乳鼠海马神经元细胞元代培养及AD损伤模型制备
细胞损伤模型
一、体外肝细胞损伤模型建立(CCｌ4与H2O2)ﻫ 1 大鼠肝细胞得分离与培养大鼠4％戊巴比妥麻醉,门静脉插管,先以无钙灌流液灌流,继以3７℃通入Ｏ２得Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。
将肝脏移至一平皿内,轻轻撕去肝包膜后,加入含5％小牛血清得清洗液,用吸管吹打成单个肝细胞悬液,２00目尼龙网过滤,低速离心(５0０r·miｎ-1,1 mｉｎ,4℃)弃上清,同法用清洗液反复洗3次、然后用完全1640培养液(内含10％小牛血清,10５U·L－1青霉素,1０0 mg·L—1链霉素与10 mg·L-1胰岛素)制成１×109个·L-１肝细胞悬液、分离得肝细胞经0、6%台盼蓝拒染法测得细胞活力大于９0％,高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定9９％为肝实质细胞。
将上述肝细胞悬液分别加入２４孔(每孔１mｌ)与96孔(每孔０。
１ml)培养板中,置３７℃,5%CO2培养箱中培养。
１2～１6 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长、ﻫ2 CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型得建立肝细胞培养12 h后,吸弃上清,更换培养液并加入不同浓度得ＣＣl4〔(1～1６mｍｏｌ·Ｌ-1),以少量得二甲亚砜助溶,二甲亚砜终浓度为0、1％(体积分数)〕,作用不同时间(1～12h)后,收集２4孔板中培养上清检测AST,以及肝细胞得MDA含量与ＧSHpｘ活性;同步测定96孔板中培养肝细胞得MTT反应。
根据检测结果制备CＣｌ4诱导肝细胞损伤得量效与时效曲线、选择最造损伤浓度与损伤时间制备肝细胞得损伤模型,同时设溶媒对照组,每组至少设３个复孔、３H2O2诱导肝细胞坏死性损伤模型得建立同法更换培养液,加入不同浓度得H２O2(０.２～３。
2 ｍmol·Ｌ—１),作用不同时间(0、5～4 h)后,收集24孔板中培养上清检测AＬT,测定肝细胞得MDA含量;同步测定９６孔板中培养肝细胞得MTT反应。
老年痴呆症(AD)小鼠模型的建立及中药金银花治疗效果的实验研究
能力降低；中药复方制剂通过排铝、提高抗氧化能力治疗后对老年痴呆症有明显疗效。
关键词：铝；老年痴呆症；乙酰胆碱酯酶；抗氧化能力
一、 引言
老年痴呆症（ ＡＤ） ，又称阿尔茨海默病，是一组病因未明
ｍｉｎｕｍ Ａｌ ３＋ ｉｎ ｍｉｃｅ （ ｘ±ｓ）
组别
谷丙转氨酶（ Ｕ ／ Ｌ）
脑铝 Ａｌ ３＋（ ｎｇ ／ ｍＬ）
正常组
４０．５８±２１．８２
１０９．００±２７．３３ ★★
５８．０６±２２．１１
模型组
治１组
１３．７０±２．３１
４４７．００±３７６．４３
６０．３３±１６．５０
治２组
１８５．７１±３１．５５
小鼠取脑，称脑重量，制成脑匀浆，离心取上清，分别测定脑中乙酰胆碱酯酶（ ＡｃｈＥ） 、超氧阴离子自由基（ ） 清除率、谷胱甘肽
等含量。 结果：正常组、模型组、治疗 １ 组、治疗 ２ 组依次为，脑乙酰胆碱酯酶（ ＡｃｈＥ） 活力：０．６０±０．０９、０．５５±０．１０、０．６７±０．１２、０．７８
±０．１４（ Ｕ ／ ｍｇ．ｐｒｏｔ ） ，Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１ 差异有统计学意义；模型组明显降低；超氧阴离子自由基（ ） 清除率％ ：２１．４５±６．０１、７．９６±
综 述
按试剂盒说明书；清除率测定利用比色法。 铝含量，用电极
法测定；丙二醛测定，硫代巴比妥酸（ ＴＢＡ） 反应比色测定其
含量，因此又称（ ＴＢＡ） 法。 具体操作按试剂盒说明书。
（ 三） 统计学处理
·１７４·
阿尔茨海默症动物模型
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------阿尔茨海默症动物模型动物模型阿尔茨海默病模型大鼠的构建1/ 32背景阿尔茨海默病（Alzheimer’S disease ， AD ）是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。
主要表现为进行性认知功能障碍、记忆力减退、运动行为失常和人格改变等；其主要组织病理学特征是神经元胞外出现β?淀粉样蛋白（Aβ ）聚集形成的神经炎性斑［NPs，亦称老年斑（SPs）］、胞内tau蛋白异常磷酸化形成的神经原纤维缠结（NFTs）、神经元凋亡或缺失、突触缺失等。
随着我国近年来人口老龄化越来越严峻，AD发病率显著提高，在阿尔茨海默病相关研究中，建立理想的动物模型颇受关注，这有利于促进阿尔茨海默病病因、发病机制、病理过程，以及寻找和筛选预防与治疗药物等研究的深入。
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ AD动物模型研究进展目录CATALOGAD动物模型学习评价AD模型大鼠的研究方案3/ 3201AD动物模型研究进展---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 实验动物的选择许多动物都可以成为模拟阿尔茨海默病病理学特征的模型，包括鼠、猫、犬、兔、山羊、绵羊、北极熊和非人类灵长类动物等。
细胞损伤模型
