神经细胞培养2
神经细胞的培养
海马神经元的培养总结1.新生大鼠海马常规取法：断头，线剪剪去皮肤，组织剪从椎管纵向剪开颅骨，再颅顶横向剪一刀。
暴露两侧大脑半球，用小弯镊翻出大脑，延纵裂分别向两侧翻开大脑半球，在底部可见新月形的海马，用眼科镊取出置于冰浴的盐溶液中，在解剖镜下剥离周围组织和血管膜。
2.培养基：我用的接种培养基是DMEM/F12+10的胎牛血清＋胰岛素＋葡萄糖＋谷胺酰胺，维持培养基里就是多加了5uM的阿糖胞苷。
培养液的pH调至6.8—7.4可，最好不要调至7.4或高。
一般在培养液放置两周后，加入终浓度为2mM的谷氨酰胺3.胰酶：酶用0.125的。
其实一次性消化比较简单，关键是消化时间不要太长，不知你用多长时间，一般是15-20分。
4.多聚赖氨酸的配置：可以用去离子水配, 也可以用D-HANKS也配(我用的配方),或者PBS 效果都差不多. 一般先配成1mg/ml的母液, 用高压过的滤器过滤,最好分装以后放在-20度, 用的时候再稀释至0.01mg/ml.5.铺板：我的办法是将盖玻片直接经泡酸后要反复的洗干净，用单蒸后用双蒸水。
后放在75％的酒精中浸泡半个小时以上，在超净台中取出后用酒精灯烧一下，注意不要太久，以防破碎，后放在24或6孔板中，加入稀释好的多聚赖氨酸，室温放置3小时以上或过夜，切记不要照紫外，可以在上面覆盖东西。
结束后回收多聚赖氨酸，并用灭菌水或PBS等清洗三遍以上即可使用，我用的效果非常好。
6. 1. 盖玻片洗净之后, 需要泡酸过夜处理, 这样玻片会比较干净, 养原代背景会干净的多. 就算是新的也要洗(曾经有过教训).2.包被多聚赖氨酸用之前要用高压的去离子水洗3遍,再用D-HANKS过一遍.3. 多聚赖氨酸包被时,如果有条件可以放在4度振摇过夜,效果更佳.4. 神经元细胞种植之前1小时把种植培养基加进去,会提高细胞活力.7.纯化细胞方法：1.差速贴壁：接种前可将制备的细胞悬液放入底面积为75cm2的培养瓶中（未包被），然后放入37度，5%CO2培养箱中半小时，然后再过滤，转移至培养皿/瓶中。
neurobasal 神经细胞培养步骤
neurobasal 神经细胞培养步骤
神经细胞培养使用的神经基底培养基（Neurobasal）通常包括
以下步骤：
1. 准备培养器具：将所需的培养器皿（如细胞培养皿、培养瓶等）进行灭菌处理，确保无细菌或其他污染物。
2. 制备培养基：根据厂家提供的说明书，将神经基底培养基配制好。
通常需要将粉末溶解于培养基补充剂（如B27或N2）中，并加入适量的血清等。
3. 细胞分离：将神经组织（如海马、皮质等）分离并收集。
可以使用酶（如胰酶、纤溶酶等）或机械切割方法（如切割刀或离心式分离）。
4. 细胞孵化：将分离的细胞在预先灭菌的培养器皿中分散均匀，加入预先配制好的培养基。
5. 营养物质补充：在培养基中加入适量的营养物质，如氨基酸、维生素等，以促进细胞生长和分化。
6. 培养条件调节：将培养器皿放入恒温培养箱中，并保持适宜的温度（通常为37°C）和湿度，同时提供适量的CO2（通常
为5-10%）。
7. 细胞观察和维护：每天观察细胞的生长情况，检查细胞形态和健康状况。
适量更换培养基，以保持培养环境的稳定。
需要注意的是，具体的步骤可能会因实验设计的不同而有所差异，因此最好参考实验操作手册或厂家提供的指导。
此外，神经细胞培养也需要一定的专业知识和操作经验，对于初学者来说可能需要辅导或指导。
神经干细胞体外培养技术
神经干细胞体外培养与鉴定一前言神经干细胞(Neural stem cells, NSC S)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。
文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。
此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。
根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。
基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。
本实验拟建立绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。
