神经细胞培养
神经胶质细胞培养方法
神经胶质细胞培养方法
神经细胞（神经元）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底
层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增殖。
而神经胶质细胞是神经组织
中比较容易培养的成分。
人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质
细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。
一般来说，胶质细胞在培养
中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，
可用劳氏肉瘤病毒（Rous sarcoma virus,ROUS)和SV4等能其诱发转化。
培养方法如下：
1、从手术室无菌取脑髓灰质或白质后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks液中漂洗一至二次。
2、置于30—50倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打
即制成细胞悬液。
3、把悬液注入离心管室温中直立5—10分钟后，细胞或细胞团快自然
下沉，脂肪等杂物易漂浮在上层液相中，可吸除上层液体，反复二至
三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞。
4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网成纱布过滤，计数并调整细
胞密度。
5、接入培养瓶或皿中，置5%CO2温箱中培养。
该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。
贴壁后短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖状态。
细胞传代可以 0.25%胰酶消化处理。
神经细胞的培养
海马神经元的培养总结1.新生大鼠海马常规取法：断头，线剪剪去皮肤，组织剪从椎管纵向剪开颅骨，再颅顶横向剪一刀。
暴露两侧大脑半球，用小弯镊翻出大脑，延纵裂分别向两侧翻开大脑半球，在底部可见新月形的海马，用眼科镊取出置于冰浴的盐溶液中，在解剖镜下剥离周围组织和血管膜。
2.培养基：我用的接种培养基是DMEM/F12+10的胎牛血清＋胰岛素＋葡萄糖＋谷胺酰胺，维持培养基里就是多加了5uM的阿糖胞苷。
培养液的pH调至6.8—7.4可，最好不要调至7.4或高。
一般在培养液放置两周后，加入终浓度为2mM的谷氨酰胺3.胰酶：酶用0.125的。
其实一次性消化比较简单，关键是消化时间不要太长，不知你用多长时间，一般是15-20分。
4.多聚赖氨酸的配置：可以用去离子水配, 也可以用D-HANKS也配(我用的配方),或者PBS 效果都差不多. 一般先配成1mg/ml的母液, 用高压过的滤器过滤,最好分装以后放在-20度, 用的时候再稀释至0.01mg/ml.5.铺板：我的办法是将盖玻片直接经泡酸后要反复的洗干净，用单蒸后用双蒸水。
后放在75％的酒精中浸泡半个小时以上，在超净台中取出后用酒精灯烧一下，注意不要太久，以防破碎，后放在24或6孔板中，加入稀释好的多聚赖氨酸，室温放置3小时以上或过夜，切记不要照紫外，可以在上面覆盖东西。
结束后回收多聚赖氨酸，并用灭菌水或PBS等清洗三遍以上即可使用，我用的效果非常好。
6. 1. 盖玻片洗净之后, 需要泡酸过夜处理, 这样玻片会比较干净, 养原代背景会干净的多. 就算是新的也要洗(曾经有过教训).2.包被多聚赖氨酸用之前要用高压的去离子水洗3遍,再用D-HANKS过一遍.3. 多聚赖氨酸包被时,如果有条件可以放在4度振摇过夜,效果更佳.4. 神经元细胞种植之前1小时把种植培养基加进去,会提高细胞活力.7.纯化细胞方法：1.差速贴壁：接种前可将制备的细胞悬液放入底面积为75cm2的培养瓶中（未包被），然后放入37度，5%CO2培养箱中半小时，然后再过滤，转移至培养皿/瓶中。
neurobasal 神经细胞培养步骤
neurobasal 神经细胞培养步骤
神经细胞培养使用的神经基底培养基（Neurobasal）通常包括
以下步骤：
1. 准备培养器具：将所需的培养器皿（如细胞培养皿、培养瓶等）进行灭菌处理，确保无细菌或其他污染物。
2. 制备培养基：根据厂家提供的说明书，将神经基底培养基配制好。
通常需要将粉末溶解于培养基补充剂（如B27或N2）中，并加入适量的血清等。
3. 细胞分离：将神经组织（如海马、皮质等）分离并收集。
可以使用酶（如胰酶、纤溶酶等）或机械切割方法（如切割刀或离心式分离）。
4. 细胞孵化：将分离的细胞在预先灭菌的培养器皿中分散均匀，加入预先配制好的培养基。
5. 营养物质补充：在培养基中加入适量的营养物质，如氨基酸、维生素等，以促进细胞生长和分化。
6. 培养条件调节：将培养器皿放入恒温培养箱中，并保持适宜的温度（通常为37°C）和湿度，同时提供适量的CO2（通常
为5-10%）。
7. 细胞观察和维护：每天观察细胞的生长情况，检查细胞形态和健康状况。
适量更换培养基，以保持培养环境的稳定。
需要注意的是，具体的步骤可能会因实验设计的不同而有所差异，因此最好参考实验操作手册或厂家提供的指导。
此外，神经细胞培养也需要一定的专业知识和操作经验，对于初学者来说可能需要辅导或指导。
神经干细胞体外培养技术
