慢性毒性试验测定
化学品：慢性毒性试验方法
化学品：慢性毒性试验方法
一、实验目的
本实验旨在评估化学品的慢性毒性，以评价其对人类健康的潜在毒性风险。
二、实验原理
该实验采用长期暴露实验，检测化学品对实验动物的慢性毒性。
实验动物每日接受低剂量的化学品，持续90天甚至更长时间，以评估其对实验动物的毒性影响。
三、实验材料
1. 化学品：根据实验需要，需要准备足量的实验化学品。
2. 实验动物：根据实验需要，准备足量的实验动物。
3. 实验设备：实验所需的设备包括：动物箱、口服滴管、洗涤设备、体重计、血液分析仪等。
四、实验过程
1. 动物准备：实验动物需经过一定的适应期，确保其身体健康，以确保实验的准确性。
2. 分组：将实验动物分为若干组，每组动物数量一致，并将其随机分配到每组。
3. 暴露：每日给实验动物给予一定量的化学品，持续90天或更长时间，以评估其对实验动物的慢性毒性。
4. 评估：实验结束后，对实验动物进行体重检测、血液分析、病理检查等，以评估其对化学品的慢性毒性。
兽药慢性毒性和致癌试验指导原则
兽药慢性毒性和致癌试验指导原则一、概述（一）定义与目的慢性毒性和致癌试验是预测药物在临床应用中诱发癌症危险性的评价方法。
在动物的大部分生命期间，经过反复给予受试药物后观察其呈现的慢性毒性作用及其剂量－反应关系，尤其是进行性和不可逆毒性作用及肿瘤疾患。
确定受试药物的无作用剂量(NOEL)，作为最终评定受试药物能否应用于动物尤其是食品动物的依据。
为了确保慢性毒性和致癌试验结果的真实性、可靠性和可追溯性，根据新兽药研究的规律，结合国内兽药毒理学评价的实际情况制定了本指导原则。
（二）适用范围本指导原则适用于评价兽用化学药品、中兽药、消毒剂及饲料药物添加剂对动物的慢性毒性和/或致癌性的测定。
长期毒性试验发现有可疑肿瘤发生，某些器官组织细胞异常、药物结果与已知致癌物有关或代谢物与已知致癌物有关、作用机制为细胞毒类等情况下，要求进行致癌试验。
二、试验设计（一）材料与方法1.实验动物（1）实验动物种类选择一般要求选用两个种属的实验动物，即啮齿类和非啮齿类，目前已掌握大白鼠和小白鼠各品系的特点及诱发肿瘤的敏感性，故可优先将其用于慢性毒性和致癌试验。
对活性不明的受试药物，则应选用两种性别的啮齿类和非啮齿类动物。
（2）动物的起始周龄和体重慢性毒性试验期长，故一般用刚断乳的大鼠或小鼠。
大鼠50～70g（出生3～4周），小鼠10～15g（出生3周）。
动物个体体重的变动范围不超出各性别平均体重的20%。
（3）动物的性别和数量每个剂量组的动物数应满足试验结束时进行统计学处理的要求，如大鼠40～60只（小鼠数应据此适当增加），一般雌雄各半，雌鼠应为非经产鼠、非孕鼠。
如果将慢性毒性试验与致癌试验结合进行，每组雌雄动物数均应在50只以上。
如计划在试验过程中定期剖杀动物，则动物数应相应增加。
（4）肿瘤自发率实验动物的自然肿瘤发生率原则是控制到越低越好，但试验结果评价时主要是以在相同条件下观察对照组与各剂量组的肿瘤发生率及其剂量-反应关系作为判定依据。
短期、亚慢性、慢性毒性评价
接触天数
1～4 5～8 … 25～28
每天接触剂量LD50 0.1 4天接触剂量LD50 0.4 累计接触剂量LD50 0.4
0.15 … 1.12
0.6 … 4.48
1
… 12.74
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③剂量固定的20天蓄积法
通常采用经口灌胃染毒方式，将动物随机分成五组，包
括阴性对照组和1/20LD50，1/10LD50，1/5LD50，1/2LD50四 个剂量组，每组动物数10只。每日染毒一次，连续染毒20 天。观察每组雌雄合计动物数。
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2.物质蓄积(material accumulation): 机体多次地接触 化学毒物一定时间之后，用化学分析方法能够测出 机体内存在该物质或其代谢产物时，称为物质蓄积。
3.功能蓄积(functional accumulatio): 机体多次地接触 化学毒物一定时间之后，虽不能测出该物质或其代 谢产物，但机体有慢性中毒的症状出现，这种情况 称为功能蓄积。
