试剂：G418（遗传霉素）/MTX （氨甲喋呤）
CHO Cell
CHO-K1
野生型宿主 细胞
CHO-S
GS基因表达系统 瑞士的Lonza公司
宿主细胞：CHO-K1SV 质粒：PEE12.4（Amp抗性 ，GS标记基因， ￥2000） 筛选试剂：MSX（氨基亚砜蛋氨酸）
CHO C l a s s i f i c a t i o n
补充：
1980年CHO-K1经化学突变得到CHO-DXB11 （ 一个等位基因缺失） 1983年的电离辐射经诱变株CHO-DG44 （两个等位基因缺失） 由于CHO-DXB11 DHFR缺陷不彻代
DHFR（ 二氢叶酸还原酶） 筛选原理
◆ 四氢叶酸是一碳单位的载体 ，在 核苷酸的合成中起到重要作用。
◆ 当叶酸类似物MTX不可逆结合后 ， 阻止四氢叶酸合成 。细胞必须产 生更多的DHFR才能维持细胞代谢。
CHO细胞的培养
一般采用F12培养基培养 含10％血清的常规培养基里培养 无血清培养基
GS（谷氨酰胺合成酶） 筛选原理
L-谷氨酸+氨+ATP GS L-谷氨酰胺+ADP+Pi
单克隆抗体纯化过程
单克隆抗体纯化过程引言单克隆抗体是一种高度特异性的蛋白质，被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和治疗等领域。
单克隆抗体的纯化是制备高纯度、高活性的单克隆抗体的关键步骤之一。
本文将详细介绍单克隆抗体纯化过程及其相关技术。
单克隆抗体纯化过程1. 细胞培养与收获单克隆抗体的制备首先需要进行细胞培养。
通常使用哺乳动物细胞（如CHO细胞）作为表达宿主，将表达目标单克隆抗体的重链和轻链基因转染到CHO细胞中。
经过适当的培养条件，使得CHO细胞表达目标单克隆抗体。
当细胞达到一定密度后，可以进行收获。
收获过程中，需要将培养基与细胞分离，并将细胞沉淀下来。
常用的方法有离心和滤液等。
2. 细胞破碎与抗体提取收获的细胞需要进行破碎，以释放细胞内的抗体。
细胞破碎可以通过超声波、高压均质器、刀式破碎机等方法实现。
破碎后的细胞溶液中含有目标单克隆抗体、细胞碎片和其他杂质。
为了提取目标单克隆抗体，需要进行固液分离。
常用的方法有离心和滤液等。
离心可以将细胞碎片和大颗粒杂质沉淀下来，而滤液可以去除较小颗粒的杂质。
3. 亲和层析亲和层析是单克隆抗体纯化过程中最常用的方法之一。
通过利用抗体与特定配体（如蛋白A或蛋白G）之间的特异性结合，将目标单克隆抗体选择性地吸附到固定在亲和树脂上的配体上。
亲和层析通常包括以下步骤： - 树脂平衡：将亲和树脂与缓冲液进行平衡，以确保树脂处于最佳状态。
- 样品加载：将含有目标单克隆抗体的样品加入亲和树脂中，使得抗体与配体结合。
- 洗脱：使用特定的洗脱缓冲液，将非特异性结合的杂质洗脱，保留目标单克隆抗体。
- 再生：通过使用再生缓冲液，将目标单克隆抗体从亲和树脂上解离下来，以便进行下一轮层析。
4. 尺寸排阻层析尺寸排阻层析是一种基于分子大小差异的纯化方法。
通过利用填充在柱子中的尺寸排阻树脂，较大分子（如聚合物）被排除在外，而较小分子（如单克隆抗体）则可以通过树脂。
这样可以有效去除聚合物等大分子杂质。
尺寸排阻层析通常包括以下步骤： - 树脂平衡：将尺寸排阻树脂与缓冲液进行平衡。
CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)表达系统
CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）表达系统CHO细胞表达系统原理分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。
在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。
它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。
本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。
CHO细胞表达体系及其特点诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。
1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20％以上。
各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。
基因工程药物研究与开发的主要环节包括：①基因的克隆和基因工程菌的构造；②重组细胞的培养；③目的产物的分离纯化等。
针对这些主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。
随着基因工程技术的不断发展，目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质(表1)。
大肠杆菌(E.coli)是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于用E.coli生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。
此外，它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。