二实验所需仪器、试剂及其配制（一）实验仪器光学显微镜（Olympus,Japan）倒置荧光显微镜（LEICA DMIRB）冰冻切片机（Leica CM1900，Germany）光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂）XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200 电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)MP 8001单臂脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司)10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISION SAMPLINGCORP，BATON ROUGE，LOUISIANA，Made in USA）0.5ml、1ml Eppendorff管（Ependorff）手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。
（二）试剂1. DMEM/F12，Hank's液（Hyclone），N2（Gibico），bFGF（Invitrogen）。
神经元细胞培养步骤
海马神经元细胞培养一、实验前准备1.手术器械、培养皿、筛网的消毒2.多聚赖氨酸的配制3.培养板处理：（培养板中可加入小的圆形玻片，多次使用）(1)用多聚赖氨酸室温包被5min，随后吸取多余液体，晾干。
(2)用PBS洗一遍，吸取PBS后晾干备用。
4.胰酶的配制5.PBS的配制二、操作步骤1. 新生一天的小鼠，酒精喷洒全身，置于干净的培养皿中，用手术剪刀剪下头部，放入另外一个干净的培养皿中（五只）。
2.用干净镊子取出全脑放于（冰）的PBS的培养皿（10cm）中，置于解剖显微镜下。
3.移入解剖显微镜下，分离出皮层或海马组织，去除血点，移入盛有HOOD下的培养皿中。
4.将皮层或海马组织剪成1-3mm的小块，用0.25%，2ml胰酶-EDTA 消化，37ºC水浴消化30分钟，每消化10分钟振摇一下。
30分钟后，用移液枪吸取可见组织，放入离心管中，并加入与胰酶等体积的DMEM （HG）+10% FBS培养液终止消化，吹打20次左右，注意动作轻柔，不要吹打出气泡。
5.如果组织明显不能吹散或粘稠的话，过一下200目筛网。
过滤液DMEM，进入大离心管中。
离心800r，3min。
弃去上清，加入DMEM 培养液，分装在培养皿（6cm）中，放入含5% CO2 的37C恒温培养箱内培养。
6.6-8小时（或第二天）后换液，用PBS液先洗两遍，并上下左右摇晃10次左右，去除一些细胞碎片，随后培养液换成Neurobasal 培养液+B27（2%）+谷氨酰胺（0.5mM）（+双抗)继续培养，并且3天半换液一次。
7.到第八天时，将培养液换成新鲜Neurobasal无B27、谷氨酰胺、双抗，开始用于实验。
神经元细胞培养步骤
神经元细胞培养
灭菌准备：
1、将玻璃培养皿（3个）、滤器（清洗、换滤片、锡纸包裹）放入盒中、将盒拿到桶中灭菌
2、将显微镜搬至超净台灭菌
3、将直头镊（1个）、弯头镊（1个）放入盛有酒精的小烧杯，放入超净台
材料准备：17天孕鼠、冰块、75%酒精、50mL离心管、PBS、胰酶、培养基、双抗、注射器、灭菌的显微镜、灭菌的玻璃培养皿（3个）、10cm培养皿（1个）、计数器、包被好的培养板
1、处死孕鼠，取小鼠，放入50mL离心管（冰块上），移至超净台，
2、将小鼠倒入盛有PBS的玻璃培养皿中，关灯，开显微镜
3、将头取出（左手直头镊，右手弯头镊），放入盛有PBS的玻璃培养皿中
4、夹取皮层（皮质及髓质），放入盛有PBS培养皿中，移去显微镜
5、将PBS倒入50mL离心管
6、用枪弃去PBS，再以PBS洗3次，晃匀
7、弃去PBS，加入5mL胰酶，放于37℃细胞培养箱内5分钟
8、弃去胰酶，以PBS洗2次，吸掉
9、加入5mL PBS,对着底面吹打成悬液
10、吸至50mL离心管中，
11、灭菌后的滤器置于15mL离心管，用注射器将细胞加入，抽空气再吹数次
12、离心，25℃，1500rpm，5分钟
13、配制培养液，混匀
14、弃上清，将离心管中加入5mL培养液，吹打成悬液
15、再加入5mL培养液，再次吹打
16、加1滴加至计数器中央，显微镜下观察，
17、20—50个/每16小格，即20—50 ×104 = 2—5×105，若密度加大，则加入培养液稀释
18、加100uL至96孔板中（四边不用），晃匀，
19、放37℃细胞培养箱。
各类神经元细胞的培养方法
各类神经元细胞的培养方法神经元细胞是神经系统中的主要细胞类型之一，负责传递神经信息和调控神经功能。
神经元细胞的培养是神经科学研究和临床治疗的重要工具。
通过细胞培养，可以研究神经元的发育、功能和病理机制，同时也可以应用于药物筛选、组织工程和神经修复等领域。
下面将介绍一些常用的神经元细胞培养方法。
1.原代培养2.细胞系培养细胞系是已经建立起来的可持续增殖和培养的细胞株。
细胞系培养可以使用血清或无血清培养基。
通常，将细胞系继代传代，以保持其细胞特性和增殖能力。
细胞系培养可以持续扩大细胞数量，并用于大规模试验和应用，如药物筛选和基因表达研究等。
3.单细胞培养单细胞培养是将单个神经元细胞分离和培养。