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forward
毒效应谱
对外源化学物的负荷增加
意义不明的生理和生化改变
亚临床改变
临床中毒
死亡
损害效应
Hale Waihona Puke 癌 致突变 致畸fallback
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(三)亚慢性毒性试验方法要点
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1. 实验动物选择： ①物种和品系: 啮齿类 大鼠、小鼠、家兔 两个动物种属 非啮齿类 犬、猴子
评价：均无死亡
蓄积性不明显
仅1/2LD50有死亡 仅1/20LD50无死亡 均有死亡，且有剂量反应关系
弱蓄积性 中度蓄积 强蓄积
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亚慢性和慢性毒性作用
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一、亚慢性毒作用
盐酸普鲁卡因半数致死量_LD50的测定
启动微机，运行BL-410程序，进入其数据处理选项， 再进入半数有效量选项。
一次输入各组剂量、动物总数、动物死亡数等相关 数据。
单击“计算”按钮，计算LD50等参数。
【注意事项】
给药剂量准确 小鼠腹腔注射 脱臼处死实验用过小鼠
【思考题】
1.测定LD50有何药理意义？
2.为何选择测定LD50作为衡量药物 毒性大小的指标?
C母 D 等容注射量
药液配制的具体步骤：
预试中Dm=344mg/kg， Dn=141mg/kg，算出r=1.25，小鼠的平均体 重为20g，每组10只，用药量为0.1ml/10g=10ml/kg
C母
D 等容注射量
C1=344mg/kg / 10ml/kg=34.4mg/ml
每组药液量=每组动物总重×用药量=200g×0.1ml/10g=2ml
【实验材料】
实验动物：小白鼠，体重18～２２g，♀♂各半，
实验前禁食12h,不禁水。
实验器材：计算机（BL-410机能实验系统）、电 子秤、注射器、小鼠笼。
实验药品：盐酸普鲁卡因 （Procaine hydrochloride）
【实验步骤】
预备实验
1．探索剂量范围：根据经验或文献，通过实验找出100%死亡的最小剂
(3)申报新药过程中必须提供的药理学资料
盐酸普鲁卡因产生毒性作用的原理:
盐酸普鲁卡因是一种局部麻醉药，当被大量吸收后会产
生全身性毒性反应，主要表现为枢神经系统先兴奋后抑
制，初期表现为眩晕、烦躁不安、肌肉震颤，进而发展为
神经错乱、惊厥、昏迷、呼吸抑制等。患者可因呼吸衰竭 而死亡。
急性毒性、蓄积毒性、亚慢性毒性、亚急性毒性、慢性毒性资料区分
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易混知识
毒性概念区分 蓄积性毒性(资料不要求，但注意区分)
蓄积性毒性：当化学毒物反复多次(未有时间要求)给动物(实验或靶动物)染毒，化学 毒物进入机体的速度（或总量）超过代谢转化和排泄的速度（或总量）时，化学毒物或 其代谢物在机体内逐渐增加并贮留的现象为化学毒物的蓄积作用。 蓄积作用是发生亚慢性、慢性毒作用的物质基础。 试验目的：求出外源化学毒物的蓄积系数K，了解蓄积毒性的强弱，并为慢性毒性试 验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。 评价方式： 1.蓄积系数法（accumulation coefficient）以蓄积系数K为指标，一般认为K值越小，蓄 积毒性越大(参考《蓄积系数分级标准》表) 2.生物半减期法（biological half-life, t1/2）,根据得到的蓄积极限值可以推断产生中毒的 大概时间。
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易混知识
兽药易混知识点 2.毒性概念区分 (临床资料22号-26号)