真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系；因为与其他表达系统相比，它具有许多优点：①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；②具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；③具有重组基因的高效扩增和表达能力；④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高；⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的启分离。
但CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。
cho细胞响应外源蛋白强化能量代谢生产抗体的研究
cho细胞响应外源蛋白强化能量代谢生产抗体的研究cho细胞响应外源蛋白强化能量代谢生产抗体的研究近年来，CHO细胞（Chinese hamster ovary cells）作为一种重要的生物工程细胞线，被广泛应用于生物制药领域。
它们具有许多优点，如易于培养、稳定遗传背景和高产量的能力。
在这个高度竞争的行业中，如何提高CHO细胞的效率成为了一个关键问题。
最近的研究表明，外源蛋白可以通过调节CHO细胞的能量代谢途径，进一步增强其抗体的生产。
本文将探讨CHO细胞对外源蛋白的响应以及这种响应如何影响能量代谢和抗体的生成。
1. CHO细胞对外源蛋白的响应外源蛋白是指在CHO细胞中表达的对细胞而言是外来的蛋白质。
通过转染外源基因并表达该基因编码的蛋白质，CHO细胞可以在其细胞质或细胞外分泌大量目的蛋白。
然而，由于外源蛋白表达会对细胞的代谢过程和生理状态产生影响，CHO细胞会对外源蛋白做出相应的响应。
2. 外源蛋白强化能量代谢研究表明，外源蛋白的表达可以激活CHO细胞的能量代谢通路。
在能量代谢途径中，糖酵解过程被进一步加强，导致葡萄糖的消耗增加。
细胞通过增加线粒体呼吸来提高氧化磷酸化过程的效率。
这些变化使得CHO细胞能够更有效地利用营养物质来产生能量，并为外源蛋白的合成和分泌提供必要的能量支持。
3. 能量代谢与抗体生成CHO细胞的能量代谢与其抗体生成之间存在密切的关系。
研究发现，外源蛋白的表达会促使CHO细胞优先将葡萄糖代谢为乳酸，而不是通过线粒体呼吸产生更多的ATP。
这种乳酸增加使得细胞的酸碱平衡发生改变，并可能导致细胞内部环境的紊乱。
然而，这种改变对CHO细胞的抗体生成并没有明显的影响。
相反，有研究表明，由于葡萄糖的快速消耗，CHO细胞会调整其能量代谢途径，进而得到更多的碳源用于抗体的合成和分泌。
这种现象表明，CHO细胞能够灵活地调节其能量代谢以适应外源蛋白的表达和抗体的需求。
4. 个人观点和理解我认为，CHO细胞对外源蛋白的响应及其强化能量代谢的能力是一种生物工程中的突破。
cho细胞流加培养中抗体片段化形成过程的研究与优化
cho细胞流加培养中抗体片段化形成过程的研究与优化文章标题：CHO细胞流加培养中抗体片段化形成过程的研究与优化近年来，随着生物制药领域的不断发展，CHO细胞流加培养中抗体片段化的研究与优化成为热门话题。
在本文中，我们将对这一主题进行全面评估，并探讨其深度和广度，以帮助我们更好地理解这一重要领域的发展趋势。
1. CHO细胞流加培养中抗体片段化的意义CHO细胞是生物制药领域常用的重要细胞系，其在生产重组蛋白质方面具有优越性能。
抗体片段化是一种重要的生物制药工艺，可以将全长抗体通过特定酶切割成不同的功能片段，以获得更多的应用价值。
研究和优化CHO细胞流加培养中抗体片段化的过程对于提高生物制药产品的质量和产量具有重要意义。
2. 抗体片段化形成过程的研究在CHO细胞流加培养中，抗体片段化的形成过程受到多种因素的影响，包括基因工程构建、培养条件、酶切割等。
通过对这些影响因素的深入研究，可以揭示抗体片段化形成的机制，从而为优化生产工艺提供理论依据。
3. 抗体片段化形成过程的优化针对抗体片段化形成过程中存在的问题，如酶切位点选择、酶反应条件、副产物的清除等，研究人员进行了大量的优化工作。
通过调控工艺参数和优化分子设计，可以显著提高抗体片段化的效率和产量，从而降低生产成本，促进生物制药产业的发展。
4. 个人观点和理解在我看来，CHO细胞流加培养中抗体片段化的研究与优化是生物制药领域的重要前沿课题，其意义和挑战不容忽视。
通过持续深入的研究和创新，我们有望实现抗体片段化生产工艺的高效、稳定和可控，为生物制药行业的可持续发展注入新动力。
总结回顾本文对CHO细胞流加培养中抗体片段化形成过程的研究与优化进行了全面的评估和探讨，从意义、研究、优化、个人观点等多个角度深入剖析了这一重要课题。
通过本文的阐述，相信读者能更全面、深入和灵活地理解这一主题，为相关领域的研究和实践提供有益的参考和启示。
在知识的文章格式中，以上内容会按照序号标注，并多次提及指定的主题文字“CHO细胞流加培养中抗体片段化”，从而满足文章的要求。
CHO细胞表达系统常见问题及解析
1、问：请问有人养过CHO细胞吗？文献报道说用DMEM培养基来养，但我不太清楚具体是高糖还是低糖？参考见解：CHO细胞用高糖DMEM养就可以了，比较好养，10%血清，小牛和胎牛都可以，长得比较慢，跟你所用的血清有一定的关系，大概需要两天传一次代。
在塑料板上比玻璃板上好养，感觉如果在玻璃板上养而且不包被的话，好像细胞不易伸展开来。
