急性毒性及长期毒性标准操作技术

急性毒性试验

佚名

试验目的：急性毒性试验是在24小时内给药1次或2次（间隔6-8小时），观察动物接受过量的受试药物所产生的急性中毒反应，为多次反复给药的毒性试验设计剂量、分析毒性作用的主要靶器官、分析人体过量时可能出现的毒性反应、I期临床的剂量选择和观察指标的设计提供参考信息等。

一、啮齿类动物单次给药的毒性试验

（一）试验条件

1．动物品系：常用健康的小鼠、大鼠。选用其他动物应说明原因。年龄一般为7-9周龄。同批试验中，小鼠或大鼠的初始体重不应超过或低于所用动物平均体重的20%。实验前至少驯养观察1周，记录动物的行为活动、饮食、体重及精神状况。

2．饲养管理：动物饲料应符合动物的营养标准。若用自己配制的饲料，应提供配方及营养成分含量的检测报告；若是购买的饲料，应注明生产单位。应写明动物饲养室内环境因素的控制情况。

3．受试药物：应注明受试药物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。

（二）试验方法：

由于受试药物的化学结构、活性成分的含量、药理、毒理学特点各异，毒性也不同，有的很难观察到毒性反应，实验者可根据受试药物的特点，由下列几种实验方法中选择一种进行急性毒性试验。

1．伴随测定半数致死量（LD50）的急性毒性试验方法。

2．最大耐受剂量（MTD）试验方法：最大耐受剂量，是引起动物出现明显的中毒反应而不产生死亡的剂量。

3．最大受试药物量试验方法：在合理的浓度及合理的容量条件下，用最大的剂量给予实验动物，观察动物的反应。

4．单次口服固定剂量方法（Fixed-dose procedure）。选择5、50、500

和2000mg/kg四个固定剂量。

实验动物首选大鼠，给药前禁食6-12小时，给受试药物后再禁食3-4小时。如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先用雌性动物进行预试。根据受试药物的有关资料，由上述四个剂量中选择一个作初始剂量，若无有关资料作参考，可用500mg/kg作初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000mg/kg进行预试，

此剂量如无死亡发生即可结束预试。如初始剂量出现严重的毒性反应，那就用下一个挡次的剂量进行预试，如该动物存活，就在此两个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。每个剂量给一只动物，预试一般不超过5只动物。每个剂量试验之间至少应间隔24小时。给受试药物后的观察期至少7天，如动物的毒性反应到第7天仍然存在，尚应继续再观察7天。

在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量最少用10只动物，雌雄各半。根据预试的结果，由前面所述的四种剂量中选择出可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量；如预试结果表明，50mg/kg引起死亡，则降低一个剂量档次试验。

试验观察：给受试药物后至少应观察2周，根据毒性反应的具体特点可适当延长。对每只动物均应仔细观察和详细记录各种毒性反应出现和消失的时间。给受试药物当天至少应观察记录两次，以后可每天一次。观察记录的内容包括皮肤、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循环、自主及中枢神经系统行为表现等。动物死亡时间的记录要准确。给受试药物前、给受试药物后1周、动物死亡及试验结束时应称取动物的体重。所有动物包括死亡或处死的动物均应进行尸检，尸检异常的器官应作病理组织学检查。固定剂量试验法所获得的结果，参考下表标准进行评价。

单次口服固定剂量试验法结果的评价

二、非啮齿类动物的急性毒性试验（近似致死剂量试验）

（一）试验条件

1．动物品系：一般用6只健康的Beagleg狗和猴。选用其他种属的动物时应说明原因。年龄一般为6-8月龄。同批试验中，试验初始动物的体重应不超过或者低于所用动物平均体重的20%。试验前至少驯养观察2周，观察记录动物的行为活动、饮食、体重、心电图及精神状况，择其正常、健康、雌性无孕者作为受试动物。

