GLP实验室《长期毒性试验SOP》的制定 - 副本

GLP实验室《长期毒性试验SOP》的制定

GLP(Good Laboratory Practice for Nonclinical Safety Studies Practice)即药品非临床研究质量管理规范(亦称优良实验室的质量管理规范）。应用于药品的非临床安全性评价研究的实验室，其目的作用是为了提高药品非临床安全性评价研究（即毒理学研究）的质量，确保实验资料的真实性、完整性和可靠性，最大程度排除由于偶然的误差带来的影响，尽早发现和改正这类错误，并在事后纠正和追究其原因。GLP的基本精神在于怎样减少人为误差，以得到可信性高的实验数据，以保障人民用药安全[1]。

我国药品非临床研究质量管理规范分九章37条，主要内容有：组织机构和人员、实验设施、仪器设备和实验材料、标准操作规程、研究工作的实施、资料档案和监督检查 [2]。非临床研究，系指在实验室条件下，用实验系统进行的各种毒性试验，包括单次给药的毒性试验、反复给药的毒性试验、生殖毒性试验、遗传毒性试验、致癌试验、局部毒性试验、免疫原性试验、依赖性试验、毒代动力学试验及与评价药物安全性有关的其它试验。非临床安全性评价研究机构，系指从事药物非临床研究的实验室。

一、标准操作规程(SOP)

SOP是GLP实验室质量体系中重要的部份，是建立质量体系的体现，对质量体系的运行起着至关重要的作用。GLP实验室的日常工作几乎无一例外地建立在以SOP为核心的基础之上。因此，必须对SOP进行有效的控制和管理，这是GLP实验室工作顺利实施的重要保证。SOP的控制和管理是指对SOP的制订、分类、审批、发布、登记、分发、修订／废弃、回收／销毁的整个过程实施控制和管理，其目的是确保SOP在其所适用的备个有关场所始终保持现时的有效性[3]。

1、标准操作规程主要包括以下方面：

（一）标准操作规程的编辑和管理；

（二）质量保证程序；

（三）供试品和对照品的接收、标识、保存、处理、配制、领用及取样分析；

（四）动物房和实验室的准备及环境因素的调控；

（五）实验设施和仪器设备的维护、保养、校正、使用和管理；

（六）计算机系统的操作和管理；

（七）实验动物的运输、检疫、编号及饲养管理；

（八）实验动物的观察记录及实验操作；

（九）各种实验样品的采集、各种指标的检查和测定等操作技术；

（十）濒死或已死亡动物的检查处理；

（十一）动物的尸检、组织病理学检查；

（十二）实验标本的采集、编号和检验；

（十三）各种实验数据的管理和处理；

（十四）工作人员的健康检查制度；

（十五）动物尸体及其它废弃物的处理；

（十六）需要制定标准操作规程的其它工作。

2、制订SOP的方法

SOP的基本格式包括SOP的名称、编号和版本、拟订人、审核人、批准人(签名和日期)、颁发和生效日期、适用范围、规程及参考文献等。所有SOP文件必须有系统的编码及修订号, 以便于识别、控制及追踪, 同时可避免使用或发放过时的SOP。系统性: 统一分类、编码并指定专人负责给定编码, 同时进行记录; 准确性: SOP应与编码一一对应,一旦某一SOP终止使用, 此SOP编码即告作废, 并不得再次启用; 可追踪性: 根据SOP编码系统规定,可随

时查询SOP的变更历史; 稳定性: SOP编码系统一旦规定, 一般情况下不得随意变动, 应保持系统的稳定性, 以防止SOP管理的混乱; 相关一致性: SOP一旦经过修订, 必须给定修订号, 同时对其相关SOP中出现的该编号进行修正[4]。

3、制定SOP 基本程序

为使制定SOP的工作有章可循。首先应制定出撰写SOP的程序。明确在制定SOP工作过程中各类人员的职责。在统一布局下，完成SOP的撰写——修改——审查——确认——批准——印刷——发行——使用——保管——修订——淘汰等项工作。

