细胞生物学实验报告——甲基绿-派洛宁染色

山东大学细胞生物学实验报告

蟾蜍红细胞甲基绿—派洛宁染色

姜政2012/10/9

实验目的：

学习用甲基绿—派洛宁染色观察验证蟾蜍红细胞中DNA和RNA的分布，掌握血涂片制作，了解甲基绿—派洛宁染色的基本原理和应用以及细胞化学的基本概念。

实验原理：

核酸（脱氧核糖核酸，DNA；核糖核酸，RNA）的结构单体核苷酸由核糖、碱基和磷酸基团构成。由于嘌呤碱基和嘧啶碱基环上都有含孤对电子的N，胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤都含有-NH2，因此，在水溶液中，核苷酸碱基（图1）上这些含有孤对电子的N既可以接受质子（-NH2+H+→-NH3+，N：+H+→N+:H），也可以释放质子（-NH3+→-NH2+H+，N+:H- H+→N：+H+）。通常，核苷酸中的磷酸基团存在两步解离，且碱基N上H+的解离常数在磷酸基团一级解离（-PO3H2→-PO3-H+H+）常数和二级解离（-PO3-H→-PO32-+H+）常数之间，所以，当磷酸基团一级解离与碱基N上H+的解离恰好使核苷酸静电荷为零时，核苷酸就达到了等电点。因此，在水溶液中，核酸分子可以被看作是两性电解质，由于DNA与RNA的组成不同，两者等电点不同，在同一份溶液中的电性就略有不同。

图1. 五种核苷酸碱基的结构和孤对电子示意图（左，引自Stacey D. Wetmore等，2000）和甲基绿、派洛宁的分子结构（右）。

甲基绿（Methyl Green）和派洛宁（Pyronin）都是具有芳香体系且能够发生电离的染料分子（图1），在水中发生电离后都成为带正电的分子。因此，甲基绿和派洛宁都是碱性染料，专染酸性核酸分子。电离后的甲基绿分子带两个正电荷，派洛宁分子带一个正电荷。这种电荷上的差异使两种染料分子具有不同的染色性质。加之两种染料分子具有完全不同的颜色（甲基绿是亮绿色，派洛宁是红色），两种染料配合使用的染色剂（Unna试剂）很早就成为区分细胞中DNA与RNA分布的常用试剂[1]。

甲基绿-派洛宁对核酸着色的机理可以分解为两步，第一步是电荷相互作用下染料分子向特定核酸分子的靠近，第二步是疏水相互作用下染料分子与核酸分子的结合[2,3]。在适当的PH（约4.8）下，核酸分子带负电，染料分子带正点，这是保证染料分子与核酸分子有效结合的关键条件。在染料与核酸分子的具体结合方式这个问题上，有人认为是带正电的染料分子与核酸带负电的磷酸基团结合，形成了盐[4]。

甲基绿和派洛宁分别对DNA和RNA的特异性结合可能是由DNA和RNA不同的聚合度造成的。由于DNA的双螺旋结构，其负电荷密度要比以单链形式为主的RNA大，因此更易与具有两个正电荷，正电荷密度更高的甲基绿结合。在甲基绿-派洛宁染液的使用过程中，J. Goldstein发现不同配比的染液能够区分mRNA和rRNA，以及解链的DNA分子[5]。也有人尝试利用甲基绿-派洛宁染液定量测定不同细胞中DNA 和RNA的相对含量[6]。

材料、试剂：

蟾蜍血液，甲基绿-派洛宁染液，70%乙醇溶液，95%乙醇溶液

实验方法：

取新鲜蟾蜍血液制血涂片，空气中干燥后以70%乙醇固定10min，晾干。在玻片血膜上滴加足量甲基绿-派洛宁染液，染色15min，以蒸馏水冲洗去除染液。滴加95%乙醇分色，晾干玻片，进行观察。

实验结果：

A B

C D

图2. 甲基绿-派洛宁染色的蟾蜍血涂片。

A,B,C (400×)显示多数红细胞细胞质被染成淡红色或橙色，细胞核染为蓝绿色；D (1000×)显示部分红细胞发生胞质间融合（图中短箭头）。

讨论：

从染色结果来看，多数血涂片染色后只显示一种颜色，能够区分出两种颜色的涂片（图2）色彩也偏于暗淡。在所用两种不同配比的甲基绿-派洛宁染液中，前者染出的涂片普遍偏绿，后者染出的涂片普遍偏红，两种染液对DNA和RNA的特异性区分都不好。因此，除去可能是分色过度导致的色彩饱和度降低（图2），本次染色不理想更可能的原因是甲基绿和派洛宁染料的相对浓度和染液的PH不合适，因为这两个因素被认为是保证染色效果的关键[1]。

图3. 标准配比甲基绿-派洛宁染液在不同PH条件下染色15min的效果（引自P. Prento等，2003）。

鉴于不同PH条件下标准甲基绿-派洛宁染液的染色结果并没有出现全绿的情况（图3），实验中出现最多的全部染绿的结果应该是由染料配比不合适造成的。其次，由于派洛宁比甲基绿更易溶于乙醇，95%乙醇分色的过程可能导致了派洛宁在血涂片上的彻底清除。

血涂片上个别红细胞的融合（图2，D）可能是在没有抗凝剂的情况下，新鲜的血液发生的自发性溶血。红细胞之间的融合可能与细胞死亡时细胞内破裂的溶酶体有关。玻片上同一区域不同细胞间着色的差异（图2，A-C）表明了RNA含量的差异，可能与细胞间不同的“年龄”，即不同的代谢活性有关。

参考文献：

1. P Prento and Ho Lyon. Methyl green-pyronin Y staining of nucleic acids: studies on the effects of staining time, dye composition and diffusion rates. Biotech and Histochem, 2003, Vol. 78, 27-33.

2. P Prento. Staining of macromolecules: possible mechanisms and examples. Biotech and Histochem, 2009, Vol. 84, 139-158.

3. P Prento. A contribution to the theory of biological staining based on the principles for structural organization of biological macromolecules. Biotechnic and Histochemistry, 2001, Vol. 76, 137-161.

4. Arthur W. Pollister and Cecilie Leuchtenberger. The Nature of The Specificity of Methyl Green for Chromatin. Proc. N. A. S, 1949, Vol. 35, 111-116.

5. D. J. Goldstein. Mechanism of differential staining of nucleic acids. Nature, 1961, Vol. 191, 407-408.

6. Seymour Perry, John Reynolds and Mary Baker. Methl-Green-Pyronin as a differential Nucleic Acid Stain for Peripheral Blood Smears. Blood, 1956, Vol. 11, 1132-1139.

7. Stacey D. Wetmore, Russell J. Boyd, Leif A. Eriksson. Electron affinities and ionization potentials of nucleotide bases. Chemical Physics Letters, 2000, Vol. 322, 129–135.