2．饲养管理：动物饲料应符合动物的营养标准。若用自己配制的饲料，应提供配方及营养成分含量的检测报告；若是购买的饲料，应注明生产单位。注明动物饲养室内环境因素的控制情况。

3．受试药物：应注明受试药物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。

（二）近似致死剂量试验方法：

1．估计可能的毒性范围：根据小动物的毒性试验结果、受试药物的化学结构和其它有关资料，估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。

2．按50%递增法，设计出含10-20个的剂量序列表。

3．根据估计，由剂量序列表中找出可能的致死剂量范围，在此范围内，每间隔一个剂量给一只动物，测出最低致死剂量和最高非致死剂量，然后用二者之间的剂量给一只动物，此剂量即为所要求的近似致死剂量。

4．给药途径：原则上应与临床用药途径相同，如有不同，应说明理由。

5．观察记录：给受试药物后观察14天，当天给受试药物后持续观察30分钟，第1-4小时再观察一次，以后每天观察一次。仔细观察记录各动物的中毒表现和其出现和消失时间、毒性反应的特点和死亡时间。中毒死亡或中毒表现明显者，需作大体解剖检查。尸检异常的组织器官应作组织病理学检查。

三、说明：

（一）创新药物应提供两种动物的急性毒性试验资料，一种为啮齿类动物，另一种为非啮齿类动物。

（二）溶于水的药物，啮齿类动物应提供两种给药途径的毒性试验资料，一种静脉注射途径，一种临床途径，若临床用静脉注射途径时，可只做静脉注射的急性毒性试验。

反复给药的毒性试验（长期毒性试验）

一、目的

观察动物反复给予受试药物后，对机体产生的毒性反应及其严重程度，主要的毒性靶器官及其损害的可逆性，提供无毒性反应剂量及临床上主要的监测指标，为制定人用剂量提供参考。

二、试验条件

（一）动物

1．动物品系：一般用两种动物，一种啮齿类动物，另一种为非啮齿类动物。常用SD或Wister大鼠和Beagle狗或者猴。选用其他动物，应说明原因。

2．年龄：根据试验期限的长短而定。大鼠一般6～9周龄。Beagleg狗一般6～12月龄。试验开始时体重差异不应超过或者低于该次试验动物平均体重的20%。

3．实验前至少驯养观察2周。观察记录动物的行为活动、饮食、体重、精神状况、心电图、有关血液学及血液生化学等功能指标。选择正常、健康、雌性无孕动物作为受试动物。

（二）饲养管理

1．饲料：所用饲料应符合动物的营养标准。若用自己配制的饲料，应提供配方及营养成分含量的检测报告；若是购买的饲料，应提供生产单位。

2．实验的环境条件：应写明动物饲养室内环境因素的控制情况。

（三）受试药物：应写明受试物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。

三、试验方法

（一）试验分组：一般设三个剂量组和一个对照组。必要时尚需设溶媒对照组。低剂量组原则上应高于同种动物药效有效剂量，在此剂量下，动物不出现毒性反应；高剂量组原则上应使动物产生明显的或严重的毒性反应，甚至引起少数动物死亡；为观察毒性反应的剂量关系，在高、低剂量组之间应再设1个中剂量组。

（二）动物数：每组动物的数量应根据给药周期的长短决定。大鼠一般为雌、雄各10～30只；Beagle狗或者猴，一般雌、雄各3～4只。

（三）给药途径：原则上应与临床用药途径相同。若用其他途径应说明原因。口服给药一般采用灌胃给予受试药物。如采用将受试药物混入饲料中服用，应提供受试药物与饲料混合的均匀性、受试物的稳定性、有关受试物质量检查及说明动物食入规定受试药物的量等方面的资料，以确保获得准确可靠的试验结果。临床用药途径为静脉注射时，由于给药周期长，大鼠静注有困难时，可用其它适宜的途径代替。