细胞损伤模型一、体外肝细胞损伤模型建立（CCl4和H2O2）1大鼠肝细胞的分离和培养大鼠4％戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。
将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去肝包膜后，加入含5％小牛血清的清洗液，用吸管吹打成单个肝细胞悬液，200目尼龙网过滤，低速离心（500 r·min-1，1 min，4℃）弃上清，同法用清洗液反复洗3次。
然后用完全1640培养液（内含10％小牛血清，105 U·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素和10 mg·L-1胰岛素）制成1×109个·L-1肝细胞悬液。
分离的肝细胞经0.6％台盼蓝拒染法测得细胞活力大于90％，高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定99％为肝实质细胞。
将上述肝细胞悬液分别加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。
12～16 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长。
2CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立肝细胞培养12 h后，吸弃上清，更换培养液并加入不同浓度的CCl4〔（1～16 mmol·L-1），以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为0.1％（体积分数）〕，作用不同时间（1～12 h）后，收集24孔板中培养上清检测AST，以及肝细胞的MDA含量和GSHpx活性；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。
根据检测结果制备CCl4诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线。
选择最造损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设3个复孔。
3H2O2诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立同法更换培养液，加入不同浓度的H2O2（0.2～3.2 mmol·L-1），作用不同时间（0.5～4 h）后，收集24孔板中培养上清检测ALT，测定肝细胞的MDA含量；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。
神经胶质细胞的原代培养
星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养
1、取新生24h内的C57BL/6J乳鼠，在超净工作台中用75％乙醇浸泡3～5min消毒，断头，无菌条件下用眼科剪小心剪开头骨，取两侧大脑，体视镜下剥除脑膜，取出大脑皮质置于盛有HBSS液的无菌培养皿内。
2、用预冷的HBSS液漂洗2次，剪碎大脑皮质制成糜状，以0.25％的胰酶液，1:4与不完全培养基混合，37℃消化15min，并用含有10％胎牛血清的DMEM/F12-K完全培养基终止消化，轻轻吹打。
3、800g离心5min，弃上清。
4、用DMEM／F12完全培养基制成单细胞悬液，以70目滤网过滤，吸取细胞悬液接种至预先已包被多聚赖氨酸的细胞培养瓶内，置37℃、5％CO2培养箱中培养。
0.5h后将培养基移至已包被多聚赖氨酸的细胞培养瓶内继续培养。
5、24h后轻柔换液。
以后每隔2～3d换一次培养液，且每次换液前用HBSS 液剧烈振荡洗涤2次，并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。
6、7至8天后，当星形胶质细胞汇合并且覆盖的小胶质细胞暴露在星形胶质细胞层上或已经与星形胶质细胞层分离时，在轨道摇床上以180rpm摇动T25烧瓶120分钟以分离收集小胶质细胞。
加入新鲜的细胞培养基，并在240rpm下16小时继续摇动烧瓶以除去少突胶质细胞前体细胞（OPC）。
7、胰酶消化后的细胞移至培养皿中传代，培养2d后可用免疫荧光的方法进行细胞鉴定。
原代海马神经元细胞培养
原代海马神经元细胞培养-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1原代海马神经元细胞培养溶液的配制：(1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤，室温保存。
(2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO412H2O，1.7g；KCl，0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。
用0.2m滤膜过滤，4℃保存。
(3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液冻存。
使用时，用解剖液稀释至0.25%。
(4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。
将上述多聚赖氨酸放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。