首先，通过机械或酶消化方法将神经组织分散为单细胞悬浮液。
然后，通过单细胞分选技术，将单个神经元细胞分离并分配到各个培养孔中。
最后，单个细胞通过培养基提供的营养物和因子进行生长和分化。
单细胞培养是研究神经元个体特性、细胞发育和功能的重要手段。
4.同代培养同代培养是将同一类型的神经元细胞培养在同一培养物中，以形成功能连通的细胞群。
同代培养可以通过多孔膜培养皿、微流控芯片和三维支架等技术实现。
通过细胞之间的相互作用和联结，同代培养可以模拟神经系统的复杂性和功能，用于研究神经网络特性和神经系统发育。
5.共培养共培养是将不同类型的细胞培养在同一文化器皿中，以研究细胞之间的相互作用和信号传递。
常见的共培养方法包括胶质细胞和神经元细胞的共培养，以及神经元细胞和非神经元细胞的共培养。
共培养可以提供更接近体内情况的环境，用于研究细胞间相互作用和细胞发育过程。
神经细胞培养实验报告
神经细胞培养实验报告摘要：神经细胞培养实验是一种常用的实验技术，可以用于研究神经细胞的生理功能和疾病机制。
本实验通过对小鼠皮层神经细胞进行培养，观察细胞的形态特征、生长情况和突触结构的发育，以探究神经细胞的发育过程和突触的形成。
实验结果表明，在适当的培养条件下，小鼠皮层神经细胞可以有效地培养并形成功能性突触。
1. 引言神经细胞是大脑和神经系统的基本组成单位，对于理解神经活动和疾病机制具有重要意义。
神经细胞培养实验通过将神经细胞置于适当的培养基中，提供所需的细胞外环境，并模拟神经系统的发育过程，使神经细胞得以存活和发育。
本实验旨在通过对小鼠皮层神经细胞的培养，观察其生长情况、突触结构的发育以及可能出现的变化。
2. 材料与方法2.1 神经细胞培养基的制备2.2 小鼠皮层神经细胞的分离和培养2.3 细胞形态观察2.4 突触结构分析2.5 细胞存活率检测3. 结果3.1 神经细胞的形态特征在培养基中，小鼠皮层神经细胞开始以单个细胞的形式附着在培养皿上。
随着时间的推移，细胞逐渐扩张、分化，并形成网状结构。
细胞体呈现圆形或椭圆形，胞质丰富，胞核明显可见。
3.2 生长情况观察经过一段时间的培养，小鼠皮层神经细胞开始迅速生长，并在培养皿上形成较为密集的细胞层。
细胞的生长速度和密度与培养基的成分以及培养条件有关。
3.3 突触结构的发育利用免疫荧光染色技术，我们观察到培养的小鼠皮层神经细胞在突触结构上发生了显著的变化。
初始阶段，突触相关蛋白的表达较低，突触结构不完整。
随着培养的延长，突触形成和突触相关蛋白的表达逐渐增加，形成典型的突触结构。
3.4 细胞存活率检测通过荧光染料染色和显微镜观察，我们评估了小鼠皮层神经细胞的存活率。
结果显示，细胞存活率在培养的早期阶段较低，但随着培养时间的增加，细胞存活率逐渐提高，稳定在一个较高的水平。
4. 讨论本实验成功地进行了小鼠皮层神经细胞培养，观察到了神经细胞的形态特征、生长情况和突触结构的发育过程。
神经胶质细胞培养步骤
神经胶质细胞培养步骤神经胶质细胞是一种非神经元细胞，主要存在于中枢神经系统中，包括脑和脊髓。
它们的主要功能是提供支持和保护神经元，同时也参与了神经元的代谢和信号传递。
在研究神经胶质细胞的功能和特性时，我们需要进行细胞培养。
下面是神经胶质细胞培养的步骤。
第一步：准备培养基和试剂神经胶质细胞培养需要使用特定的培养基和试剂。
常用的培养基包括DMEM/F12、Neurobasal和MEM等。
此外，还需要添加一些生长因子和血清，如神经营养因子（NGF）、基本纤维母细胞生长因子（bFGF）和胶质细胞衍生神经营养因子（GDNF）等。
第二步：收集组织样本神经胶质细胞可以从小鼠或大鼠的脑组织中分离出来。
首先需要将小鼠或大鼠处死，然后将脑组织取出并放入含有PBS的离心管中。
接着，用剪刀将组织切成小块，并加入含有酶的消化液中，如胰酶和DNA酶等。
将消化液放入37℃的恒温培养箱中，进行消化。
第三步：分离细胞消化液中的细胞需要通过离心分离。
将消化液离心10分钟，然后将上清液吸出，留下细胞沉淀。
接着，用含有培养基的离心液将细胞沉淀悬浮，然后将悬浮液过滤，去除残留的组织碎片和细胞碎片。
第四步：培养细胞将分离出的神经胶质细胞放入含有培养基和血清的培养皿中，放入恒温培养箱中进行培养。
在培养过程中，需要定期更换培养基和添加生长因子，以促进细胞的生长和分化。
第五步：观察细胞在培养过程中，需要定期观察细胞的生长情况和形态变化。
可以使用显微镜观察细胞的形态和数量，也可以使用细胞染色技术观察细胞的分化和功能。
神经胶质细胞培养是研究神经胶质细胞功能和特性的重要手段。
通过以上步骤，可以成功地分离和培养出神经胶质细胞，为后续的研究提供了基础。
神经细胞实验报告
一、实验目的本研究旨在通过体外培养神经细胞，探讨CA1重组蛋白在神经细胞生存以及学习记忆过程中的生物学功能，并深入了解其调控机制，为神经科学领域的研究提供实验基础。