参加制定SOP工作的人员主要职责是：(1)负责者由GLP实验室负责软件建设的领导担任。负责制定编写SOP的原则、明确编写人员分工、确定SOP形式、制定SOP主目录、建立统一编码系统、协调各方面的工作、检查督促计期落实情况、SOP原始文件归挡等．(2)制订者：由相应专业的课题负责人或有经验的工作人员担任。负责具体SOP的撰写、修改、校对等。撰写出符台GLP要求的SOP。(3)审修者：由各专业组长或课题负责人担住。负责检查巳撰写的SOP是否符合GLP的要求。对不合标准的SOP进行修改、定稿。(4)确认者由质量保证部门(Quality Assurance Unit．QAU)负责人担任。负责审查SOP的形式、内客，批准SOP的印刷、发行、使用、保管、修订等。(5)批准者：由主管部门领导担任。负责已定稿的SOP的批准、发布、复制、淘淡等工作。(6)印刷者；由印刷部门负责同志担任。负责SOP的排版、编辑。根据需要印制一定数量的SOP手册[5]。

4、SOP的编辑

目的是规范SOP的形式和结构。SOP形式和结构的规范，不可能有统一的模式，完全由GLP实验室根据自己的特点规定。比如每页是否需要设页眉页脚？如果需要，什么样的内容分别放在页眉和页脚内？SOP的首页应提供一些什么样的信息？制定者、确认者和批准者的签名放在何处？不同类别及属性的编号系统如何规定？SOP以后的修改信息登记在何处？一份的正文是否需要有前言和目的？SOP论述的格式如何统一等。诸如此类带有随意性的问题GLP实验室都应该根据自己的特点作统一规定，使本实验室SOP的形式和结构规范化[6]。

5、SOP的管理

GLP实验室的SOP,是实验室的知识财产,是实验室内部具有法规性质的技术文

件,因此必须重视对SOP的管理。如何进行管理，下面几点可供考虑：①一套SOP的原件由资料档案室保存,分发给有关业务部门或者个人的为复印件,领用SOP者均需签名登记备案保存。②任何个人不得私自复印任何一份SOP,需要复印者应该经负责人批准，由档案室工作人员复印分发并登记备案。3：QAU保存一套SOP的复印件，其他人只能保存与自己工作有关的SOP。④废弃不用的SOP,除档案室保存一份存档之外,由档案室按分发登记名单收回，统一烧毁,并登记备案。任何人不得保存或者复印废弃不用的SOP,防止造成操作行为方面的混乱,影响安全性研究的质量。⑤SOP应放在方便使用的地方,让工作人员进行实际操作时随手可得,使其真正发挥作用。6：SOP经批准生效后就成为操作行为的规范，必须严格遵守，不得偏离或者随意修改。但在安全性试验工作的运行管理中，如发现某份SOP有不当的地方，或者在科学合理性或者可操作性方面存在一些问题需要修改时，可由原撰写人或者由负责人指定熟悉业务的人，在原SOP上撰写出修改的词句和内容，可不变更原来的页号，新增的页号用原页号后加一横，横后为新增页号表示，如2-1和3-1，分别表示在原第2页后增加1页和在原第3页后增加1页，并将修改新增的页号登记在编辑规定的地方。如果SOP的内容结构修改太多,不便在原SOP上进行修改时,则该份SOP可废弃处理[7]。

6、SOP的修订

以便保证SOP的时效性,避免技术在前、记述在后的脱节，从而导致违反SOP操作的现象，随着工作内容的变化和实验技术、方法的发展，需要及时修改SOP的内容,同时准确记录修订方式、修订理由、修订内容、修订人信息、修订的记录、修订后的批准以及修订后再版

