目的基因的PCR扩增

由这3个基本步骤组成一轮循环，理论 上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些 经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模 板，所以经25—35轮循环就可使DNA扩增达 106倍。
100
Melting 94 oC Annealing Primers 50 oC Extension 72 oC
Melting 94 oC
五、注意事项
1、PCR反应非常灵敏，操作应尽量控制在无菌环境 下操作。 2、吸头、离心管应高压灭菌，每次吸头用毕应更换， 防止试剂的相互污染。 3、 PCR结果若出现非特异性的扩增条带，有必要 进一步优化反应条件，包括改变退火 、 温度和时 间，调整Mg2+浓度等。 4、PCR反应特异性强，引物浓度、TaqDNA聚合酶 和dNTP的量不宜过多。 5、引物设计要合理。
（二） 电泳
3.结果观察
取10μl扩增产物用1%琼脂糖 胶进行电泳分析，检查反应 产物及长度。
M 1
C1 2
3
4
5 6
7Baidu Nhomakorabea
8
C2 9 10 11 12 13 14 M
转gutD/mtlD双价基因植株的PCR检测（秀水11） M: 250bp Ladder Marker; C1、C2: 未转基因对照; 1-7: 转mtlD/gutD基因不同植株DNA的mtlD基因PCR扩增 产物(1.15kb);8-14:转mtlD/gutD基因不同植株DNA的 gutD基因的PCR扩增产物(0.88kb)

PCR（聚合酶链式反应）包括3个基本步骤： ⑴ 模板变性（ 92℃-96℃ ）：目的双链DNA片段在 94℃下解链；
⑵ 退火（37℃-65℃）：寡核苷酸引物在适当温度 （50℃左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对， 形成局部双链；
⑶ 延伸（72℃）： 在TaqDNA聚合酶合成DNA的最 适温度下，以目的DNA为模板，dNTP为原料，从引 物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。
1.PCR反应体系
（2）混匀（手指轻 弹Eppendorf管底 部 离心2-5s） （3）加石蜡油少许 封住溶液表面
（4）PCR扩增
2.PCR扩增反应参数设定
T ( ℃) 94 Duration 2 min Cycle 1
94
56
0.5 min
0.5 min
30
72
72 4
1 min
10 min 2 hr 1 storage
30x
Temperature
50
0
T i m e
5’ 3’
3’
5’
3’
5’
5’ 3’ 5’
5’
5’
3’ 5’
5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’
5’ 3’ 5’
3’
三、实验试剂
ddH2O 10×PCR buffer(with MgCl2+ ) dNTP Taq酶 模板DNA 引物 DNA Marker 琼脂糖 6×DNA上样缓冲液
四、操作步骤
（一）PCR反应 所用溶液融化后置于冰上。 依次混匀下列试剂：
（1）按序将如下成分混合置于 Eppendorf管内 a. 2.5μl 10×PCR buffer(with MgCl2 ) b. 0.5μl dNTP mix c. 0.5μl 引物1 d. 0.5μl 引物2 e. 1μl 模板DNA f. 1μl Taq酶 g. 19μl ddH2O
实验三、目的基因的PCR扩增
一、实验目的

1、掌握PCR反应的基本原理与实验操作技术

2、学习PCR扩增仪的使用
二、实验原理
聚合酶链式反应(PCR)是一种体外DNA扩增 技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便 和应用广泛等特点。 PCR工作原理类似于DNA的体内复制过程， 是将待扩增的DNA片段和与其两侧的已知序 列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸,将该 寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增序 列片段的特异性和片段长度。
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