(5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP047H20，0.18g；KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。
(6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。
(7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。
(8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg ml-1的母液储存。
用0.2m 滤膜过滤，-20℃储存。
使用时，取6l母液加入2ml培养液中，终浓度为3g ml-1。
（根据实验情况调整浓度）大鼠原代海马神经元细胞的培养(1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解剖液的培养皿中。
(2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。
在分离出全部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。
胰酶稀释法提取乳鼠原代海马神经元
胰酶稀释法提取乳鼠原代海马神经元康杨婷;王丽琨;伍国锋【摘要】Objective:To optimize the method for isolating primary hippocampal neurons from newborn mice.Methods:In SD rats newborn within 24 hours of birth, bilateral hippocampus tissues were isolated and digested with 0.25％ trypsin and undiluted trypsin (0.125％) to obtain two types of cell suspension, respectively.Cells were cultured.On day 7 of culture, cells were immunofluorescently stained for detecting neuron-specific enolase (NSE) to identify the number and purity ofneurons.Results:The isolated hippocampal neurons using 0.125％ trypsin had obvious structural features and could form a typical neural cell network.Moreover, over 90％ of hippocampal neurons were positive for NSE.Conclusion:Isolated primary hippocampal neurons using 0.125％trypsin had higher purity than using 0.25％ trypsin and grew well under proper culture condition.%目的:优化SD乳鼠海马神经元的提取方法.方法:选用出生24 h内的SD乳鼠, 分离双侧海马组织, 分别用胰蛋白酶稀释法和未稀释法消化后获得细胞悬液;培养细胞, 在培养第7天采用神经元特异性烯醇化酶 (NSE) 免疫荧光染色鉴定神经元数量及纯度.结果:胰酶稀释组提取得到的海马神经元结构特征明显, 能形成典型的神经细胞网络, 90％以上海马神经细胞呈NSE阳性.结论:用稀释胰蛋白酶消化海马组织并配合特定培养条件可获得生长状态良好、纯度高的原代海马神经细胞.【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2019(044)001【总页数】5页(P59-63)【关键词】胰酶;稀释技术;神经元,海马;细胞培养;鉴定【作者】康杨婷;王丽琨;伍国锋【作者单位】贵州医科大学, 贵州贵阳 550004;贵州医科大学附院急诊神经科, 贵州贵阳 550004;贵州医科大学附院急诊神经科, 贵州贵阳 550004【正文语种】中文【中图分类】R-33;R741海马区域在学习、记忆、认知等高级神经功能活动中有着至关重要的作用[1-5]，疾病累及海马组织常可导致癫痫、阿尔茨海默病等相关疾病。
阿尔茨海默症动物模型
代
是目前最广泛用于制备阿尔茨海默病模型的动物。
国内外 AD 动物模型研究进展
01
以衰老为基础的
AD模型
自然衰老的动物模型 快速老化小鼠模型
02
各种因素诱发 的AD模型
化学损伤 物理损伤 饮食诱导
03
转基因AD模型
APP 转基因模型
PS1 转基因模型
tau 相关模型 多重转基因模型
以衰老为基础的AD模型
AD 是一个与年龄密切相关的疾病，衰老因素在AD 发病过程中起着重要作用。以衰老为 AD 发病基础的动物模型成
为实验研究中不可或缺的部分
自然衰老AD模型
自然衰老动物模型脑内神经元萎缩，胆碱能功能低下，同时表现为感觉、运动以及 学习记忆力等多种功能的减退，这符合 AD 患者的临床表现。 造模方法：将1~2月龄小鼠或3~5月龄大鼠，雌性或雄性，饲养在屏障环境的动物
转基因AD模型
转基因模型是研究 AD 发病机制及相关药物研发的较理想工具，同时也成为了近年研究的热点。
神经元纤维缠结、tau 相关模型
