神经细胞培养2

传代时注意事项：a 细胞没有生长到足以覆盖瓶 底壁大部分 表面以前，不要急于传 代 b 注意观察不同细胞有不同的消化时 间；动作要轻柔，避免损伤细胞
c 首次传代时细胞数量要多一些，使 细胞尽快适应新环境
鉴定：星形胶质细胞鉴定： 胶质原纤维酸性蛋白 （Glial fibrillary acid protein GFAP， A2B5） 少突胶质细胞 鉴定：GalC（ß -galactosidase)
3）：研究的样本可以达到比较均一性 4）：研究的内容便于观察、检测和记录 5）：研究的费用相对比较经济 6） ：可作为一些遗传物质的运载细胞 7) ：干细胞的广泛应用前景
3 组织或细胞培养的不足：1）与体内条件存在差 异 ；2）细胞培养存在一定的不稳定性
培养细胞学的研究内容
1 培养细胞学在病毒学中的应用
2 细胞生物学的基础研究: 细胞培养使细胞生物学迅速发展 3 细胞工程学的研究手段，利用细胞融合及杂交技术，进行细 胞工程的研究与开发。 4 干细胞的培养及应用 5 淋巴细胞培养技术的应用 6 遗传性疾病的产前检查 7 细胞作为毒性实验及生物安全性实验的工具 8 细胞培养在现代生物技术中应用很广，如基因分离，基因测 序与表达，基因转移与重组，癌基因的研究等。
4 培养细胞的特性 1）培养细胞生长方式： a 贴附生长型细胞 （大多数） b 悬浮生长型细胞（少数） 2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性
5 培养细胞生长的条件 1）细胞的营养需要： a 基本营养物质 ：氨基酸 、维生素、碳水化合物及一些无机离子； b 营养因子等物质 2）细胞的生存环境： a 温度：哺乳动物和人类 为35~37℃；鸟类为38.5℃ b 气相及PH 值 ：O2及 CO2的值： CO2=5%；PH=7.2~7.4 c 渗透压：260~320m mol/L
培养的方法：
1）取材 生后1天的大鼠，75%酒精消毒， Байду номын сангаас头，置于培养皿中
2）沿纵轴剪开皮肤和颅腔，取出大脑皮 质，去除嗅球等
3 去除脑膜，洗涤 （Hanks液） 4） 组织剪成碎块，37℃缓慢振荡约10 min。 5）胰蛋白酶消化 6)重复吹打，自然沉淀数次，收集细胞悬液
（或者6 ）移入试管吹打或加入胰蛋白酶形成单 细胞悬液 7） 加入完全培养基终止 8）调整细胞密度104~106/cm2接种于培养瓶，常规 CO2孵育箱培养 9）接种3天后换液，以后每两天换液 10）传代, 0.25% 胰蛋白酶消化（覆盖细胞层即可） 或着用摇晃的方法
NaCl KCl CaCl2 MgCl .6H2O MgSO4.7H2O Na2HPO4.H2O
9．00 0．42 0．25
8．00 0．20
6．80 0．40 0．20
8．00 0．40 0．14
8．00 0．20 1．10 0．10
8．00 0．40
0．20 1．56
0．20 0．06 0．06
Na2HPO4.2H2O KH2PO4 NaHCO3 葡萄糖 酚红 0．20
1．14 0．06 3．20 1．00 0．02 0．35 1．00 0．02
2．42 0．20 0．06 0．35
0．02
0．02
细胞计数法：
原则：取0.1 ml细胞悬液 加 Hanks 液0.9ml，混 匀后滴于血细胞计数板上， 在低倍显微镜下计 数四角大方格内细胞。计数过程中对于大方格 边缘压线按照数上不数下，数左不数右的原则。
四、神经元的鉴定：
神经元特异性烯醇化酶（ Neuron specific enolose NSE）、 微管相关蛋白（Microtubule associated protein MAP2） ——神经元,
五、神经元的纯化：
1. 胞嘧啶阿拉伯糖 ，培养2d 后用含5~10 mol/L 胞 嘧啶阿拉伯糖的培养24 hour ,然后改用常规培养 液。 2. 特殊培养液：neurobasal 培养基
培养过程中注意事项
1） 培养底物的处理： 多聚赖氨酸和多聚鸟氨酸、PEI