2、问：要转染钾通道pcDNA3.1入细胞，是选cho细胞呢还是hek293细胞？cho细胞转染效率高吗？参考见解：表达一个蛋白的时候，首先要确认你的蛋白确实表达了，因为有很多原因可以导致蛋白表达出问题（质粒序列有错误，质粒纯度低，表达的蛋白不稳定，转染效率太低等）。
所以在做任何功能性实验之前，必须要先确认蛋白的表达，通常的实验有：（1）采用免疫荧光法。
由于需要荧光二抗，比较贵。
但直观，可以确定转染效率，采用好的显微镜时，可以大致知道表达蛋白在细胞中的位置。
（2）WESTERN-BLOT。
可以确认表达的蛋白分子量，以及表达的量。
但不直观。
（3）构建一个N或C端带荧光蛋白的质粒。
这样比较费时间，同时携带的荧光蛋（通常使用GFP）有可能干扰蛋白的正常功能。
但好处是转染后可以很方便的观察转染效率，蛋白在细胞中的位置等。
当然以上方法都无法知道质粒有无发生突变，所以如果你的蛋白有表达但没有功能，首先要做一个DNA测序确认你的序列没有问题。
事实上质粒发生突变的机会比大多数人想象的要多得多！3、问：由于我要用CHO细胞生产基因工程抗体，用什么培养基能够很好的使之良好的生长参考见解：培养CHO细胞最好用F12，并且由于F12中加入了一些微量元素与无机离子，因此可以在血清很少的情况下应用，是无血清培养中常用的基础培养基，特别适合进行单细胞培养和克隆化培养。
我们的前辈曾用F12在无血清的条件下成功的克隆出CHO细胞。
无血清培养CHO细胞有两种方法：一种是直接向试剂公司购买只适用于培养CHO细胞的无血清培养基（好像HyClone就有）；第二种方法实际上是有血清培养，只不过血清浓度很低罢了，可以近似的认为无血清。
酵母抽提物对CHO细胞生长及抗体表达的影响
酵母抽提物对CHO细胞生长及抗体表达的影响胡冬冬;赵亮;范里;刘旭平;邓献存;缪仕伟;谭文松【摘要】The objective is to get insights into the effects of yeast extract on Chinese hamster ovary(CHO)cell growth and monoclonal antibody production. We comprehensively investigated the cell growth,antibody production and nutrients metabolism at different yeast extract concentrations in continuous passage culture and batch culture. It was found that yeast extract significantly improved CHO cell growth at low concentration(1 g/L)and remarkably inhibited CHO cell growth at high concentration(5-10 g/L)during continuous passage culture. Additionally,the result of seed cells in batch culture was not influenced while adding the yeast extract during continuous passage culture. Supplementing yeast extract in batch culture medium,a positive correlation was found between specific antibody production rate and the yeast extract concentration with a maximal antibody titer achieved at yeast extract concentrations of 10 g/L. In conclusion,yeast extracts can make a great contribution on animal cell culture process with a strategy of low concentration added at cell growth phase and high concentration added at protein-production phase.%为了深入认识酵母抽提物在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生长及单克隆抗体表达过程中所发挥的作用,综合考察了传代培养和批式培养过程中,不同浓度酵母抽提物条件下CHO细胞生长、抗体表达以及营养物代谢的情况.传代培养过程中,低浓度(1 g/L)的酵母抽提物能够显著促进CHO细胞的生长,高浓度(5-10 g/L)的酵母抽提物则会显著抑制CHO细胞的生长;同时,传代过程中添加酵母抽提物不会影响种子细胞在批式培养中的表现.批式培养过程中,抗体比生成速率随酵母抽提物浓度的提高而升高,浓度为10 g/L时获得最高抗体产量.通过采用细胞生长阶段低浓度、产物表达阶段高浓度的添加策略,酵母抽提物在动物细胞培养过程中可发挥巨大的应用价值.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2017(033)006【总页数】8页(P162-169)【关键词】动物细胞培养;CHO细胞;酵母抽提物;单克隆抗体;氨基酸代谢【作者】胡冬冬;赵亮;范里;刘旭平;邓献存;缪仕伟;谭文松【作者单位】华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237【正文语种】中文抗体类药物以其高特异性、高亲和力且对人体低毒害性等优点，已成为当今医药产业的主流研发产品。
