神经细胞培养

MAP-2
A
B
NSE stain neuron
TH stain neuron
Confocal laserscan images of organtypic slice culture from avian hippocampus
N
Slice culture. Lucifer yellow stain (bar 50µ m)
传代培养：细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的 培养瓶的过程称之为传代。
培养的方法： 1）取材 脑灰质或白质 2）洗涤 （Hanks液） 3） 移入试管吹打形成单细胞悬液
4） 静置10min 弃上层
5）过滤后收集细胞悬液，调整细胞密度 104~106/cm2接种于培养瓶，常规CO2孵育箱 培养 6）传代, 0.25% 胰蛋白酶消化（覆盖细胞 层即可）
• 用含20%血清的DMEM培养基，稀释细胞制成 1×106/ml细胞悬液，接种于经聚Ｌ赖氨酸处理过的 24孔培养板（板孔放置0.8х0.8cm的小盖玻片）或培 养瓶内，放入5%CO2培养箱，37℃培养。 ４）神经元的纯化：培养两至四天后用含5~10 mol/L 胞嘧啶阿拉伯糖的培养基培养24 hour ,然后改 用常规培养液。 ５）神经元的鉴定：神经元特异性烯醇化酶 （ Neuron specific enolose NSE）、 微管相关蛋白 （Microtubule associated protein MAP2） ——神经元,
2.1 主要试剂及溶液的配制 2.1.1 无血清培养基 DMEM/F12培养基 1袋 NaHCO3 3.7g 溶于1升经高压灭菌消毒后的去离子水中， 0.22um滤膜 过滤,分装，4℃保存。使用前，加入EGF(20ng/ml)和/或 bFGF(20ng/ml) 和/或LIF、N2和鸡胚浸出液（5%）。加 50%血清和10%DMSO。 细胞消化液： 配成0.5%的胰蛋白酶(用高压的PBS)并以0.22um滤膜过 滤, 同时配成0.04%EDTA（用D-Hanks液）高压灭菌消毒 , 将两种液体以等体积混合使其终浓度为0.25%胰蛋白酶 +0.02%EDTA，分装，-20℃贮存。
传代：将培养获得的神经球吸出，置于离心 管中，用吸管轻轻吹打约20次左右，使细胞 球成单细胞或小的细胞球。置于含LIF（终 浓度2-4ng/ml）的完全培养基中继续培养。
图 1：原代培养呈神经球形式生长的 NSCs（10×10）
图 2：部分细胞从贴壁生长的神经球向 周围迁移 （10×10）
1
神经细胞培养
第一节：细胞培养的基本知识
1定义： 细胞培养 (cell culture)： 组织培养 (Tissue culture) ：
器官培养 ( organ culture)：
统称为体外培养 （In vitro)
2 组织或细胞培养的优点： 1）：研究对象是活细胞
2）：研究条件可以人为的控制
3）：研究的样本可以达到比较均一性 4）：研究的内容便于观察、检测和记录 5）：研究的范围比较广泛 6）：研究的费用相对比较经济 3 组织或细胞培养的不足：1）与体内条件存在差 异 ；2）细胞培养存在一定的不稳定性
神经干细胞（Neural Stem Cells, NSCs）的培养特点 呈神经球形式生长 发展史: Reynolds和 Weiss[1]在体外用表皮生长因子（ Epidermal Growth Factor, EGF）从脑组织中培养出神经 球并发现其能分化成神经元、星型胶质细胞和少突胶 质细胞；将初次形成的神经球消化传代可形成二级神 经球，它们同样具有多向分化潜能；说明EGF在体外可 将NSCs维持在未分化状态并可促进其增加细胞数量。 Johe [2]和Gritti[4]则用碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor, bFGF）也同样从脑组织中获 取到呈神经球形式生长的NSCs，也可以促进这种具有 多向分化潜能的神经球在体外存活和增殖. Shimazaki的 实验证明白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor, LIF）可将来自哺乳动物前脑的NSCs在体外培养条件下 维持在未分化状态增殖[3] 。