神经干细胞体外培养与鉴定一前言神经干细胞(Neural stem cells, NSC S)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。
文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。
此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。
根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。
基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。
本实验拟建立绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。
二实验所需仪器、试剂及其配制（一）实验仪器光学显微镜（Olympus,Japan）倒置荧光显微镜（LEICA DMIRB）冰冻切片机（Leica CM1900，Germany）光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂）XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200 电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)MP 8001单臂脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司)10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISION SAMPLINGCORP，BATON ROUGE，LOUISIANA，Made in USA）0.5ml、1ml Eppendorff管（Ependorff）手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。
（二）试剂1. DMEM/F12，Hank's液（Hyclone），N2（Gibico），bFGF（Invitrogen）。
神经胶质细胞培养步骤
神经胶质细胞培养步骤神经胶质细胞（neuroglial cells）是存在于中枢神经系统（中枢神经系统包括大脑和脊髓）的细胞类型之一、它们的主要功能是支持和维持神经元的正常功能，同时还参与神经元之间的相互作用。
在研究神经学和神经生物学领域，神经胶质细胞的培养是非常重要的工具和实验方法之一、下面将详细介绍神经胶质细胞的培养步骤。
材料和仪器准备：1.细胞培养培养器皿（如培养瓶、培养皿、多孔板等）2.神经胶质细胞培养基（含有适当的营养物质和生长因子）3.显微镜4.无菌操作台和器具（如无菌架、无菌套、培养器具等）5.离心机6.细胞计数器步骤：1.无菌操作准备：首先，在无菌操作室准备好所有的材料和仪器，并确保它们是无菌的。
洗手，戴好手套和口罩，使用紫外灯照射操作台和仪器，以确保无菌条件。
2.器皿涂层：在培养瓶、培养皿或多孔板中涂覆组织胶质或其他与神经胶质细胞黏附相容的涂层物质（如聚-L-赖氨酸或明胶涂层）。
涂层后，将器皿在37℃的培养箱中孵育至少2小时以促进涂层物质的固化。
3.细胞分离：将小鼠或大鼠的中枢神经系统取出，通常是大脑和脊髓。
将组织放入无菌PBS（磷酸缓冲盐溶液）中，用剪刀剪碎组织，然后离心收集组织碎片。
将组织碎片转移到含有消化酶（如胰酶）的消化液中，并在37℃下消化一段时间，以分离细胞。
4.筛选和培养胶质细胞：经过消化的组织混悬液通过筛网或过滤膜进行过滤，以去除大块组织碎片。
收集过滤液，将其离心以沉淀细胞。
将沉淀的细胞重悬于神经胶质细胞培养基中，并将其转移到事先涂层的器皿中。
将培养皿放入37℃的细胞培养箱中培养。
5.细胞培养：在细胞培养箱中维持恒温和湿度，并使用细胞培养基按照指定的时间间隔更换培养基，通常为2-3天一次。
根据实验要求和研究目的，可以添加适当的生长因子和抗生素到细胞培养基中。
6.细胞观察：使用倒置显微镜观察培养的细胞，注意观察细胞的形态、增殖情况和细胞表型。
同样，能够观察到细胞的汇集和神经胶质细胞的突触形成。
神经干细胞的培养
神经干细胞的培养一、神经干细胞的分离和传代无菌条件下取新生SD大鼠(出生48h内)脑组织，D-Hanks液充分漂洗后，在解剖显微镜下剥离脑膜，准确分离海马，用眼科剪将海马剪碎后，再转移到DMEM/F12(1:1)加B27 和bFGF(20ng/ml)的无血清培养基，吸管吹打机械分离制作单细胞悬液，台盼蓝染色后细胞计数，调整细胞浓度为5×104~5个/ml，置于24孔培养板中培养，每孔加入细胞悬液500μｌ。
待神经球形成后再次机械分离克隆制作单细胞悬液，仍以5×104个/ml的细胞浓度置于24孔培养板中培养，每孔加入细胞悬液500μｌ。
此后每7d机械分离克隆传代1次，方法同前。
二、BrdU标记将BrdU溶于无血清培养基，过滤除菌后加入神经球形成后再次机械分离克隆制作的单细胞悬液中(BrdU终浓度为5μmol/L)，培养7d待新的神经球形成后，将神经球转移到预先涂布有多聚赖氨酸的培养板中，贴壁2h行BrdU免疫细胞化学染色。
三、神经干细胞的诱导分化选取部分上述传代后形成的次代神经球种植于预先涂布有多聚赖氨酸的24孔培养板中，并加入有血清培养基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)，一部分神经球于贴壁2h后行Nestin免疫细胞化学染色，另一部分神经球继续培养，观察其生长分化情况。