二、实验材料1. 细胞：大鼠胚胎海马神经元2. 试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、神经生长因子、抗凋亡因子、CA1重组蛋白、学习记忆相关基因的抗体、荧光标记抗体等3. 仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、荧光显微镜、酶标仪、离心机、凝胶成像系统等三、实验方法1. 细胞培养：将大鼠胚胎海马神经元接种于细胞培养皿中，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于细胞培养箱中培养。
2. CA1重组蛋白表达和纯化：通过基因工程方法表达CA1重组蛋白，并进行纯化。
3. 神经元培养和CA1处理：将培养至一定时期的神经元分为实验组和对照组，实验组加入一定浓度的CA1重组蛋白，对照组加入等体积的DMEM培养基。
4. CA1对神经元细胞凋亡的影响：通过流式细胞术检测CA1处理组与对照组神经元细胞凋亡率的差异。
5. CA1与学习记忆相关基因的表达关系研究：通过RT-qPCR检测CA1处理组与对照组神经元中学习记忆相关基因的表达水平。
6. 穿透式电子显微镜观察CA1对突触结构的影响：通过透射电子显微镜观察CA1处理组与对照组神经元突触结构的差异。
7. CA1对学习记忆行为的影响：通过Morris水迷宫实验检测CA1处理组与对照组小鼠的学习记忆能力。
8. 数据分析与统计：采用SPSS软件对实验数据进行统计分析，包括t检验、方差分析等。
四、实验结果1. CA1处理组神经元细胞凋亡率显著低于对照组（P<0.05），表明CA1重组蛋白具有抑制神经元细胞凋亡的作用。
2. CA1处理组神经元中学习记忆相关基因的表达水平显著高于对照组（P<0.05），表明CA1重组蛋白可能通过调控学习记忆相关基因的表达来影响神经元的学习记忆功能。
3. 透射电子显微镜观察结果显示，CA1处理组神经元突触结构较为完整，而对照组神经元突触结构出现一定程度的损伤。
原代海马神经元细胞培养
原代海马神经元细胞培养-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1原代海马神经元细胞培养溶液的配制：(1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤，室温保存。
(2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO412H2O，1.7g；KCl，0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。
用0.2m滤膜过滤，4℃保存。
(3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液冻存。
使用时，用解剖液稀释至0.25%。
(4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。
将上述多聚赖氨酸放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。
(5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP047H20，0.18g；KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。
(6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。
(7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。
(8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg ml-1的母液储存。
用0.2m 滤膜过滤，-20℃储存。
使用时，取6l母液加入2ml培养液中，终浓度为3g ml-1。
（根据实验情况调整浓度）大鼠原代海马神经元细胞的培养(1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解剖液的培养皿中。
(2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。
在分离出全部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。
神经生物学实用实验技术pdf
神经生物学实用实验技术神经生物学是研究神经系统结构和功能的科学领域，其实验技术对于揭示神经系统的奥秘至关重要。
本文将介绍几种在神经生物学研究中常用的实用实验技术，包括神经细胞培养、电生理记录、光遗传学、神经影像学和行为学实验。
