淋球菌对头孢克肟等6种抗生素敏感性及耐药质粒分型研究

淋球菌对头孢克肟等6种抗生素敏感性及耐药质粒分型研究

吴兴中;曾维英;蓝银苑;李奕歆;唐三梅;郑和平;李燕娃;黄澍杰;陈少楠;郭炽星;黄进梅;覃晓琳;薛耀华

【摘要】目的:检测2011年广东省广州、佛山、江门、肇庆四市临床分离的淋球菌流行株对青霉素、四环素、环丙沙星、头孢克肟、头孢曲松和大观霉素等6种抗生素的敏感性,对质粒介导的产β-内酰胺酶淋球菌 (PPNG)和四环素高水平耐药淋球菌(TRNG)进行耐药质粒 TEM-1和tetM基因分型.方法:采用琼脂稀释法测定菌株对6种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC),判断敏感性按WHO西太区淋球菌耐药性监测统一标准,其中头孢克肟敏感性试验和判断标准按美国临床和实验室标准化研究所(CLSI)判断.用纸片酸度法检测产β-内酰胺酶淋球菌(PPNG)菌株,多重PCR方法鉴定β-内酰胺酶质粒并进行 TEM-1和TRNG tetM基因分型.结果:来自四市429株淋球菌中检出青霉素耐药364株(84.8%),四环素和环丙沙星耐药株(率)分别为389株(90.7%)和418株(97.4%),未发现对大观霉素、头孢克肟和头孢曲松耐药菌株,但头孢曲松低敏率达到34.0%(146/429),头孢克肟低敏只有1株(0.2%).青霉素、四环素和环丙沙星的MIC50及MIC90均已超过耐药标准.检出PPNG株156株(36.4%),TRNG株201株(46.9%).耐药质粒TEM-1基因分型以亚洲型为主(94.9%,148/156),只有8株携带非洲型质粒;tetM基因分型均为荷兰型.结论:四市淋球菌对青霉素、四环素和环丙沙星耐药率较高,对大观霉素、头孢克肟和头孢曲松的敏感性较高,TEM-1基因质粒分型以亚洲型为主,tetM基因分型均为荷兰型.【期刊名称】《皮肤性病诊疗学杂志》

【年(卷),期】2012(019)006

【总页数】5页(P352-355,358)

【关键词】奈瑟氏球菌,淋病;微生物敏感性试验;TEM-1

【作者】吴兴中;曾维英;蓝银苑;李奕歆;唐三梅;郑和平;李燕娃;黄澍杰;陈少楠;郭炽星;黄进梅;覃晓琳;薛耀华

【作者单位】广东省皮肤病医院,广东,广州,510091;广东省皮肤病医院,广东,广

州,510091;广东省皮肤病医院,广东,广州,510091;广东省皮肤病医院,广东,广

州,510091;广东省皮肤病医院,广东,广州,510091;广东省皮肤病医院,广东,广

州,510091;佛山市皮肤病防治所,广东,佛山,528000;江门市皮肤医院,广东,江

门,529002;肇庆市皮肤病医院,广东,肇庆,526020;广州市番禺区慢性病防治站,广东,广州,511400;广东省皮肤病医院,广东,广州,510091;广东省皮肤病医院,广东,广

州,510091;广东省皮肤病医院,广东,广州,510091

【正文语种】中文

【中图分类】R759

有效的抗生素治疗是治愈淋病和遏制淋病播散的重要途径，随着淋球菌的耐药性的变化和耐药质粒流行株的扩散，临床选用抗生素显得日益重要。为了解广东省四市2011年度淋球菌流行株的耐药性和产β-内酰胺酶淋球菌(PPNG)耐药质粒TEM-1以及四环素高水平耐药淋球菌(TRNG)tetM基因分型情况，对广州、佛山、江门和肇庆四市临床分离的429株淋球菌流行株测定了6种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)以及进行了TEM-1以及tetM基因分型的研究，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株

1.1.1 临床菌株 429株淋球菌由四市性病门诊患者的泌尿生殖道分泌物中分离得到，

男性标本自尿道口内3 cm～4 cm处，女性由宫颈口内1 cm～2 cm处取材，接

种于选择性培养基(TM)，所有菌株经革兰染色、氧化酶和过氧化氢酶试验及糖发

酵试验确证后冻存备用。

1.1.2 质控菌株 PPNG阳性和阴性质控菌株(WHO J和WHO D株)，由中国CDC 性病艾滋病控制中心赠送。质粒分型标准质粒由加拿大Jo-Anne R.D教授赠送。1.2 抗生素