另将一部分次代神经球机械分离制成单细胞悬液后加入有血清培养基贴壁培养，7d后分别行Tuj1 、GFAP 、Galc 免疫细胞化学染色。
四、条件培养液的制备取1g鸡胚的后肢骨骼肌组织，加入9mlD-Hanks液中冰浴匀浆15min，离心获得上清液，过滤除菌后，加两倍体积DMEM/F12培养基制成条件培养液备用。
五、神经干细胞的定向诱导分化将一部分次代神经球机械分离制成单细胞悬液后分别加入条件培养液和有血清培养基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)中对照贴壁培养，7d后均行ChAT免疫细胞化学染色。
六、免疫细胞化学染色培养细胞用4％多聚甲醛固定30min后，PBS充分漂洗，然后按ABC法分别行鼠抗Nestin，鼠抗Tuj1，兔抗GFAP，鼠抗Galc，鼠抗Brdu免疫细胞化学染色，用DAB和H2O2作为呈色剂，阳性着色为棕黄色。
个人整理总结神经细胞和胚胎细胞培养操作注意事项及相关protocols
Drosophila S2 cell culture protocols陈文锋一、基本注意事项（一）无菌操作培养所需一切物品、液体应无菌。
操作前先列出所需物品，培养液须室温平衡，所有物品准备好后再操作，避免往复拿取用品。
有关数据的计算要事先做好。
（二）操作区消毒进入细胞室内换穿里面的拖鞋。
无菌培养室每周用0.2%的新洁而灭（苯扎溴铵）拖地面1次（拖布专用），紫外照射15-30min。
超净工作台使用前后需用75%乙醇擦洗，然后进行紫外灯照射15~30min进行消毒，操作时打开风机。
紫外照射期间不能放置培养细胞和培养液等。
所有进入操作区域的物品需经75%乙醇擦拭消毒。
工作台面均需经75%乙醇擦拭消毒，特别是液体溢出时，需立即擦拭。
移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%乙醇擦洗后置于台内同时紫外照射消毒。
废液缸、污物盒每次做完实验马上清理倒掉。
（三）洗手和着装乳胶手套75%乙醇喷洒消毒。
白大褂定期高温高压灭菌。
（四）火焰消毒培养或其他无菌操作时，首先点燃酒精灯。
安装管帽、打开或封闭瓶口等，都需要在火焰近处。
二、细胞培养条件S2细胞培养在Schneider's Drosophila Medium + 10% FBS的培养基中+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素，25℃无需要CO2培养。
五、FBS分装及灭活分装：初次买500ml血清，4℃完全融化（过夜差不多20h，时间比较长），期间间隔混匀。
无菌操作分装于50ml离心管（直接倒，但是注意不要让血清瓶和离心管接触）。
同时分装几管15ml的（15ml不好倒就用枪或移液管操作）。
（-80℃保存）再次分装：等15ml的分装血清用完。
把50ml的血清取出，4℃完全融化，期间间隔混匀。
无菌操作分装于15ml离心管。
灭活：把装有灭菌水的烧杯置于56℃水浴锅中，等水浴锅温度恒定，把装有血清的15ml离心管放于烧杯中，水位应超过血清的位置。
灭活30 min，每隔10min混匀一次。
神经干细胞原代取材与培养
神经原代干细胞的取材及培养长期以来，人们认为中枢神经系统成熟的神经元很难或不能在进行分裂和增殖，属于终末分化细胞。
因而中枢神经系统的损伤、变性导致的神经元丢失及缺损难以修复，神经功能的重建被视为几乎不可能。
神经干细胞在体外分离培养和增殖的成功，为中枢神经系统再生和功能重建提供了新的可能途径。
一、神经干细胞神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群，具有自我更新能力和多向分化潜能，对损伤和疾病具有反应能力。
原代培养的单细胞在24h内自动聚集成团，这是神经干细胞在体外培养过程中的一个重要特征。
神经干细胞具有的特点有：①有增殖能力。
②有自我维持和自我更新能力，对称分裂后形成的两个子细胞为干细胞，不对称分裂后形成的两个子细胞中的一个为干细胞，另一个为祖细胞，祖细胞在特定条件下可分化为多种神经细胞。
③具有多向分化潜能，在不同因子下，可以分化成不同类型的神经细胞，损伤或疾病可以刺激神经干细胞分化。
总之，自我更新能力和多向分化潜能是神经干细胞的两个基本特征。
二、实验步骤：神经干细胞原代取材及培养1.原代取材（1）脱颈处死2周龄孕鼠，孕鼠腹部以75%酒精消毒后，手术剪打开腹腔，取出子宫，剪开子宫，取出胎鼠，置于含冰冷PBS液的10cm培养皿中。
（2）将胎鼠断头，用眼科剪分离颅骨及硬脑膜，取出脑组织，在显微镜下充分取出脑膜和血管组织。
（3）将脑组织用PBS清洗三次，剪成1mm3大小的组织块，至于含DMEM/F12的离心管中，吸管轻吹打10次，静置离心管1~2min，取细胞悬液。
重复2-3次。
（4）细胞悬液以700r/min离心6min,吸除上清，获得细胞沉淀。
用(DMEM/F12+1%N2+2%B27+bFGF20mg/ml+EFG20mg/ml)重悬后，过200目筛网，并计数。
（5）按5×105/ml密度接种，置于37℃，5%CO2培养。
各类神经元细胞的培养方法
各类神经元细胞的培养方法神经元细胞是神经系统中的主要细胞类型之一，负责传递神经信息和调控神经功能。
神经元细胞的培养是神经科学研究和临床治疗的重要工具。
通过细胞培养，可以研究神经元的发育、功能和病理机制，同时也可以应用于药物筛选、组织工程和神经修复等领域。
下面将介绍一些常用的神经元细胞培养方法。
1.原代培养2.细胞系培养细胞系是已经建立起来的可持续增殖和培养的细胞株。
细胞系培养可以使用血清或无血清培养基。