少突胶质细胞 鉴定：GalC（ß -galactosidase)
GFAP
human Schwann cells
3 神经干细胞（NSE）的培养： NSC：是可以自我更新又可分化为中枢神经系统内 所有细胞类型的具有多向分化潜能的一类细胞。 20世纪神经生物学领域的最重要进展之一就是 在脑组织等神经系统内发现了NSC，向过去几百年 来认为中枢神经系统损伤后不能再生的传统理论发 出了挑战，也使神经科学工作者从一个崭新的角度 去认识脑、认识疾病、认识人类自身；同时也为神 经变性疾病、脑缺血、脑外伤和脑肿瘤等神经系统 疾病寻求了一条新的途径 神经干细胞的来源： 胚胎干细胞；骨髓基质细胞; 成年的SVZ 和海马齿状回的颗粒细胞层
聚L -赖氨酸：处理培养皿（瓶）（10mg/L）5-10 min
3）细胞准备(大鼠神经细胞培养）：
• 新生1～3d SD大鼠，75%酒精浸泡约5min，移入超 净工作台，无菌条件下开颅，快速取脑，置于DHanks液中，仔细剥除脑膜和血管，小心剥离脑组织， 放入10ml小瓶中 •剪碎，加入0.25%胰蛋白酶放入37℃培养箱，定期振 摇促消化。消化约20min， •用含血清的DMEM培养液终止消化，吸管反复轻柔 吹打，用200目不锈钢筛网过滤，将滤液分散组成制 成细胞悬液，1000rpm/min离心、洗细胞两次，每次 10min， •吸收少许细胞悬液，用血球记数板快速计数细胞数，
8．00 0．20
8．00 0．40
第 二节：神经细胞的培养技术

神经元的原代培养 神经胶质细胞的培养 神经干细胞的培养
一 神经元的原代培养(Primary culture) 常用试剂 1）DMEM 培养液：加10%热灭活胎牛血清，30m mol/L 葡萄糖，293.2mg/L L-谷氨酰氨，24.5m mol/L KCl， 100mU /L 胰岛素，青、链酶素各10万µ ／Ｌ，HEPES 2.8383g／Ｌ—PH 值7.2，过滤除菌，-20 ℃保存。 2） D-Hank`液（其中可加入牛血清白蛋白3g/L）（ HBSS）
取材：取3月龄Waster大鼠一只解剖显微镜下用显微手术 镊剥除脑膜及血管，分别取出海马和室管膜下区组织，置 于盛有冰冷D-Hank’s液的平皿中。 • 用双面刀片将组织切成1mm3的块状 • 组织移入已预温至37℃含有0.25%胰蛋白酶 (Trypsin) 和0.02%EDTA的10ml离心管中消化，离心5-10分钟，弃上 清，用含高糖的DMEM/F12(1:1)重悬细胞, 用300目滤网过 滤.按10%的比例加入血清，培养12-16小时或过夜。 • 更换成完全培养基（添加5%CEE、bFGF（终浓度为 20ng/ml）、EGF（终浓度为20ng/ml）、胰岛素（25g/ml ）、葡萄糖（0.6%）、HEPES（5mM）、Glutamine（ 2mM）和N2的DMEM/F12），接种后7-9天传代一次。

培养基：天然培养基（血清，血浆，组织浸出液，水解乳蛋白）
合成培养基（ＭＥＭ ＲＰＭＩ（１６４０） ＤＭＥＭ ＨＡＭ １９９ Ｌ－１５等）
常用的平衡盐溶液（g/L）
Ringer (1985) NaCl KCl CaCl2 MgCl .6H2O MgSO4.7H2O Na2HPO4.H2O Na2HPO4.2H2O KH2PO4 NaHCO3 葡萄糖 酚红 0．20 3．20 1．00 0．02 1．56 1．14 0．06 0．35 1．00 0．02 0．02 0．02 0．20 0．20 0．06 2．42 0．20 0．06 0．35 0．06 9．00 0．42 0．25 PBS Eargle (1948) 6．80 0．40 0．20 Hanks (1949 8．00 0．40 0．14 Dulbecco (1954) 8．00 0．20 1．10 0．10 D-Hanks