一、神经细胞培养神经细胞培养是研究神经系统的基础实验技术之一。
通过将神经细胞从动物或人体中分离出来，并在特定的培养条件下进行生长和分化，可以研究神经细胞的形态、功能和相互作用。
通过神经细胞培养技术，科学家们可以观察到神经细胞在体外的生长、突触形成、递质释放等现象，从而深入了解神经细胞的生理和病理过程。
二、电生理记录电生理记录是神经生物学中用于研究神经元电活动的实验技术。
该技术通过在神经元上放置电极，记录神经元膜电位的变化，进而研究神经元的兴奋性和抑制性。
电生理记录技术包括细胞内记录和细胞外记录两种方法。
细胞内记录通过在神经元膜内插入微电极，直接记录膜电位的变化；而细胞外记录则通过在神经元周围放置电极，记录神经元群体活动的总和电位。
通过电生理记录技术，科学家们可以研究神经元在特定刺激下的反应模式，从而了解神经系统的工作机制。
三、光遗传学光遗传学是一种利用光敏蛋白调控神经元活动的实验技术。
该技术通过基因工程技术将光敏蛋白（如光敏离子通道或光敏酶）表达在特定的神经元上，然后使用特定波长的光照射这些神经元，以调控它们的膜电位和兴奋状态。
光遗传学具有时间和空间上的高精确性，能够在活体动物中实现对特定神经元活动的精确操控。
通过光遗传学技术，科学家们可以研究特定神经元在行为、学习和记忆等过程中的作用，从而揭示神经系统功能的复杂性。
四、神经影像学神经影像学是研究大脑结构和功能的重要手段，主要包括功能性磁共振成像（fMRI）、正电子发射断层扫描（PET）和脑电图（EEG）等技术。
这些技术可以无创地观察大脑在不同状态下的血流、代谢和电活动变化，进而研究神经系统的功能连接和网络特性。
神经影像学技术为揭示大脑在认知、情感和行为等方面的功能提供了有力支持。
neuro2a细胞培养注意事项
neuro2a细胞培养注意事项细胞培养是一项非常重要的实验技术，在神经科学研究领域中，使用neuro2a（N2a）细胞是常见的模型。
为了成功进行N2a细胞培养，以下是一些需要注意的事项：1.无菌操作：在进行细胞培养之前，必须保证实验室环境是无菌的。
使用无菌培养器具和材料，并在实验过程中遵守无菌操作规范，以防止细胞受到细菌、霉菌等污染。
2. 培养基准备：使用适当的培养基来支持N2a细胞的生长和增殖。
常见的N2a培养基是DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）或MEM （Minimum Essential Medium），其中加入适当的补充物，如胎牛血清（FBS）或小牛血清（CS）等。
3.细胞接种密度：在接种N2a细胞时，需要控制适当的接种密度。
一般来说，细胞数目应该适中，既不过于稀疏又不过于密集。
过于稀疏的细胞密度会导致细胞生长缓慢，而过于密集的细胞密度会导致细胞互相竞争营养，影响细胞健康。
4.培养器具选择：选择适当的培养器具来培养N2a细胞。
常见的培养器具包括培养皿、培养瓶和多孔板等。
选择合适的培养器具要考虑细胞接触面积和透气性等因素。
5.培养条件：提供适当的培养条件可以促进N2a细胞的生长和分化。
维持恒定的温度（一般为37°C）和CO2浓度（一般为5%）是必要的。
此外，定期更换培养基也是必要的，以保持细胞处于良好的生长状态。
6.营养物质供给：为了支持细胞的生长和代谢，培养基中要提供足够的营养物质，如氨基酸、维生素、葡萄糖等。
培养基中还可以添加其他成分，如神经生长因子（NGF）或文库溶菌酶等，以促进细胞分化和生长。
7.细胞分离：当N2a细胞达到一定的密度时，需要进行细胞分离或传代，以维持细胞的健康和增殖。
细胞分离可以使用胰酶等消化酶来将细胞从培养器具中剥离出来，并通过离心等方法收集细胞。
8.聚集物处理：N2a细胞有时候会形成聚集物，影响细胞的生长和扩散。
各类神经元细胞的培养方法
体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。
神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。
(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。
(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。
(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。
我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一、鸡胚背根神经节组织块培养主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。
在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。