通常，将细胞系继代传代，以保持其细胞特性和增殖能力。
细胞系培养可以持续扩大细胞数量，并用于大规模试验和应用，如药物筛选和基因表达研究等。
3.单细胞培养单细胞培养是将单个神经元细胞分离和培养。
首先，通过机械或酶消化方法将神经组织分散为单细胞悬浮液。
然后，通过单细胞分选技术，将单个神经元细胞分离并分配到各个培养孔中。
最后，单个细胞通过培养基提供的营养物和因子进行生长和分化。
单细胞培养是研究神经元个体特性、细胞发育和功能的重要手段。
4.同代培养同代培养是将同一类型的神经元细胞培养在同一培养物中，以形成功能连通的细胞群。
同代培养可以通过多孔膜培养皿、微流控芯片和三维支架等技术实现。
通过细胞之间的相互作用和联结，同代培养可以模拟神经系统的复杂性和功能，用于研究神经网络特性和神经系统发育。
5.共培养共培养是将不同类型的细胞培养在同一文化器皿中，以研究细胞之间的相互作用和信号传递。
常见的共培养方法包括胶质细胞和神经元细胞的共培养，以及神经元细胞和非神经元细胞的共培养。
共培养可以提供更接近体内情况的环境，用于研究细胞间相互作用和细胞发育过程。
可培养神经细胞类型
可培养神经细胞类型
可以培养多种类型的神经细胞，包括但不限于以下几种常见的神经细胞类型：
1. 皮质神经元（Cortical Neurons）：这是大脑皮层中最常见的神经元类型，负责信息传递和处理。
培养皮质神经元可以研究其电生理特性、突触形成和功能等。
2. 海马神经元（Hippocampal Neurons）：海马区是与记忆和学习相关的重要脑区，培养海马神经元可以用于研究突触可塑性、长时程增强（LTP）等。
3. 神经胶质细胞（Glial Cells）：神经胶质细胞是神经系统中的非神经元细胞，包括星形胶质细胞、少突细胞和室管膜细胞等，它们在支持神经元功能和保护神经组织方面起着重要作用。
4. 嗅球神经元（Olfactory Bulb Neurons）：嗅球是嗅觉传导的主要组织，培养嗅球神经元可以研究嗅觉感知和嗅觉记忆等相关机制。
5. 神经干细胞（Neural Stem Cells）：神经干细胞具有自我更新和分化为多种神经细胞类型的能力，可以用于研究神经发育、再生和治疗等方面。
这些神经细胞类型的培养需要特定的培养基和条件，例如适当的营养物质、温度和湿度等。
对于不同的研究目的，选择合适的神经细胞类型进行培养非常重要。
神经细胞(neuron cell)分散培养
神经细胞（neuron cell）分散培养一、设备无菌操作设备。
二、大型设备CO2培养箱恒温5%、10%CO2维持培养液中pH值倒置显微镜：用于每天观察贴壁细胞生长情况解剖显微镜，用于准确地取材常温冰箱：-4℃，用于保存各种培养液，解剖液和鼠尾胶低温冰箱：-20℃--80℃，用于储存血清酶，贵重物品和试剂电热干烤箱：用于消毒玻璃器皿高压消毒锅：用于消毒培养皿，手术器械过滤器：配制解剖液、培养液，必须过滤后才可使用，以去除细菌渗透压仪，pH剂，天平等三、培养器皿及手术器械1、培养皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直径。
2、培养板，24-40孔，可用于开放培养。
3、培养瓶：4、吸管，常用1，5，10ml，均需泡酸、洗涤、灭菌后方可使用。
5、各类培养液贮存器。
6、小型手术器械。
准备：一、配制培养液（1）解剖液：以无机盐（去除Ca2+ , Mg2+）加葡萄糖配制成PBS缓冲液，保持一定的渗透压和pH值。
（2）基础培养基（MEM）：主要为多种氨基酸，加入葡萄糖，双蒸馏水溶解。
（3）接种培养液：用于胰酶消化后的细胞分散，做成细胞悬液，其成分为MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%马血清，当天配制。
（4）维持培养液：接种后24h，全部换成此液，后每2周换一次，每次换1/2。
其成分为MEM中含5%马血清，1%谷氨酰胺，及适量的支持性营养物质。
二、培养基质常用鼠尾胶、小牛皮胶，多聚赖氨酸，再涂胶三、消毒培养皿的备用。
所有培养器皿均需清水冲洗2-3d，达两次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包装，置于烤箱中干燥消毒，于培养前1天进行。
神经细胞分散培养（一）选材常用胚胎动物或新生鼠神经组织。
鸡胚常用胚龄6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。
不过也有认为与组织相关。
如大白鼠胚胎以19d为宜，小鼠以18d为宜，大鼠纹状体以10d为宜；若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚，则黑质以13d，纹状体18-21d为宜；小脑以20-21d小鼠胚胎，所获蒲氏细胞成活率高，颗粒细胞正在分化；脊髓与DRG联合培养，常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神经成活率高。
神经细胞培养实验报告
神经细胞培养实验报告摘要：神经细胞培养实验是一种常用的实验技术，可以用于研究神经细胞的生理功能和疾病机制。
本实验通过对小鼠皮层神经细胞进行培养，观察细胞的形态特征、生长情况和突触结构的发育，以探究神经细胞的发育过程和突触的形成。
实验结果表明，在适当的培养条件下，小鼠皮层神经细胞可以有效地培养并形成功能性突触。
1. 引言神经细胞是大脑和神经系统的基本组成单位，对于理解神经活动和疾病机制具有重要意义。
神经细胞培养实验通过将神经细胞置于适当的培养基中，提供所需的细胞外环境，并模拟神经系统的发育过程，使神经细胞得以存活和发育。