4 培养细胞的特性 1）培养细胞生长方式： a 贴附生长型细胞 （大多数） b 悬浮生长型细胞（少数） 2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性
５ 细胞的生长过程：
原代培养：取自动物并置于体外培养中生长的细胞在传代 之前称为原代细胞或原代培养． 传代培养：当细胞持续生长到达一定密度之后，将细胞分 成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充新的培养液为 传代． 细胞系的生长过程： 有限细胞系： 原代培养 传代期 衰退期
Reynold BA, Weiss S . Generation of neurons and astrocytes from
isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science , 1992 ,255:1707-1710. 2 Johe KK, Hazel TG, MaKay RDG, et al . Single factors direct the differentiation of stem-like cells from foetal and adult nervous system. Genes Dev, 1996; 10: 3129-3140. 1 3Shimazaki T, shingo T, weiss S. The
3) 无污染及无毒：体外培养的细胞必须生 长于无污染及无毒的环境！！ 无毒：与细胞直接接触者—培养器皿、 底物、培养基等；间接接触者—配制培养 基的器皿、瓶盖、瓶塞等 无污染： 微生物及交叉污染
常用的培养用液及培养基

培养用液：水
平衡盐溶液（ＢＳＳ） 消化液１胰蛋白酶液（０．２５%） ２ 二乙烯四乙酸二钠（ＥＤＴＡ） ３胶原酶
ciliary neurotrophic factor/leukemia inhibitory factor/gp130 receptor
complex operates in the maintenance of mammalian forebrain neural stem cells. J Neurosci, 2001; 21(19): 7642-53.
神经元的观察：刚分离出的神经元呈圆形，
用倒置显微镜观察有明显的光晕。 •接种一般在6小时可贴壁；8小时已有纤细有 突起长出 •24小时后可见细胞体积开始增大，呈圆形或 椭圆形。生长良好的细胞可见胞体周围有明 显的光晕，立体感强，突起以单、双突起为 主 •培养至第4天，神经元胞体明显增大，形态 多样，有些具有分枝的突起， •培养7天后，神经元形态基本成熟，具有光 滑的胞体，发育良好的突起。
传代时注意事项：a 细胞没有生长到足以覆盖瓶 底壁大部分 表面以前，不要急于传 代 b 注意观察不同细胞有不同的消化时 间；动作要轻柔，避免损伤细胞 c 首次传代时细胞数量要多一些，使 细胞尽快适应新环境
鉴定：星形胶质细胞鉴定： 胶质原纤维酸性蛋白 （Glial fibrillary acid protein GFAP）
无限细胞系： 滞留期 指数增长期 平台期
２０ 原 代 培 养
１８
指 数 细 胞 数 量
细胞系阶段
１６
无限细胞系
１４
１２
１０
有限细胞系
８பைடு நூலகம்
６
０ ２
４
６
８
１０
１２
２４
３４
４４
培养时间（周）
６ 培养细胞生长的条件 1）细胞的营养需要： a 基本营养物质 ：氨基酸 、维生素、碳水化合物及一些无机离子；b 促生 长因子等物质 2）细胞的生存环境： a 温度：哺乳动物和人类 为35~37℃；鸟类为38.5℃ b 气相及PH 值 ：O2及 CO2的值： CO2=5%；空气=95%；PH=7.2~7.4 c 渗透压：260~320m mol/L
运动神经元 Dil标记
Purkinje cell in culture (PEP-19)
2 胶质细胞的培养 胶质细胞 纤维性 的分类：a大胶质细胞— 星形胶质细胞 原浆性
少突胶质细胞
b小胶质细胞
胶质细胞的培养：
特点：比较容易在体外培养生长，生长稳定，可以 传代培养。贴壁过程慢，初期生长慢。