1、材料和方法（1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。
（2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。
（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。
（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。
（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。
2、结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。
Neuro-2α细胞替代神经元原代培养进行神经轴突测量实验研究
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神经组织生物实验报告
实验名称：神经组织培养及观察实验目的：1. 学习神经组织的培养方法。
2. 观察神经细胞在体外培养的生长情况。
3. 了解神经组织的生物学特性。
实验时间：2023年X月X日实验地点：实验室实验材料：1. 神经组织细胞2. 培养基（DMEM）3. 胎牛血清4. 抗生素混合物（青霉素、链霉素）5. 细胞培养皿6. 移液器7. 显微镜8. 记录纸及笔实验方法：1. 细胞培养：- 将神经组织细胞接种于细胞培养皿中，加入适量的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
- 每2-3天更换一次新鲜培养基，加入胎牛血清和抗生素混合物。
2. 观察细胞生长：- 在显微镜下观察神经细胞在体外培养的生长情况，记录细胞形态、密度和生长状态。
- 每隔一段时间拍照记录细胞生长情况。
3. 细胞分化：- 在培养基中加入适量的神经生长因子，观察神经细胞分化情况。
实验结果：1. 细胞生长情况：- 在培养过程中，神经细胞在培养皿中均匀分布，细胞呈梭形，细胞核清晰可见。
- 随着培养时间的延长，细胞密度逐渐增加，细胞排列整齐，形态稳定。
2. 细胞分化情况：- 加入神经生长因子后，部分细胞开始分化，形态发生改变，细胞突起增多，细胞体积增大。
实验结论：1. 神经组织细胞可以在体外培养条件下生长，培养方法简便易行。
2. 神经细胞在体外培养过程中，细胞形态稳定，生长状态良好。
3. 神经生长因子可以促进神经细胞的分化，为神经组织的研究提供了新的思路。
讨论：1. 神经组织细胞培养技术在神经科学研究、神经疾病治疗等方面具有重要意义。
2. 本实验结果表明，神经组织细胞在体外培养条件下具有良好的生长和分化能力，为进一步研究神经组织生物学特性提供了基础。
3. 在实验过程中，需要注意细胞培养条件的控制，如温度、湿度、气体环境等，以确保细胞生长状态良好。
注意事项：1. 实验操作过程中，应保持无菌操作，避免污染。
2. 注意观察细胞生长情况，及时更换培养基。
神经胶质细胞培养方法
神经胶质细胞培养方法
神经细胞（神经元）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底
层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增殖。
而神经胶质细胞是神经组织
中比较容易培养的成分。
人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质
细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。
一般来说，胶质细胞在培养
中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，
可用劳氏肉瘤病毒（Rous sarcoma virus,ROUS)和SV4等能其诱发转化。
培养方法如下：
1、从手术室无菌取脑髓灰质或白质后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks液中漂洗一至二次。
2、置于30—50倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打
即制成细胞悬液。
3、把悬液注入离心管室温中直立5—10分钟后，细胞或细胞团快自然
下沉，脂肪等杂物易漂浮在上层液相中，可吸除上层液体，反复二至
三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞。
4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网成纱布过滤，计数并调整细
胞密度。
5、接入培养瓶或皿中，置5%CO2温箱中培养。