本实验旨在通过对小鼠皮层神经细胞的培养，观察其生长情况、突触结构的发育以及可能出现的变化。
2. 材料与方法2.1 神经细胞培养基的制备2.2 小鼠皮层神经细胞的分离和培养2.3 细胞形态观察2.4 突触结构分析2.5 细胞存活率检测3. 结果3.1 神经细胞的形态特征在培养基中，小鼠皮层神经细胞开始以单个细胞的形式附着在培养皿上。
随着时间的推移，细胞逐渐扩张、分化，并形成网状结构。
细胞体呈现圆形或椭圆形，胞质丰富，胞核明显可见。
3.2 生长情况观察经过一段时间的培养，小鼠皮层神经细胞开始迅速生长，并在培养皿上形成较为密集的细胞层。
细胞的生长速度和密度与培养基的成分以及培养条件有关。
3.3 突触结构的发育利用免疫荧光染色技术，我们观察到培养的小鼠皮层神经细胞在突触结构上发生了显著的变化。
初始阶段，突触相关蛋白的表达较低，突触结构不完整。
随着培养的延长，突触形成和突触相关蛋白的表达逐渐增加，形成典型的突触结构。
3.4 细胞存活率检测通过荧光染料染色和显微镜观察，我们评估了小鼠皮层神经细胞的存活率。
结果显示，细胞存活率在培养的早期阶段较低，但随着培养时间的增加，细胞存活率逐渐提高，稳定在一个较高的水平。
4. 讨论本实验成功地进行了小鼠皮层神经细胞培养，观察到了神经细胞的形态特征、生长情况和突触结构的发育过程。
神经干细胞培养方法
神经干细胞培养方法
嘿，朋友们！今天咱就来讲讲神经干细胞培养这档子事儿。
你想想啊，神经干细胞就像是一群小小的神奇种子，有着长成参天大树的潜力呢！培养它们呀，就像是在照顾一群宝贝。
首先呢，得给它们准备一个舒舒服服的“家”，这就好比咱自己住得舒服才能心情好不是？这个“家”就是培养皿啦，要干净、无菌，给它们提供一个安全的环境。
然后呢，就是给它们准备“食物”啦。
这“食物”可讲究了，得有各种营养成分，让这些小宝贝们能茁壮成长。
这就像我们人得吃各种好吃的才有劲一样。
还有啊，温度也很重要哦！不能太冷也不能太热，要刚刚好，不然它们可不乐意待着啦。
在培养的过程中，咱可得时刻关注着它们。
就像照顾小孩子一样，看看它们长得好不好呀，有没有啥问题呀。
要是发现有不对劲的地方，那可得赶紧想办法解决。
你说这神经干细胞培养难不难？其实也不难，只要咱用心，就像对待自己最宝贝的东西一样，肯定能把它们照顾好。
想想看，要是咱能把这些小宝贝培养得好好的，那以后能为医学做出多大的贡献呀！说不定就能帮助那些有神经系统疾病的人重新恢复健康呢，这多了不起呀！
所以呀，大家别害怕，大胆去尝试培养这些神奇的神经干细胞吧！只要咱细心、耐心，肯定能收获满满的惊喜呢！这可不是开玩笑的哟，等你真正去做了，就知道其中的乐趣和意义啦！。
神经胶质细胞培养步骤
神经胶质细胞培养步骤神经胶质细胞是一种非神经元细胞，主要存在于中枢神经系统中，包括脑和脊髓。
它们的主要功能是提供支持和保护神经元，同时也参与了神经元的代谢和信号传递。
在研究神经胶质细胞的功能和特性时，我们需要进行细胞培养。
下面是神经胶质细胞培养的步骤。
第一步：准备培养基和试剂神经胶质细胞培养需要使用特定的培养基和试剂。
常用的培养基包括DMEM/F12、Neurobasal和MEM等。
此外，还需要添加一些生长因子和血清，如神经营养因子（NGF）、基本纤维母细胞生长因子（bFGF）和胶质细胞衍生神经营养因子（GDNF）等。
第二步：收集组织样本神经胶质细胞可以从小鼠或大鼠的脑组织中分离出来。
首先需要将小鼠或大鼠处死，然后将脑组织取出并放入含有PBS的离心管中。
接着，用剪刀将组织切成小块，并加入含有酶的消化液中，如胰酶和DNA酶等。
将消化液放入37℃的恒温培养箱中，进行消化。
第三步：分离细胞消化液中的细胞需要通过离心分离。
将消化液离心10分钟，然后将上清液吸出，留下细胞沉淀。
接着，用含有培养基的离心液将细胞沉淀悬浮，然后将悬浮液过滤，去除残留的组织碎片和细胞碎片。
第四步：培养细胞将分离出的神经胶质细胞放入含有培养基和血清的培养皿中，放入恒温培养箱中进行培养。
在培养过程中，需要定期更换培养基和添加生长因子，以促进细胞的生长和分化。
第五步：观察细胞在培养过程中，需要定期观察细胞的生长情况和形态变化。
可以使用显微镜观察细胞的形态和数量，也可以使用细胞染色技术观察细胞的分化和功能。
神经胶质细胞培养是研究神经胶质细胞功能和特性的重要手段。
通过以上步骤，可以成功地分离和培养出神经胶质细胞，为后续的研究提供了基础。
神经干细胞的培养
神经干细胞的培养一、神经干细胞的分离和传代无菌条件下取新生SD大鼠(出生48h内)脑组织，D-Hanks液充分漂洗后，在解剖显微镜下剥离脑膜，准确分离海马，用眼科剪将海马剪碎后，再转移到DMEM/F12(1:1)加B27 和bFGF(20ng/ml)的无血清培养基，吸管吹打机械分离制作单细胞悬液，台盼蓝染色后细胞计数，调整细胞浓度为5×104~5个/ml，置于24孔培养板中培养，每孔加入细胞悬液500μl。
待神经球形成后再次机械分离克隆制作单细胞悬液，仍以5×104个/ml的细胞浓度置于24孔培养板中培养，每孔加入细胞悬液500μl。
此后每7d机械分离克隆传代1次，方法同前。
二、BrdU标记将BrdU溶于无血清培养基，过滤除菌后加入神经球形成后再次机械分离克隆制作的单细胞悬液中(BrdU终浓度为5μmol/L)，培养7d待新的神经球形成后，将神经球转移到预先涂布有多聚赖氨酸的培养板中，贴壁2h行BrdU免疫细胞化学染色。
三、神经干细胞的诱导分化选取部分上述传代后形成的次代神经球种植于预先涂布有多聚赖氨酸的24孔培养板中，并加入有血清培养基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)，一部分神经球于贴壁2h后行Nestin免疫细胞化学染色，另一部分神经球继续培养，观察其生长分化情况。