毒性：指外源化学物质在一定剂量、一定接触时间和一定接触方式下，对 动物机体产生的总体毒效应的能力，又称作一般毒性作用。 毒性分类 1.一般毒性根据外源化学物质剂量大小和时间长短分为：急性毒性、蓄积 毒性、亚慢性毒性、亚急性毒性、慢性毒性等。 442公告中中兽药要求的23号资料要求长期毒性试验（化药为亚慢性毒 性），长期毒性即包括：亚慢性毒性和慢性毒性试验！ 2.相对特殊毒性根据观察目标不同可分为：遗传毒性、生殖发育毒性、致 癌性、免疫毒性、神经毒性和神经行为毒性等。
急慢性毒性试验及其评价
2、剂量和分组
给药剂量：未见毒性量严重毒性量 设空白和/或溶媒（辅料）对照 小动物4-6个剂量组, 组距0.65-0.85,求LD50 大动物可用50%等量递升法,不必达到致死量
近似致死剂量（approximate lethal dose， ALD ） 最大耐受量（maximal tolerance dose，MTD ） 最大无毒性作用剂量(no observed adverse effect level, NOAEL)
我国农药蓄积毒性分级标准
Kcum
蓄积性强度
<1 1≤Kcum <3 3≤Kcum <5 Kcum ≥ 5
高度蓄积性 明显蓄积性 中等蓄积性 轻度蓄积性
生物半减期法
生物半减期(biological half time, T1/2)： 指进入机体的外源化学物通过机体的生物转
运和生物转化过程而被消除一半所需要的时间。
五、 急性毒性的主要指标
1.绝对致死量(absalute lethal dose, LD100) 是指引起一群个体全部死亡的最小剂量。
2.半数致死量(median lethal dose, LD50) 指引起一群个体50%死亡所需的剂量。 以mg/kg表示，LD50 数值越↓，化合物的毒性越↑
3.半数致死浓度(median lethal concentration , LC50) 指引起一群个体50%死亡所需的浓度。 以mg/m3-气体， mg/L-液体表示
(四)染毒途径
模拟人群实际接触途径 和预期进行的慢性毒性试验途径一致
(五) 剂量选择与分组
• 设3~4个受试剂量组和1个对照组
高剂量组：不发生死亡或仅有个别动物死亡， 但有明显的中毒效应或者靶器官 出现明显的中毒效应。
综合慢性毒性致癌性试验
十七、慢性毒性/致癌性结合试验Combined Chronic Toxicity / Carcinogenicity Test1 范围本规范规定了动物慢性毒性/致癌性结合试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于化妆品原料的慢性毒性和致癌性的检测。
2 规范性引用文件GB 14924 实验动物与饲料标准OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No.453,Adopted:12 May 1981)3 定义3.1 慢性毒性（chronic toxicity）动物在正常生命期的大部分时间内接触受试物所引起的不良反应.3.2 最大无有害作用剂量(maximal no-adverse effect level)在一定时间内，受试物按一定方式与机体接触，用现代的检测方法或灵敏的观察指标，未能观察到任何损害作用的最高剂量。
3.3 慢性有害作用阈剂量（chronic adverse effect threshed level）在一定时间内，受试物按一定方式与机体接触，用现代的检测方法或灵敏的观察指标，能够使机体在某项敏感观察指标发生异常所需的最小剂量，即使机体出现毒性反应的最低剂量。
3.4 化学致癌物（chemical carcinogen）能引起肿瘤，或使肿瘤发生率增加的化学物。
4 原理化学物质在体内的蓄积作用，是发生慢性中毒的基础。
慢性毒性试验是使动物长期地以一定方式接触受试物引起的毒性反应的试验。
当某种化学物质经短期筛选试验证明具有潜在致癌性，或其化学结构与某种已知致癌剂十分相近时，而此化学物质有一定实际应用价值时，就需用致癌性试验进一步验证。
动物致癌性试验为人体长期接触该物质是否引起肿瘤的可能性提供资料。