该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。
贴壁后短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖状态。
细胞传代可以 0.25%胰酶消化处理。
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培养基：1天然培养基（血清，血浆，组织浸出液，水解乳蛋白）
2 合成培养基（ＭＥＭ ＤＭＥＭ ＨＡＭ`S F12 ＲＰＭＩ（１６４０） １９９ Ｌ－１５ ）等
常用的平衡盐溶液（g/L）
Ringer (1985) PBS Eargle (1948) Hanks (1949 Dulbecco (1954) D-Hanks
神经营养因子的分泌：
酶的诱导、蛋白质的合成 神经递质的摄取 髓鞘的形成 神经的局部免疫反应
代谢过程
胶质细胞培养的局限性
1 大多来自于未成熟大脑，所以不能达到与体 内相一致的成熟程度，即使成年也可能有干 细胞的存在。其形态可能随培养条件而发生 变化。 2 存在不同的细胞亚群 3 其性质有赖于他们与特殊神经元相互作用。
培养的方法：
1）取材 生后1天的大鼠，75%酒精消毒， 断头，置于培养皿中
2）沿纵轴剪开皮肤和颅腔，取出大脑皮 质，去除嗅球等
3 去除脑膜，洗涤 （Hanks液） 4） 组织剪成碎块，37℃缓慢振荡约10 min。 5）胰蛋白酶消化 6)重复吹打，自然沉淀数次，收集细胞悬液
（或者6 ）移入试管吹打或加入胰蛋白酶形成单 细胞悬液 7） 加入完全培养基终止 8）调整细胞密度104~106/cm2接种于培养瓶，常规 CO2孵育箱培养 9）接种3天后换液，以后每两天换液 10）传代, 0.25% 胰蛋白酶消化（覆盖细胞层即可） 或着用摇晃的方法
培养用液
培养基：MEM450ml + 血清 45ml+GLU-谷氨酰胺 – 青链霉素溶液8ml 葡萄糖-谷氨酰胺 –青链霉素溶液（100ml） ：葡萄 糖 30g；谷氨酰胺 100mmol/l；青霉素 2.5 × 105U; 链霉素 2.5×10 μg 胰蛋白酶：0.25% 少突胶质细胞的限定培养液：F12 与DMEM（高糖， 4.5 g葡萄糖/L 1：1混合 后加入：BSA ：终浓度为 0.66 mg/ml ,胰岛素 :10ng /ml; 孕酮:20 nmol/l; 腐 胺:100µ mol/l; 碳酸氢钠: 3.6 g/l; 硒: 5ng/ml; T3: 30nmol/l; 转铁蛋白: 50 µg/ml.
神经细胞培养
第一节：细胞培养的基本知识
1定义： 组织培养 (Tissue culture ) ：
细胞培养 (cell culture)： 器官培养 ( organ culture)：
统称为体外培养 （In vitro)
2 组织或细胞培养的优点： 1）：研究对象是活细胞
2）：研究条件可以人为的控制
MAP-2
A
B
NSE stain neuron
TH stain neuron
Confocal laserscan images of organtypic slice culture from avian hippocampus
N
Slice culture. Lucifer yellow stain (bar 50µ m)
+
— + + + — — + + —
—
— + + — + + +
—
+ + + — + + — — —
125I-CYP NG2 L1 Ia
研究胶质细胞的方法
1） 从未成熟的脑组织分离、培养获得 大量胶质细胞 2）已经开发出能识别胶质细胞的免疫学 标志物。
利用细胞培养可研究胶质细胞 的特性
受体的表达：星型胶质细胞和少突胶质细胞可与传 统的神经递质发生反映。（І型胶质细胞可表达25种 神经配体的受体
标志物 检测对象 Ⅰ型 形态 A2B5 GFAP 多聚唾液酸神经节苷脂 胶质纤维酸性蛋白 多角型 — + 细胞类型 Ⅱ型 星型 + + 少突胶质细胞 具有少量突起 + — —
Ran-2
GC GD3
3H-GABA
大鼠神经抗原-2
半乳糖脑苷脂 GD3神经节苷脂 GABA摄取 Β-肾上腺能受体 300kDa蛋白聚糖 细胞黏附分子 Ⅱ型MHC抗原
传代时注意事项：a 细胞没有生长到足以覆盖瓶 底壁大部分 表面以前，不要急于传 代 b 注意观察不同细胞有不同的消化时 间；动作要轻使 细胞尽快适应新环境
鉴定：星形胶质细胞鉴定： 胶质原纤维酸性蛋白 （Glial fibrillary acid protein GFAP， A2B5） 少突胶质细胞 鉴定：GalC（ß -galactosidase)
3) 无污染及无毒：体外培养的细胞必须生 长于无污染及无毒的环境！！ 无毒：与细胞直接接触者—培养器皿、 底物、培养基，蒸馏水等； 间接接触者—配制培养基的器皿、 瓶盖、瓶塞等 无污染： 微生物及交叉污染，（霉菌污 染常见）