另将一部分次代神经球机械分离制成单细胞悬液后加入有血清培养基贴壁培养，7d后分别行Tuj1 、GFAP 、Galc 免疫细胞化学染色。
四、条件培养液的制备取1g鸡胚的后肢骨骼肌组织，加入9mlD-Hanks液中冰浴匀浆15min，离心获得上清液，过滤除菌后，加两倍体积DMEM/F12培养基制成条件培养液备用。
五、神经干细胞的定向诱导分化将一部分次代神经球机械分离制成单细胞悬液后分别加入条件培养液和有血清培养基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)中对照贴壁培养，7d后均行ChA T免疫细胞化学染色。
六、免疫细胞化学染色培养细胞用4％多聚甲醛固定30min后，PBS充分漂洗，然后按ABC法分别行鼠抗Nestin，鼠抗Tuj1，兔抗GFAP，鼠抗Galc，鼠抗Brdu免疫细胞化学染色，用DAB和H2O2作为呈色剂，阳性着色为棕黄色。
医学课件神经细胞体外培养方法及应用
加入培养液调整悬液中的细胞浓度，神经节细胞为 1×107
种入涂有poly-D-lysine的盖片上，每片50μl
放入CO2孵箱中过夜
次日加3ml培养液
2天后（培养的第三天）换入有DNA合成阴断剂的培养液
神经元的分离培养过程
大鼠大脑皮层神经组织细胞培养
组织来源
新生大鼠1-2日龄，碘 酒 ，洒精消毒。 断头，取出大脑，分离脑 膜 ，夹取两侧大脑皮质放
染色，免疫组化染色。 6. 显微测量：胞体平均直径和胞体椭圆率，突起
长度及胞径。
7. 荧光光度分析仪：MTT法测定细胞的OD值
培养神经细胞的观察和鉴定
1. 神经细胞培养存活的标志：种植24小时后贴 壁，渐长出几十微米的突起，神经细胞大多 都能存活。
2. 特殊培养阶段：培养的9到12天之间，有较多 神经元死亡，以后存活下的细胞突起长而多， 互相形成网络，电镜下可见突触。
大鼠海马神经细胞培养方法
神经元体外生长特征
接种密度与体外存活率 当96孔 每孔2000-3000个 或 7000-10000个
/cm2几乎无神经元存活 当8000-12000个/96孔 或 2.8万-4万个/cm2 存
活率最大。
3天后不到接种的一半，故研究某一生长因子 前3天加药最好
神经元的体外存活时间
3. 形态学观察：神经细胞胞体大，饱满，核大， 有立体感，折光性强，周围有一圈光晕，轴 突细长均匀，直径恒定。
研究范围
细胞凋亡 细胞生长状态 存活率 膜流动性 基因产物表达 细胞内酶活性 细胞内离子含量变化 细胞表面受体，等等
组培养法
悬滴培养方法
单盖玻方法
双盖玻方法 1925
改良双盖玻方法
各类神经元细胞的培养方法
体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。
神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。
(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。
(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。
(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。
我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一、鸡胚背根神经节组织块培养主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。
在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。
1、材料和方法（1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。
（2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。
（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。
（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。
（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。
2、结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。
神经细胞培养液的制备原理
神经细胞培养液的制备原理
神经细胞培养液的制备原理主要是模拟神经细胞在体外的生长环境，提供所需的营养物质和维持适宜的生理条件，以促进细胞的生长和功能维持。
以下是神经细胞培养液制备的一般原理：
1.基础培养基选择：选择一种适合神经细胞生长的基础培养基，常用的包括神经营养成分使用的最广泛的DMEM培养基、封闭细胞纤维生长的最廉价的F-12培养基、新生小鼠的脑液中的成分较丰富的F-12培养基，以及其他特定的培养基。
2.添加补充物质：在基础培养基中添加一些必需的营养物质，如氨基酸、糖、维生素、胎牛血清或人工合成的血清替代物（如胶原蛋白、胶体果胶等）等。
这些补充物质可以提供细胞生长所需的能量和营养，促进细胞的增殖和功能维持。
3.添加生长因子：根据细胞类型和研究需求，可以添加一些特定的生长因子，如神经营养因子（如NGF，BDNF等）、白细胞介素等。