5 试验的基本原则在实验动物的大部分生命期间将受试化学物质以一定方式染毒，观察动物的中毒表现，并进行生化指标、血液学指标、病理组织学等检查，以阐明此化学物质的慢性毒性。
亚慢性和慢性毒理实验
❖ ②动物的饲料消耗
❖ 记录动物的饲料消耗，并计算食物利用率(实验动 物每食入100克饲料所增长的体重克数)。
❖ 比较各染毒组与对照组实验动物的食物利用率， 有助于分析受试物对实验动物的生物学效应。
❖ 急性毒性试验和慢性毒性试验分别代表了人一次 染毒和长期反复染毒这两种暴露特征的毒性试验 方法。
❖ 慢性毒性试验耗费大量的人力、物力和时间，亚 急性、亚慢性毒性试验就具有预备或筛选试验的 性质。
慢性毒性实验
❖ 由于人体接触外源化学物往往是长期、反复接触， 利用急性毒性试验的资料难以预测慢性毒性。
❖ Weil等(1969)报告，112种受试物中，大鼠染毒90d 后才出现毒性效应的只有3种(占2.5％)，其他受试 物均在90d内已出现毒性效应，故认为大鼠90d毒 性试验即可确定受试物的未观察到有害作用水平 (NOAEL)。
❖ 尽管还有争论，亚慢性毒性试验(90d亚慢性试验) 已成为比较常用的重复染毒毒性试验；从科学上 和经济上考虑，慢性毒性试验就倾向于和致癌试 验合并进行。
❖ 当外源化学物在亚急性、亚慢性毒性试验中有严 重的毒作用时，此受试物就应考虑放弃，只有在 必要时才进行慢性毒性试验。
❖ Parkinson等(1995)报告117种药品狗亚慢性(90d) 和慢性(24月)毒性试验结果与大鼠(短期或长期毒 性试验)的结果比较，几乎没有发现新的毒性资料。 因此，Parkinson等认为，动物毒性试验长于6个 月没有必要，除非是研究致癌作用。
❖ 在慢性毒性研究中，工业毒理学要求每天吸入4～ 6h，环境毒理学一般要求每天吸入8h。
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慢性毒性试验测定
1 目的
检测受试物长期染毒对实验动物所产生的毒性作用，确定其最小观察到有害作用剂量，最大未观察到有害作用剂量及毒性作用的靶器官。
2 实验动物
试验选用刚离乳的大鼠。
在试验结束时，每个剂量组每种性别的动物应不少于10只。
中间需活杀动物检查时，需相应增加实验动物数量。
3 试验分组
将实验动物随机分在3个剂量组和1个阴性对照组。
阴性对照组除不接触消毒剂外，其它与实验组相同，若在试验中对受试物使用溶剂或赋形剂时，阴性对照组应给予相应剂量的溶剂或赋形剂。
试验剂量根据亚慢性试验结果选择。
高剂量应引起明显的毒性效应甚至个别动物死亡，低剂量应不引起毒性效应。
4 操作程序
（1)用灌胃法或将受试物掺入饲料或饮水中喂饲。
掺入饲料的受试消毒剂的最高浓度一般不超过5%。
饲料中受试消毒剂应定期监测，观察其均匀性和稳定性。
（2）灌胃法每天给药一次。
（3）前3个月每周称量体重，3个月后每月称1次体重，调整受试物灌胃量。
如受试物掺入饲料，应定期称饲料消耗量。
如受试物溶于饮水中喂饲，需记录动物的饮水量。
（4)试验期限为一般为6个月，必要时可延长至2 年。
5 观察指标
指标与亚慢性毒性试验基本相同，也可根据受试物对实验动物的亚慢性毒性作用和靶器官，可适当增加或更换一些针对性更强更灵敏的观察指标。
（1）临床观察：观察中毒表现，体重前3个月每周1次，以后每月1次。
（2）血液学检查：于试验的第3个月、6个月及以后每半年进行1次血液学检查。
（3）血液生化检查：检查时间同血液学检查。
（4）病理学检查：
系统解剖：所有实验动物包括试验过程中死亡的动物都应进行完整的系统解剖和详尽的肉眼观察。
肉眼可见的异常组织都应留样作进一步组织病理学检查。
脏器重量：称取脑、肝、肾、肾上腺和睾丸重量并计算脏器系数。
组织学检查：对照组、高剂量组动物及系统解剖发现异常的组织均需作详尽的组织学检查。
当高剂量组有异常发现时，其它剂量组才进行相应检查。
检查脏器一般包括脑、心、肺、肝、脾、肾、胃、肠、肾上腺、甲状腺、垂体、睾丸（卵巢）和子宫等。
6 评价规定
比较各剂量组与对照组观察指标的变化。
计算分析其剂量-反应关系，并确定受试物最小观察到有害剂量和最大未观察到有害作用剂量，及毒性作用靶器官。