原则上应每天给药。试验周期长的试验，也可采取每周给药6天。每天给药时间应相同。应根据体重增长情况适时调整给药量。

（四）观测项目：原则上应根据受试物的特点选择其相应的观测指标。一般共性的观测指标最少应包括以下内容：

1．一般观察：外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便性状、食量、体重、给药局部反应、狗的心电图变化等。大鼠群养时，应将出现中毒反应的动物取出单笼饲养。发现死亡或濒死动物，应及时尸检。试验期间如动物发生非药物性的疾病反应时，应及时进行隔离处理。

2．血液学指标：红细胞、网织红细胞计数、血红蛋白、白细胞总数及其分类、血小板。

3．血液生化指标：天门冬氨酸氨基转换酶（AST）、丙氨酸氨基转换酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、尿素氮（BUN）、总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、血糖（GLU）、总胆红素（T-BIL）、肌酐（Crea）、总胆固醇（T-CHO）。

4．系统尸解和病理组织学检查：

系统尸解：应全面细致，为组织病理学检查提供参考。

脏器重量：一般应称取下列脏器和组织的重量并计算脏器系数：心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、睾丸、子宫、脑、前列腺。

病理组织学检查：对照组和高剂量组动物及尸检异常者应详细检查，其它剂量组在高剂量组有异常时才进行检查。内容包括：肾上腺、胰腺、胃、十二指肠、回肠、结肠、脑垂体、前列腺、脑、脊髓、心、脾、胸骨（骨和骨髓）、肾、肝脏、肺、淋巴结、膀胱、子宫、卵巢、甲状腺、胸腺、睾丸（连附睾）、视神经。

（五）恢复性观察：最后一次给受试药物后24小时，每组活杀部分动物检测各指标，留下部分动物，根据受试物的特点，继续观察一定时间再活杀检查，以了解毒性反应的可逆程度和可能出现的延迟性毒性反应。在此期间除了不给受试物外，其它观察内容与给受试物期间相同。

（六）观测指标的时间和次数：应根据试验期限的长短和受试物的特点而定。原则上应尽量发现最早出现的毒性反应。

四、说明

（一）关于反复给药毒性试验的期限：原则上根据临床用药的疗程而定。

1．一般药物的给药期限，可参考下表设计：

表1一般药物反复给药的毒性试验期限

2．细胞毒类受试药物，由于细胞毒类受试药物的毒性强弱差别较大，临床上的用药方案也有很大差别，有的一周给药一次，有的两周甚至三周给药一次，因此，很难规范为一种模式。应根据具体受试药物的特点和反复给药毒性试验的目的设计毒性试验方案。

急性毒性是指动物一次或24小时内多次接受一定剂量的受试物，动物在短期内出现的毒性反应。其目的是为新药的研发提供参考信息。

中华人民共和国卫生部于1993年颁发的《中药新药研究指南》和国家药品监督管理局1999年颁发的《中药新药药理毒理研究的技术要求》，对于统一、规范中药急性毒性试验，推动我国中药的研究和开发起到了积极的作用。但随着新药研究手段的不断改进，对中药、天然药物认识的进一步深入，这些要求越来越表现出它的局限性。

多数中药、天然药物作用温和，中药复方制剂通过合理的配伍，也可能使毒性减轻。多数中药、天然药物新药，其处方来源有些是古方，有些是医院制剂或临床经验方，有一定的临床应用基础。但由于现代中药、天然药物制剂运用了大量的新技术甚至新的理论，与传统中药相比，物质基础和给药方式可能有明显改变，而有些改变带来的结果又是未知的，特别是当某些成分的含量明显提高后，其药理作用可能会明显增强，毒性反应也可能明显增大。因此，中药、天然药物进行急性毒性试验研究十分必要。