6 常用的培养用液及培养基
培养用液：水
平衡盐溶液（ＢＳＳ）（见表）作用： 消化液１胰蛋白酶液（０．２５%） ２二乙烯四乙酸二钠（ＥＤＴＡ） ３胶原酶： 甘氨酸 羟脯氨酸敏感
Na2HPO4.2H2O KH2PO4 NaHCO3 葡萄糖 酚红 0．20
1．14 0．06 3．20 1．00 0．02 0．35 1．00 0．02
2．42 0．20 0．06 0．35
0．02
0．02
细胞计数法：
原则：取0.1 ml细胞悬液 加 Hanks 液0.9ml，混 匀后滴于血细胞计数板上， 在低倍显微镜下计 数四角大方格内细胞。计数过程中对于大方格 边缘压线按照数上不数下，数左不数右的原则。
运动神经元 Dil标记
Purkinje cell in culture (PEP-19)
二、胶质细胞的培养
胶质细胞 纤维性 的分类：a大胶质细胞— 星形胶质细胞 原浆性
少突胶质细胞
b小胶质细胞 周围神经系统主要是施万细胞
根据免疫组化反应分类：
Ⅰ型星型胶质细胞和Ⅱ型星型胶质细胞：
神经细胞培养的类型 1 原代培养
原代培养（primary culture)：指从活体获得细胞、组织或器 官在体外条件下进行的第一次培养 传代培养(subculture)：当细胞持续生长到达一定密度之后，就 应当将细胞分成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充新的 培养液为传代培养。
2 细胞系培养
一 神经元的原代培养(Primary culture)
2 细胞生物学的基础研究: 细胞培养使细胞生物学迅速发展 3 细胞工程学的研究手段，利用细胞融合及杂交技术，进行细 胞工程的研究与开发。 4 干细胞的培养及应用 5 淋巴细胞培养技术的应用 6 遗传性疾病的产前检查 7 细胞作为毒性实验及生物安全性实验的工具 8 细胞培养在现代生物技术中应用很广，如基因分离，基因测 序与表达，基因转移与重组，癌基因的研究等。
4个大方格内细胞数
细胞浓度=
4
× 104 × 稀释倍数 = 细胞数/ml
细胞活性的检查 台盼蓝染色： 0.2 ml 细胞悬液加0.4 ml台盼蓝溶液混 合，滴少许于载波片上， 低倍镜计数 200细胞，算比率，正常不着色，死细 胞为兰色
细胞活力（%）=（细胞总数-着色细胞数）/总细胞数×100%
第 二节：神经细胞体外培 养的 基本概念和方案
含10%胎牛血清培养 富含Ⅱ型星型胶质 细胞
化学 限定 培养
富含少突交质细胞
富含І型星型胶质细胞
四、神经元的鉴定：
神经元特异性烯醇化酶（ Neuron specific enolose NSE）、 微管相关蛋白（Microtubule associated protein MAP2） ——神经元,
五、神经元的纯化：
1. 胞嘧啶阿拉伯糖 ，培养2d 后用含5~10 mol/L 胞 嘧啶阿拉伯糖的培养24 hour ,然后改用常规培养 液。 2. 特殊培养液：neurobasal 培养基
第0-12天 大鼠脑皮质混合细胞培养
第12天 预震荡（260rpm，1.5h）收获非贴壁细胞
37℃培养1h
震荡（260rpm，18h）
收获贴壁细胞
第13天 贴壁的扁平细胞 非贴壁的，有突起的细胞， （processing bearing PB）
富含小胶质细胞
(oligodendrocyte-2-typeastrocyte, 0-2A
NaCl KCl CaCl2 MgCl .6H2O MgSO4.7H2O Na2HPO4.H2O
9．00 0．42 0．25
8．00 0．20
6．80 0．40 0．20
8．00 0．40 0．14
8．00 0．20 1．10 0．10
8．00 0．40
0．20 1．56
0．20 0．06 0．06
一、组织来源： 1） 种属： 大鼠 小鼠 家鸡 瓜蟾 海兔 蜗牛 水蛭 等
2）年龄：一般为胚胎或新生动物组织
神经胶质细胞：生后早期 大部分神经元 ：胚胎末期 颗粒细胞： 生后两周以内 主要根据轴突和树突广泛分枝发育之前培养
二、常用试剂
1） 培养液 A DMEM ： B F12 培养液 C DMEM/F12 培养液 D 无血清培养液加神经营养因子 E Neurobasal 培养液 2） D-Hank`液（其中可加入牛血清白蛋白3g/L）（ HBSS）
3）：研究的样本可以达到比较均一性 4）：研究的内容便于观察、检测和记录 5）：研究的费用相对比较经济 6） ：可作为一些遗传物质的运载细胞 7) ：干细胞的广泛应用前景
3 组织或细胞培养的不足：1）与体内条件存在差 异 ；2）细胞培养存在一定的不稳定性
培养细胞学的研究内容
1 培养细胞学在病毒学中的应用
培养过程中注意事项
1） 培养底物的处理： 多聚赖氨酸和多聚鸟氨酸、PEI
细胞外基质成分（胶原） 细胞黏附分子