这些生长因子可以刺激神经细胞的增殖和分化，并促进其功能发挥。
4.调节pH值和氧气浓度：维持培养液的pH值在适宜范围内，通常在7.2-7.4之间；同时，通过合适的气体稳定细胞培养箱内的氧气浓度，一般保持在5-10%左右，以为细胞提供适宜的生长环境。
综上所述，神经细胞培养液的制备原理是通过提供适宜的营养物质、添加特定的生长因子，并调节pH值和氧气浓度等条件，模拟神经细胞在体内的生长环境，为细胞的生长和功能发挥提供必要的支持。
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传代时注意事项：a 细胞没有生长到足以覆盖瓶 底壁大部分 表面以前，不要急于传 代 b 注意观察不同细胞有不同的消化时 间；动作要轻柔，避免损伤细胞 c 首次传代时细胞数量要多一些，使 细胞尽快适应新环境
鉴定：星形胶质细胞鉴定： 胶质原纤维酸性蛋白 （Glial fibrillary acid protein GFAP）
少突胶质细胞 鉴定：GalC（ß -galactosidase)
GFAP
human Schwann cells
3 神经干细胞（NSE）的培养： NSC：是可以自我更新又可分化为中枢神经系统内 所有细胞类型的具有多向分化潜能的一类细胞。 20世纪神经生物学领域的最重要进展之一就是 在脑组织等神经系统内发现了NSC，向过去几百年 来认为中枢神经系统损伤后不能再生的传统理论发 出了挑战，也使神经科学工作者从一个崭新的角度 去认识脑、认识疾病、认识人类自身；同时也为神 经变性疾病、脑缺血、脑外伤和脑肿瘤等神经系统 疾病寻求了一条新的途径 神经干细胞的来源： 胚胎干细胞；骨髓基质细胞; 成年的SVZ 和海马齿状回的颗粒细胞层
4 培养细胞的特性 1）培养细胞生长方式： a 贴附生长型细胞 （大多数） b 悬浮生长型细胞（少数） 2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性
５ 细胞的生长过程：
原代培养：取自动物并置于体外培养中生长的细胞在传代 之前称为原代细胞或原代培养． 传代培养：当细胞持续生长到达一定密度之后，将细胞分 成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充新的培养液为 传代． 细胞系的生长过程： 有限细胞系： 原代培养 传代期 衰退期
ciliary neurotrophic factor/leukemia inhibitory factor/gp130 receptor
complex operates in the maintenance of mammalian forebrain neural stem cells. J Neurosci, 2001; 21(19): 7642-53.
传代培养：细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的 培养瓶的过程称之为传代。
培养的方法： 1）取材 脑灰质或白质 2）洗涤 （Hanks液） 3） 移入试管吹打形成单细胞悬液
4） 静置10min 弃上层
5）过滤后收集细胞悬液，调整细胞密度 104~106/cm2接种于培养瓶，常规CO2孵育箱 培养 6）传代, 0.25% 胰蛋白酶消化（覆盖细胞 层即可）
聚L -赖氨酸：处理培养皿（瓶）（10mg/L）5-10 min
3）细胞准备(大鼠神经细胞培养）：
• 新生1～3d SD大鼠，75%酒精浸泡约5min，移入超 净工作台，无菌条件下开颅，快速取脑，置于DHanks液中，仔细剥除脑膜和血管，小心剥离脑组织， 放入10ml小瓶中 •剪碎，加入0.25%胰蛋白酶放入37℃培养箱，定期振 摇促消化。消化约20min， •用含血清的DMEM培养液终止消化，吸管反复轻柔 吹打，用200目不锈钢筛网过滤，将滤液分散组成制 成细胞悬液，1000rpm/min离心、洗细胞两次，每次 10min， •吸收少许细胞悬液，用血球记数板快速计数细胞数，
2.1 主要试剂及溶液的配制 2.1.1 无血清培养基 DMEM/F12培养基 1袋 NaHCO3 3.7g 溶于1升经高压灭菌消毒后的去离子水中， 0.22um滤膜 过滤,分装，4℃保存。使用前，加入EGF(20ng/ml)和/或 bFGF(20ng/ml) 和/或LIF、N2和鸡胚浸出液（5%）。加 50%血清和10%DMSO。 细胞消化液： 配成0.5%的胰蛋白酶(用高压的PBS)并以0.22um滤膜过 滤, 同时配成0.04%EDTA（用D-Hanks液）高压灭菌消毒 , 将两种液体以等体积混合使其终浓度为0.25%胰蛋白酶 +0.02%EDTA，分装，-20℃贮存。
无限细胞系： 滞留期 指数增长期 平台期
２０ 原 代 培 养
１８
指 数 细 胞 数 量
细胞系阶段
１６
无限细胞系
１４
１２
１０
有限细胞系
８
６
０ ２
４
６
８
１０
１２
２４
３４
４４
培养时间（周）
６ 培养细胞生长的条件 1）细胞的营养需要： a 基本营养物质 ：氨基酸 、维生素、碳水化合物及一些无机离子；b 促生 长因子等物质 2）细胞的生存环境： a 温度：哺乳动物和人类 为35~37℃；鸟类为38.5℃ b 气相及PH 值 ：O2及 CO2的值： CO2=5%；空气=95%；PH=7.2~7.4 c 渗透压：260~320m mol/L
神经元的观察：刚分离出的神经元呈圆形，
用倒置显微镜观察有明显的光晕。 •接种一般在6小时可贴壁；8小时已有纤细有 突起长出 •24小时后可见细胞体积开始增大，呈圆形或 椭圆形。生长良好的细胞可见胞体周围有明 显的光晕，立体感强，突起以单、双突起为 主 •培养至第4天，神经元胞体明显增大，形态 多样，有些具有分枝的突起， •培养7天后，神经元形态基本成熟，具有光 滑的胞体，发育良好的突起。