SOP的分发等信息,经QAU负责人审核、机构负责人批准后分发修订后的再版SOP,再版SOP 生效之日起旧版SOP即失效,应保留旧版SOP的原件存档,其余均销毁[8]。

7、SOP的执行

SOP在执行上具有强制性，实验室的SOP,是非临床研究常规试验工作必须遵循的技术

文件，是GLP实验室内部具有法规性质的文件，没有任何随意性。因为在安全性试验的全过程中，许多技术环节、各种不同业务的联系、各种书面文书的撰写格式、各种仪器设备的操作细节等等，每个人都可以有习惯性的做法，甚至同一个人在不同的情况下对同种操作也会不同，而SOP只能选择其中比较科学合理而又简便易行的制定，把目的相同的多种操作规范为一种操作行为，这对习惯了其他形式操作的人来说，就带有一定的强制性；另一方面，要使SOP能在安全性试验中得到正确的贯彻执行，靠的是工作人员的自觉性，没有自觉性，就不可能建成真正的GLP实验室。

二、长期毒性试验SOP

1、目的：

观察连续重复给予受试物对动物所产生的毒性反应，首先出现的症状和严重程度，毒副反应的靶器官及其恢复和发展情况。确定无毒反应剂量，为拟定人用安全剂量提供参考[9]。

2、动物和材料：

2.1动物

一类新药首选Beagle犬和猴类，应写明供应单位。根据试验周期的长短，一般选择性成熟青年动物为受试动物。二、三、四类新药要求放松一些，但要根据实际情况选择合适的实验动物例如大鼠[10]。

实验前大动物应检测心电，并做血液学和血液生化学分析，指标在正常范围内的动物，方可作为受试动物。

小动物分组方式通常采用随机分组，雌雄各半。大动物通常每组动物4-6只，雌（无孕）雄各半，随机分组。

2.2 动物的质量控制

选用标准化的实验动物，从有生产许可证单位购进健康合格动物，观察适应一周，剔除体质过弱者和体重过大或过小者。饲养在有使用许可证单位提供的标准化实验设施内，保障设施的正常运转，提供实验动物所需要的舒适环境条件和足够的全价平衡营养，自由采食和饮水，每周更换两次垫料，保证实验动物的质量。对动物实验屏障设施进行制度化、规范化、素质化管理，是确保动物实验顺利进行的重要保证。

2.3 受试物和实验室

3、试验方法

3.1 剂量和分组

3.1.1 一般设2-3个剂量组，一类新药应设三个剂量组和一个对照组。剂量一般用g（或mg）/kg或单位/kg表示。低剂量组略高于临床试验人用日最高剂量或按体表面积折算的动物药效学有效剂量。低剂量组不应出现毒性反应。高剂量组原则上应产生明显或严重的毒性反应或个别动物死亡。在高、低两个剂量之间按等比关系再设置一个中剂量[11]。

3.1.2 对照组不给受试物仅给等容量的溶媒或赋形剂。如这些成分可能有毒性时，应另设一组对照组。

限度试验：如果经小鼠急性毒性口服给药剂量大于5g/kg或注射给药剂量大于2g/kg 仍不出现毒性反应和死亡或仅个别动物有毒性反应时，可考虑只作一个高于临床拟用剂量50倍的剂量。