本指导原则是根据中药、天然药物的特点，结合国际上药物安全性评价的要求和我国药物安全性研究现状而制订的。

本指导原则适用于中药、天然药物的急性毒性试验研究。

中药、天然药物的情况复杂，本文所提及的内容不可能涵盖中药、天然药物急性毒性试验研究的全部实际情况，在进行中药、天然药物急性毒性试验研究时，应遵循“具体问题具体分析”的原则。

二、急性毒性试验的基本原则：

（一）试验管理

急性毒性试验必须执行“药物非临床研究质量管理规范（GLP）”。

（二）试验设计

试验设计应符合随机、对照、重复的基本原则。

三、急性毒性试验的基本内容

（一）受试物

急性毒性研究的受试物应能充分代表临床试验受试物和上市药品，因此建议受试物采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的中试样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等。如不采用中试样品，应有充分的理由。如果由于给药容积或给药方法限制，可采用原料药（提取物）进行试验。

溶媒或赋形剂：选择合适的溶媒或赋形剂。

（二）实验动物

一般应采用哺乳动物，雌雄各半。如临床为单性别用药，则可采用相对应的单一性别的动物。大、小鼠为常用的实验动物，其他动物也可使用，当采用非啮齿类动物更适合进行研究时，尽可能采用非啮齿类动物。啮齿类动物应符合国家实验动物标准Ⅱ级及其以上等级要求，非啮齿类动物应符合国家实验动物标准Ⅰ级及其以上等级要求。

通常采用健康成年动物进行试验。如果受试物拟用于儿童，建议考虑采用幼年动物。动物初始剂量不应超过或低于平均体重的20％。

（三）试验分组

除设受试物合适的剂量组外，还应设空白（和／或阴性）对照组。

（四）给药途径

给药途径不同，受试物的吸收率、吸收速度和暴露量会有所不同，为了尽可能观察到动物的急性毒性反应，可采用多种给药途径进行急性毒性试验研究。给药途径一般采用两种给药途

径，其中一种应与拟临床给药途径一致，如不采用拟临床途径给药，必须充分说明理由。灌胃给药时应空腹。

（五）给药容量：灌胃给药，大鼠给药容积每次一般不超过20ml/kg，小鼠每次一般不超过40ml/kg；其他动物及给药途径的给药容量可参考相关文献及根据实际情况决定。

（六）观察期限：一般为7～14天，如果毒性反应出现较慢应适当延长观察时间，如观察时间不足7天，应充分说明理由。

一般应详细观察给药后4小时内动物的反应情况，然后每天上、下午各观察一次。

（七）观察指标：包括动物体重变化、饮食、外观、行为、分泌物、排泄物等。记录所有动物的死亡情况、中毒症状及中毒反应的起始时间、严重程度、持续时间、是否可逆等。对濒死及死亡动物应及时进行大体解剖，其他动物在观察期结束后进行大体解剖，当发现器官出现体积、颜色、质地等改变时，则对改变的器官进行组织病理学检查。

（八）结果处理和分析

1、根据所观察到的各种反应出现的时间、严重程度、持续时间等，分析各种反应在不同剂量时的发生率、严重程度。根据观察结果归纳分析，判断每种反应的量效关系及随时间的变化。

2、参考附录一，判断出现的各种反应可能涉及的器官、组织或系统等。

3、根据大体解剖中肉眼可见的病变和组织病理学检查的结果，初步判断可能的毒性靶器官。组织病理学检查应附有病理学检查负责人签字的报告及有病变组织的病理照片。

4、根据不同剂量组各种反应的发生率、动物死亡情况等，判断动物对受试物的耐受性、最大无反应剂量、最小毒性反应剂量、最大耐受剂量、最小致死剂量等，初步判断药物的安全范围。

5、说明所使用的计算方法和统计学方法，提供所选用方法合理性的依据。

6、应根据急性毒性试验结果，提示在其他安全性试验、临床试验、质量控制方面应注意的问题，同时，结合其他安全性试验、有效性试验及质量可控性试验结果，权衡利弊，分析受试物的开发前景。