细胞外基质成分（胶原） 细胞黏附分子
单层非神经细胞 单层的胶质细胞
2） 胰蛋白酶的作用时间： 3）细胞合适的换液时间：大脑皮质 不用经常换液 海马神经元应半量换液 胶质细胞经常换液
六、神经元的观察：
刚分离出的神经元呈圆形，用倒置显微镜观察有明显 的光晕。 •接种一般在2-6小时可贴壁；8小时已有纤细有突起长 出 •24小时后可见细胞体积开始增大，呈圆形或椭圆形。 生长良好的细胞可见胞体周围有明显的光晕，立体感强， 突起以单、双突起为主 •培养至第4天，神经元胞体明显增大，形态多样，有些 具有分枝的突起， •培养7天后，神经元形态基本成熟，具有光滑的胞体， 发育良好的突起。
第0-12天 大鼠脑皮质混合细胞培养
第12天 预震荡（260rpm，1.5h）收获非贴壁细胞
37℃培养1h
震荡（260rpm，18h）
收获贴壁细胞
第13天 贴壁的扁平细胞 非贴壁的，有突起的细胞， （processing bearing PB）
富含小胶质细胞
(oligodendrocyte-2-typeastrocyte, 0-2A
3) 聚L -赖氨酸：处理培养皿（瓶）（10mg/L）5-10 min
4) 神经营养因子： 睫状神经营养因子（ ciliary neurotrophic factor, CNTF): 支持交感神经、副交感神 经和感觉神经的生长与存活； 脑源性神经营养因子 （brain derived neurotrophic factor ,BDNF):支持外周 和中枢特殊细胞群体的神经细胞； 硷性成纤维生长 因子（basic fibroblast growth factor, bFGF ) 等
运动神经元 Dil标记
Purkinje cell in culture (PEP-19)
二、胶质细胞的培养
胶质细胞 纤维性 的分类：a大胶质细胞— 星形胶质细胞 原浆性
少突胶质细胞
b小胶质细胞 周围神经系统主要是施万细胞
根据免疫组化反应分类：
Ⅰ型星型胶质细胞和Ⅱ型星型胶质细胞：

培养基：1天然培养基（血清，血浆，组织浸出液，水解乳蛋白）
2 合成培养基（ＭＥＭ ＤＭＥＭ ＨＡＭ`S F12 ＲＰＭＩ（１６４０） １９９ Ｌ－１５ ）等
常用的平衡盐溶液（g/L）
Ringer (1985) PBS Eargle (1948) Hanks (1949 Dulbecco (1954) D-Hanks
神经营养因子的分泌：
酶的诱导、蛋白质的合成 神经递质的摄取 髓鞘的形成 神经的局部免疫反应
代谢过程
胶质细胞培养的局限性
1 大多来自于未成熟大脑，所以不能达到与体 内相一致的成熟程度，即使成年也可能有干 细胞的存在。其形态可能随培养条件而发生 变化。 2 存在不同的细胞亚群 3 其性质有赖于他们与特殊神经元相互作用。
4个大方格内细胞数
细胞浓度=
4
× 104 × 稀释倍数 = 细胞数/ml
细胞活性的检查 台盼蓝染色： 0.2 ml 细胞悬液加0.4 ml台盼蓝溶液混 合，滴少许于载波片上， 低倍镜计数 200细胞，算比率，正常不着色，死细 胞为兰色
细胞活力（%）=（细胞总数-着色细胞数）/总细胞数×100%
第 二节：神经细胞体外培 养的 基本概念和方案
含10%胎牛血清培养 富含Ⅱ型星型胶质 细胞
化学 限定 培养
富含少突交质细胞
富含І型星型胶质细胞
培养用液
培养基：MEM450ml + 血清 45ml+GLU-谷氨酰胺 – 青链霉素溶液8ml 葡萄糖-谷氨酰胺 –青链霉素溶液（100ml） ：葡萄 糖 30g；谷氨酰胺 100mmol/l；青霉素 2.5 × 105U; 链霉素 2.5×10 μg 胰蛋白酶：0.25% 少突胶质细胞的限定培养液：F12 与DMEM（高糖， 4.5 g葡萄糖/L 1：1混合 后加入：BSA ：终浓度为 0.66 mg/ml ,胰岛素 :10ng /ml; 孕酮:20 nmol/l; 腐 胺:100µ mol/l; 碳酸氢钠: 3.6 g/l; 硒: 5ng/ml; T3: 30nmol/l; 转铁蛋白: 50 µg/ml.