金属离子对 CHO 细胞抗体表达及抗体电荷分布的影响
金属离子对 CHO 细胞抗体表达及抗体电荷分布的影响张鑫涛;唐红萍;赵亮;范里;刘旭平;缪仕伟;谭文松【摘要】The objective of this work is to get insights into the role of metal ions in the production of the monoclonal antibody(mAb) during Chinese hamster ovary(CHO)cell cultures. Cell growth,antibody production and antibody charge distribution at different concentrations of copper and zinc ions during cell cultures were comprehensively investigated. It was found that 120 nmol/L copper ion and 50μmol/L zinc ion were the optimal concentrations for cell growth and antibody production. Excessively low or high levels of copper and zinc ions brought negative impacts on cell growth and viability maintenance. Additionally,copper ion and zinc ion,as the inhibitor and cofactor of basic carboxypeptidase respectively,showed considerable effects on antibody charge distribution. The medium containing 50 nmol/L copper ion and 50 μmol/L zinc ion was the most conducive to the reduction of charge variants and the increase of main species. Both excessively low or high concentrations of copper and zinc ions led to the increase of the antibody charge variants and the reduction of main species. The concentrations and ratios of copper and zinc ions altered the enzymatic digestion at antibody C-terminal lysine,subsequently affected the content of the basic variant. Additionally,the working space of copper and zinc ions for process control of antibody charge variants was preliminarily discussed. In conclusion,the metal ions play important roles in cell growth,mAb production and mAb charge distribution during CHO cellcultures.%旨在深入认识金属离子在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养生产单克隆抗体过程中所发挥的作用。
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CHO Cell
CHO-K1
野生型宿主 细胞
CHO-S
GS基因表达系统 瑞士的Lonza公司
宿主细胞：CHO-K1SV 质粒：PEE12.4（Amp抗性，GS标记 基因，￥2000） 筛选试剂：MSX（氨基亚砜蛋氨酸）
DHFR基因表达系统 Life Technology公司
Freedom CHO-S Kit
宿主：CHO-S Cell （cGMP-banked） 培液：CD-FortiCHO Medium 限制性内切酶： AvrII/BstZ17I ，EcoRV /Pacl 线性化酶：NruI 转化：Neon® electroporation Transfection 筛选试剂：Puromycin/MTX 筛选方法：两轮加压筛选 单克隆筛选：有限稀释法
使用广泛的有BGH polyA site，转录 终止作用强于SV40.
表 达 盒