3.2 给药途径与方法

3.2.1 给药应与临床用药途径一致。

3.2.2 口服药途径每天于喂食前定时给予。若将受试物混在饲料、水中给予，每动物应分笼饲养，并采取严格有效措施，以保证每只动物按量在一定时限内服完。

3.2.3 经静脉、肌肉或皮下途径，其注射部位可于四肢或臀部等处交替进行。

3.2.4 受试物最好是每周7天连续给予，如试验周期在90天以上，可考虑每周给药6天，每天定时给药。每周可根据体重情况调整给药量，按等容量不等浓度配制药物。

4、试验周期

4.1 长毒试验的给药时间为临床试验用药期的二-三倍，最长半年。

4.2 三、四类新药均符合法定标准；可先做大鼠长期毒性试验。如无明显毒性反应可免做大

动物如Beagle犬与猴类等的长期毒性试验。

5、检查项目

5.1一般观察：如行为活动、恶心呕吐、流涎、粪便及体重变化情况等。

5.2检测项目：

5.2.1 心电检查（必要时做）：

5.2.2血液学指标：红细胞或网织红细胞计数、血红蛋白、白细胞计数及其分类、血小板计数、凝血时间。

5.2.3血液生化学：天门冬氨酸氨基转换酶（AST）、丙氨酸氨基转换酶（ALT）、碱性磷酸酶

（ALP）、肌酐（Crea）、尿素氮（BUN）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（GLU）、总胆红素（T-BIL）、总胆固醇（T-CHO）[12]。

5.2.4系统尸解和病理组织学检查

5.2.4.1 系统尸解：应全面细致，发现异常器官应重点进行病理组织学检查。

5.2.4.2 脏器称重和脏器系数：剖解后取出心、肝、脾、肺肾、肾上腺、甲状腺、睾丸、卵巢、子宫、脑、前列腺。

5.2.4.3病理组织学检查：高剂量组对照组动物及尸检发现异常器官检查要详细。其它剂量可取材保存。在高剂量组发现有异常病变时才进行检查。检查内容：

一类新药：心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、垂体、前列腺、胸腺、脑、胃、睾丸（连附睾）、卵巢、子宫、十二指肠、回肠、结肠、胰腺、膀胱、淋巴结、脊髓、胸骨（骨和骨髓）、视神经。

其它各类新药：心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、前列腺、胸腺、胃、睾丸（连附睾）、卵巢、子宫和可能的靶器官[13]。

5.2.5大体尸解和病理组织学检查：

对脏器进行全面肉眼尸检，常规对心、肝、脾、肺、肾五个实质脏器称重、计算脏器系数[14]。

6.可逆性观察

最后一次给药后4小时，每组活杀部分动物（2/3-1/2），检测各项指标，余下动物停药，继续观察2-4周。如24小时后的病理学检查发现有异常变化，应将余下动物活杀剖检，重点观察毒性反应器官，以了解毒性反应的可逆程度和可能出现的迟缓性毒性。

7.指标观察时间

一般状况和症状的观察，每天观察一次。每周记录饲料消耗和体重一次。

试验周期在三各月以内的，一般在给药前进行一次全面的检查，包括心电图、血液学、血液生化学等各项指标。在给药周期结束后和可逆性观察结束后再分别进行上述各项指标的检测。并活杀动物做大体尸解和病理组织学检查[15]。试验周期在三各月以上的，可在给药中期再进行1-2次心电图、血液学、血液生化学检查。对有异常的指标可酌情增加测定次数，但抽血量和频度以不影响动物健康为度。对濒死或死亡动物应及时检查。

主要参考文献：

[1] 关于GLP建设的软硬件要求.

[2] 药物非临床研究质量管理规范[S]. 国家食品药品监督管理局令，2003.

[3] 孟建华,谢寅,王秀文,李波. GLP实验室SOP的控制与管理[J].中国药

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[4] 李兴,陈吉生,关向东,杨泽民.吴红卫药物临床试验机构SOP的建立、管理及其意义

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[5] 王爱平. GLP实验室标准操作规程的制定[J]. 中国卫生质量管理，1995,8(4):81-83.

[6] 李培忠.GLP实验室标准操作规程的制定和管理[J]. 中国新药杂志,2003，

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[7] 于文莲.陈会明.宋乃宁.程艳.周新.王立峰良好实验室规范(GLP)与实验室认证

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[12] 张海会,骆建立.安神宝浸膏长期毒性试验研究[J]. 中国医药指南,

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[15] 林壮民,贾冬等. 抗EB病毒口服液对Beagle犬的长期毒性研究[J]. 中药材, 2006,

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