大观霉素(普强公司)、头孢曲松(Roche公司)、青霉素(SmithKline公司)、四环素(Sigma公司)和环丙沙星(Bayer Leverkussen公司)等5种抗菌药物均为标准品，由中国CDC性病控制中心提供。头孢克肟标准品由中国药品生物制品检定所提供。

1.3 培养基

GC基础培养基(OXOID公司)加入10%新鲜羊血。

1.4 标准菌株

6株淋球菌标准菌株D、G、J、L由中国疾病预防控制中心性病控制中心赠送，其中D、G、L株为产β-内酰胺酶阴性菌株，J株为产β-内酰胺酶(PPNG)菌株。

1.5 试剂及仪器

Taq DNA 聚合酶，10 × Buffer、MgCl2、dNTP 等PCR试剂购自宝生生物工程(大连)有限公司。DNA相对分子质量标准标记物购自立陶宛Fermentas公司。PCR引物由上海Invitrogen生物工程公司合成。PCR仪为美国PEPKIN ELMER

公司产品，电泳仪为美国Bio-Rad公司产品，凝胶成像系统为法国Bio-print公

司产品。

1.6 方法

1.6.1 菌株对抗生素敏感性测定采用WHO西太区淋球菌耐药监测规划协作组推荐的琼脂稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)[1]。先将各抗生素用适当的缓冲液溶解，配成溶液，再倍比稀释，各抗菌药物在培养基平皿上的最终浓度分别为:青霉素、四

环素和环丙沙星均为0.03μg/mL～32 μg/mL，头孢曲松0.001 μg/mL～1

μg/mL，大观霉素0.5μg/mL～128μg/mL。试验菌株和标准菌株先在无选择性培养基(GC)上传代2次，用16～18小时的新鲜培养物制成107～108 cfu/mL的菌悬液，用多头点接种器蘸取菌液接种于各抗生素琼脂平皿，经35℃培养24小时

观察结果，以能抑制淋球菌生长的最小药物浓度为该药的最小抑菌浓度(MIC)。每批试验均由标准菌株作质控，按WHO西太平洋地区淋球菌耐药监测项目推荐的

标准判断药物敏感性[1]，头孢克肟敏感性试验和判断标准按美国临床和实验室标

准化研究所(CLSI)判断[2]，并统计出 MIC50和 MIC90。

1.6.2 产β-内酰胺酶淋球菌(PPNG)测定采用纸片酸度法[3]。以标准菌株J株作为阳性对照，标准菌株D株为阴性对照。

1.6.3 PCR模版DNA的提取取GC培养基上纯培养18 h淋球菌，用灭菌水配成

菌悬液，浓度相当于1个麦氏单位，取该菌悬液100μL离心去掉灭菌水，加入

50μL裂解液，100℃沸水浴10 min，冷却后以10 000 r/min的速度在低温离心

机中离心5 min，上清液即为DNA模板，将上清液转移到一干净无菌微量离心管，－20℃保存备用。

1.6.4 多重PCR 采用Palmer多重PCR方法测定 TEM-1基因型[4]。引物包

括:BL1:5'-TACTCAATCGGTAATTGGCT-3'，BL2:5'-CACCTATAAATCTCGCAAGC-3'，BL3:5'-CCATAGTGTTGAGTATTGCGAA-3'，BL4:5'TCATTCGTGCGTTCTAGGA-3';tetM基因型引物包括通用正向引物(UF):5'-TCGGACAAGCGGAAAGC-3'，反向引物美国型(AR):5'-GCATTACACATCCCTAC-3'，反向引物荷兰型(DR):5'-TGCAACAGAGTGAGG-3'。反应总体系25μL，包括 Taq酶(5U)0.125μL，dNTP(2.5μmol)2 μL，10×PCR

缓冲液2.5 μL，引物(10 μM)各0.5μl，模板DNA 2μL。PCR反应条件:预变性94℃，3 min;变性94℃，15 s;退火64℃，15 s;延伸72℃，1 min;30个循环。