抗体基因表达盒的组织形式 已较为固定，但其中各元件 的选择仍有值得探讨的地方
PcDNA3.3/Poptiv ec载体系统
常用的较早的商业化载 体系统
适用于DHFR缺陷细胞， 但是有报道CHO （DHFR-)细胞，很难驯 化，生长也不好。
重组质粒Poptivec-target整合到宿 主菌染色体组上后的阳性菌可在不含 GHT的培养基中生长。
进一步用G418和MTX筛选，在MTX浓度 选择压力下，dhfr基因与其共转染的 目的基因一起扩增，提高目的蛋白表 达。
GS系统
瑞士的Lonza公司
Sigma、药明康德等公司都在自己 构建载体使用（只要知道载体的几 个原件可以自己全部合成）
CHO Classification
补充：
1980年CHO-K1经化学突变得到CHO-DXB11 （一个等位基因缺失）
1983年的电离辐射经诱变株CHO-DG44
（两个等位基因缺失）
由于CHO-DXB11 DHFR缺陷不彻底，很快被完全无DHFR活性
的CHO-DG44取代
注释：
ATCC （American Type Culture Collection） 美国菌种保藏中心 ECACC（ European Collection of Authenticated Cell Cultures） 欧洲细胞株/微生物保藏中心
CHO表达载体组成
原核基因序列
大肠杆菌复 制子及抗生 素抗性基因
在原核细胞 中大量扩增 和制备
真核基因序列
在哺乳动物中 有效的转录启 动子、增强子 元件、终止子 PolyA序列
在CHO细胞 中大量表达目 的蛋白
筛选标记
抗生素类筛 选标（Neo） 细胞代谢类 筛选标记 (MTX MSX)
筛选出稳定 表达较多抗 体的细胞株
核糖体进入位点
启动子下游有真核的 核糖体进入位点，通 常为GCCGCC A/GCCAUGG+4的 共有序列
IRES具有较强的起始 翻译的能力，研究发 现，某些动物的基因 前存在类似IRES的序 列，可以独立启动翻 译，并且翻译效率很 高，可称之为翻译型 增强子
转录终止信号和 PolyA加尾信号
影响mRNA的有效 合成和稳定性，提 高胞浆中能进行有 效翻译的 mRNA浓 度，提高表达水平。
CHO细胞表达抗体
基因工程抗体表达体系
酵母 细胞
昆虫 细胞
哺乳动物 细胞
CHO 细胞 骨髓瘤细胞
CHO（Chinese hamster ocary）
CHO细胞生物技术产业化的首选细胞系 目前70%以上的治疗性抗体蛋白都是由CHO细胞产生的 对蛋白质进行糖基化，其糖型与人类基本一致 不易传播人类病毒，比其他哺乳细胞基因组更容易进行改造和扩增 遗传背景清楚、转染效率高、可长期稳定传代并稳定表达有功能活性抗体 利于抗体纯化：非分泌型细胞，本身很少分泌内源性蛋白；可用无血清培养
整合位点 基因剂量 转录 翻译 加工组装 分泌 其他
相应策略
弱化选择标致基因；染色体定位筛选 弱化的可扩增选择标志基因 强启动子、增强子、强转录终止信号、适宜的抗体基因结构 翻译型增强子，适宜的抗体基因结构 轻重链表达平衡，宿主细胞修饰 适宜的抗体分泌前导肽，适宜的抗体基因结构 选择适宜的宿主细胞、宿主细胞修饰，尽量去除非生产性克隆
宿主细胞：CHO-s® Cells (cGMP-
banked) 质粒：pCHO1.0（嘌呤霉素和DHFR标 记基因，￥10000） 筛选试剂：Puromycin/MTX（氨甲喋 呤）
抗体真核高效表达策略
作用环节
抗体mRNA的转录、转 录效率与mRNA的稳定 性是其中最重要的因素
因此，抗体的表达量很 大程度上由质粒载体的 各表达调控元件及组织 方式决定
GS系统
新近发展的更有效的 系统
具有更高的扩增效率， 但细胞长期连续培养 时，生长状况不佳。
DHFR系统
DHFR系统表达水平虽 较GS系统低，但细胞 生长稳定
PcDNA3.3/Poptivec载体系统
将右图质粒共转染CHO（DHFR-）
宿主菌须在含有GHT（甘氨酸、次黄 嘌呤、胸腺嘧啶）的培养基中生长
表达载体结构组成
骨架序列 选择性标志基因 表达盒 特殊的调控序列
选择标志基因
共扩增基因
（DFHR和GS）
当环境中存在高浓度 （MTX 、MSX）时，标记 基因可自发在染色体上扩 增拷贝数，连带其上下游 的序列一起扩增，共扩增 序列可达上千个bp，拷贝 数可增加几百到几千倍。
非扩增基因 （neo）
对目的基因的拷贝数 没有影响，如主要用 于构建瞬时表达载体。
启动子
启动子和相应的增强 子是最关键的元件 真核启动子含有TATA 盒（确定转录起始位 点）和下游富含GC的 序列（决定转录起始 频率）
常用的CHO细胞表达 启动子的转录活性依 次 为 CMV 启 动 子 > SV40 启动子> LTR启 动子
DG44
DHFR缺陷型 宿主细胞
DUXB11
PcDNA3.3/Poptivec 载体系统 Life Technology公司
宿主细胞：DG44 质粒：共转染PcDNA3.3（Neo抗 性基因，￥2000）和Poptivec （DHFR标记基因，￥3500） 筛选试剂：G418（遗传霉素）/MTX （氨甲喋呤）
宿主细胞：CHO-K1 质粒：PEE12.4 筛选试剂：MSX（氨基亚砜蛋氨酸）
1992年，Bebbington等首次使用GS基因细胞系统表达重组抗体
PEE12.4
PEE12.4 4 12.4
GS（谷氨酰Байду номын сангаас合成酶）筛选原理
L-谷氨酸+氨+ATP GS L-谷氨酰胺+ADP+Pi
DHFR系统