神经细胞培养
第一节：细胞培养的基本知识
1定义： 组织培养 (Tissue culture ) ：
细胞培养 (cell culture)： 器官培养 ( organ culture)：
统称为体外培养 （In vitro)
2 组织或细胞培养的优点： 1）：研究对象是活细胞
2）：研究条件可以人为的控制
MAP-2
A
B
NSE stain neuron
TH stain neuron
Confocal laserscan images of organtypic slice culture from avian hippocampus
N
Slice culture. Lucifer yellow stain (bar 50µ m)
三、培养操作过程
• 新生1～3d 大鼠或者胚胎18-19d大鼠，麻醉后75%酒精浸泡消毒，
断头后移入超净工作台，无菌条件下开颅，快速取脑，置于DHanks液中，仔细剥除脑膜和血管，小心剥离脑组织（海马），放入 10ml小瓶中 •剪碎，加入0.25%胰蛋白酶放入37℃培养箱，定期振摇促消化。消 化约20min， •用含血清的DMEM培养液终止消化，吸管反复轻柔吹打，用200目 不锈钢筛网过滤，将滤液分散组成制成细胞悬液，1000rpm/min离心、 洗细胞两次，每次10min， •吸收细胞悬液，用血球记数板快速计数细胞数， •用含10%胎牛血清的DMEM培养基，稀释细胞制成一定浓度细胞悬 液，接种于经多聚赖氨酸处理过的24孔培养板或培养瓶内（板孔放 置0.8х 0.8cm的小盖玻片），放入5%CO2培养箱，37℃培养。
一、组织来源： 1） 种属： 大鼠 小鼠 家鸡 瓜蟾 海兔 蜗牛 水蛭 等
2）年龄：一般为胚胎或新生动物组织
神经胶质细胞：生后早期 大部分神经元 ：胚胎末期 颗粒细胞： 生后两周以内 主要根据轴突和树突广泛分枝发育之前培养
二、常用试剂
1） 培养液 A DMEM ： B F12 培养液 C DMEM/F12 培养液 D 无血清培养液加神经营养因子 E Neurobasal 培养液 2） D-Hank`液（其中可加入牛血清白蛋白3g/L）（ HBSS）

神经细胞培养的类型 1 原代培养
原代培养（primary culture)：指从活体获得细胞、组织或器 官在体外条件下进行的第一次培养 传代培养(subculture)：当细胞持续生长到达一定密度之后，就 应当将细胞分成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充新的 培养液为传代培养。
2 细胞系培养
一 神经元的原代培养(Primary culture)
+
— + + + — — + + —
—
— + + — + + +
—
+ + + — + + — — —
125I-CYP NG2 L1 Ia
研究胶质细胞的方法
1） 从未成熟的脑组织分离、培养获得 大量胶质细胞 2）已经开发出能识别胶质细胞的免疫学 标志物。
利用细胞培养可研究胶质细胞 的特性
受体的表达：星型胶质细胞和少突胶质细胞可与传 统的神经递质发生反映。（І型胶质细胞可表达25种 神经配体的受体
标志物 检测对象 Ⅰ型 形态 A2B5 GFAP 多聚唾液酸神经节苷脂 胶质纤维酸性蛋白 多角型 — + 细胞类型 Ⅱ型 星型 + + 少突胶质细胞 具有少量突起 + — —
Ran-2
GC GD3
3H-GABA
大鼠神经抗原-2
半乳糖脑苷脂 GD3神经节苷脂 GABA摄取 Β-肾上腺能受体 300kDa蛋白聚糖 细胞黏附分子 Ⅱ型MHC抗原
3) 无污染及无毒：体外培养的细胞必须生 长于无污染及无毒的环境！！ 无毒：与细胞直接接触者—培养器皿、 底物、培养基，蒸馏水等； 间接接触者—配制培养基的器皿、 瓶盖、瓶塞等 无污染： 微生物及交叉污染，（霉菌污 染常见）
6 常用的培养用液及培养基

培养用液：水
平衡盐溶液（ＢＳＳ）（见表）作用： 消化液１胰蛋白酶液（０．２５%） ２二乙烯四乙酸二钠（ＥＤＴＡ） ３胶原酶： 甘氨酸 羟脯氨酸敏感