神经干细胞（Neural Stem Cells, NSCs）的培养特点 呈神经球形式生长 发展史: Reynolds和 Weiss[1]在体外用表皮生长因子（ Epidermal Growth Factor, EGF）从脑组织中培养出神经 球并发现其能分化成神经元、星型胶质细胞和少突胶 质细胞；将初次形成的神经球消化传代可形成二级神 经球，它们同样具有多向分化潜能；说明EGF在体外可 将NSCs维持在未分化状态并可促进其增加细胞数量。 Johe [2]和Gritti[4]则用碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor, bFGF）也同样从脑组织中获 取到呈神经球形式生长的NSCs，也可以促进这种具有 多向分化潜能的神经球在体外存活和增殖. Shimazaki的 实验证明白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor, LIF）可将来自哺乳动物前脑的NSCs在体外培养条件下 维持在未分化状态增殖[3] 。
• 用含20%血清的DMEM培养基，稀释细胞制成 1×106/ml细胞悬液，接种于经聚Ｌ赖氨酸处理过的 24孔培养板（板孔放置0.8х0.8cm的小盖玻片）或培 养瓶内，放入5%CO2培养箱，37℃培养。 ４）神经元的纯化：培养两至四天后用含5~10 mol/L 胞嘧啶阿拉伯糖的培养基培养24 hour ,然后改 用常规培养液。 ５）神经元的鉴定：神经元特异性烯醇化酶 （ Neuron specific enolose NSE）、 微管相关蛋白 （Microtubule associated protein MAP2） ——神经元,
8．00 0．20
8．00 0．40
第 二节：神经细胞的培养技术
神经元的原代培养 神经胶质细胞的培养 神经干细胞的培养
一 神经元的原代培养(Primary culture) 常用试剂 1）DMEM 培养液：加10%热灭活胎牛血清，30m mol/L 葡萄糖，293.2mg/L L-谷氨酰氨，24.5m mol/L KCl， 100mU /L 胰岛素，青、链酶素各10万µ ／Ｌ，HEPES 2.8383g／Ｌ—PH 值7.2，过滤除菌，-20 ℃保存。 2） D-Hank`液（其中可加入牛血清白蛋白3g/L）（ HBSS）
Reynold BA, Weiss S . Generation of neurons and astrocytes from
isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science , 1992 ,255:1707-1710. 2 Johe KK, Hazel TG, MaKay RDG, et al . Single factors direct the differentiation of stem-like cells from foetal and adult nervous system. Genes Dev, 1996; 10: 3129-3140. 1 3Shimazaki T, shingo T, weiss S. The
3) 无污染及无毒：体外培养的细胞必须生 长于无污染及无毒的环境！！ 无毒：与细胞直接接触者—培养器皿、 底物、培养基等；间接接触者—配制培养 基的器皿、瓶盖、瓶塞等 无污染： 微生物及交叉污染
常用的培养用液及培养基
培养用液：水
平衡盐溶液（ＢＳＳ） 消化液１胰蛋白酶液（０．２５%） ２ 二乙烯四乙酸二钠（ＥＤＴＡ） ３胶原酶
神经细胞培养
第一节：细胞培养的基本知识
1定义： 细胞培养 (cell culture)： 组织培养 (Tissue culture) ：
器官培养 ( organ culture)：
统称为体外培养 （In vitro)
2 组织或细胞培养的优点： 1）：研究对象是活细胞
2）：研究条件可以人为的控制
3）：研究的样本可以达到比较均一性 4）：研究的内容便于观察、检测和记录 5）：研究的范围比较广泛 6）：研究的费用相对比较经济 3 组织或细胞培养的不足：1）与体内条件存在差 异 ；2）细胞培养存在一定的不稳定性
MAP-2
A
B
NSE stain neuron
TH stain neuronConfocal laserscan images of organtypic slice culture from avian hippocampus
N
Slice culture. Lucifer yellow stain (bar 50µ m)
取材：取3月龄Waster大鼠一只解剖显微镜下用显微手术 镊剥除脑膜及血管，分别取出海马和室管膜下区组织，置 于盛有冰冷D-Hank’s液的平皿中。 • 用双面刀片将组织切成1mm3的块状 • 组织移入已预温至37℃含有0.25%胰蛋白酶 (Trypsin) 和0.02%EDTA的10ml离心管中消化，离心5-10分钟，弃上 清，用含高糖的DMEM/F12(1:1)重悬细胞, 用300目滤网过 滤.按10%的比例加入血清，培养12-16小时或过夜。 • 更换成完全培养基（添加5%CEE、bFGF（终浓度为 20ng/ml）、EGF（终浓度为20ng/ml）、胰岛素（25g/ml ）、葡萄糖（0.6%）、HEPES（5mM）、Glutamine（ 2mM）和N2的DMEM/F12），接种后7-9天传代一次。