AD 患者大脑皮质及海马区出现NFT的主要原因是tau蛋白的过度磷酸化。因此认为tau基因突变
将直接影响tau蛋白的结构和功能，引发神经系统疾病，可能是诱发 AD 的因素之一。 JNPL3 小 鼠 是将人 类 FTDP-17 突 变 tau 基 因导 入 B6D2 （ F1 ） 小 鼠，然 后 将其 下 一代小 鼠 与 C57BL/6回交而获得。
化学损伤致 AD 模型
东莨菪碱诱导的模型
乙酰胆碱（ acetylcholine ，ACh ）是一种重要的中枢神经递质，在学习、记忆方面起 着非常重要的作用。AD患者基底前脑胆碱能神经元大量损伤或死亡、突触前乙酰胆碱的 合成、Ch AT的活性及对胆碱的摄取能力都明显下降。这些变化的程度与患者认知功能损 害的程度呈正相关。
原代海马及皮质神经元培养方法
原代海马及皮质神经元培养方法海马和皮质神经元是神经系统的重要组成部分，在研究神经生物学和药物疗效等方面具有重要价值。
为了研究这些神经元的生理特性和功能，我们常常需要从动物体内分离和培养这些神经元。
以下是针对原代海马和皮质神经元的培养方法。
1.实验动物准备：首先，需要准备实验所需的动物。
一般情况下，小鼠是最常用的实验动物。
在实验进行前，需要确保动物符合实验伦理和动物保护要求，并获得相应的实验动物使用许可。
2.动物脑组织的获取：在实验动物处死后，需要尽快取出脑组织。
使用无菌技术将大脑取出，并将其放入生理盐水或培养基中。
3.脑组织的分离和消化：将脑组织放入含有0.02％的溴酚红的磷酸缓冲生理盐水中，用无菌剪刀和镊子将其剪碎成小块。
然后，将组织块放入含有0.25％胰酶的溶液中，在37℃的恒温培养箱中消化2至5分钟。
然后，将溶液过滤并离心，以去除细胞碎片和大块组织。
4.细胞的分离和培养：将离心沉淀涂布在含有25％培养基和10％胎牛血清的培养皿中，然后放入37℃的恒温培养箱中。
培养基的成分可以根据具体需要进行调整。
细胞会附着在培养皿上，并开始生长和繁殖。
在细胞培养过程中，需要定期更换培养基，以提供细胞所需的营养物质。
5.细胞的处理和分选：在培养4至7天后，细胞会形成较为密集的神经元网络。
在这个时候，可以通过处理和分选细胞来提高神经元的纯度。
例如，使用抗体标记法可以针对神经元选择性地杀死胶质细胞。
此外，还可以使用细胞遗传方法，如转染特定基因或使用荧光探针标记细胞。
6.测试和分析：经过特定时间的培养后，可以对原代海马和皮质神经元进行测试和分析。
这些测试和分析可以包括细胞生存率、纯度、形态特征、电生理活性、细胞内信号和细胞功能等方面的内容。
这些测试和分析的方法可以通过显微镜观察、电生理仪器、蛋白质和基因分析等手段进行。
7.特殊处理：有时对于特定的研究需要，还可以对原代海马和皮质神经元进行特殊处理。
例如，可以通过给予特定药物、激素或其他刺激条件，来模拟不同的疾病模型或研究特定功能。
高糖诱导HT-22小鼠海马神经元代谢记忆细胞模型的构建及影响
细胞与分子生物学高糖诱导HT-22小鼠海马神经元代谢记忆细胞模型的构建及影响段云峰1，2，许永劼1，3，杨婷婷1，2，黄昶煜东1，朱丽英2，3，李兴4，潘卫1，2△摘要：目的体外构建高糖诱导HT-22小鼠海马神经元“代谢记忆”细胞模型，探究“代谢记忆”对HT-22细胞凋亡和组蛋白乙酰化的影响。
方法以高糖培养基（葡萄糖浓度为55mmol/L）和常规糖培养基（葡萄糖浓度为25mmol/L）培养HT-22细胞，分为常糖组（NG4、6、8组，25mmol/L葡萄糖分别培养4、6、8d），高糖组（HG4、6、8组，高糖培养4、6、8d），代谢记忆组（HG2NG2、HG2NG4、HG2NG6、HG4NG2、HG4NG4组，即高糖2d转25mmol/L葡萄糖培养2、4或6d，高糖4d转25mmol/L葡萄糖培养2d或4d）。
CCK-8法检测细胞活力变化，检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶（LDH）释放量，筛选出建立“代谢记忆”模型的最佳作用时间。
后续将细胞分为NG4组、NG8组、HG4组、HG4NG4组和HG8组，光学显微镜观察各组细胞形态；流式细胞术检测各组细胞凋亡率；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测去乙酰化酶（HDAC）和组蛋白乙酰转移酶（HAT）活性；Western blot检测组蛋白去乙酰化酶4（HDAC4）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）和胱天蛋白酶3（Caspase-3）蛋白表达情况。
结果HG4NG4组为理想的高糖“代谢记忆”细胞模型；NG4、NG8组细胞交织成致密网状，生长状态良好，细胞呈梭形，突触结构明显。
而HG4、8组细胞胞体变圆，突触结构消失，生长受抑，HG4NG4组细胞数量增多但形态受损；流式细胞术结果显示，与NG8组相比，HG8、HG4NG4组凋亡率增加（P＜0.05）；ELISA结果表明，与NG8组相比，HG8组及HG4NG4组HAT和HDAC的水平均增高（P＜0.05），与HG8组相比，HG4NG4组HAT和HDAC差异无统计学意义；Western blot结果显示，与NG8组相比，HG8组、HG4NG4组HDAC4、Bax和Caspase-3蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达水平降低（P＜0.05），与HG8组相比，HG4NG4组蛋白表达差异无统计学意义。
乳鼠海马神经细胞的原代培养以及冻存复苏方法
【 中图分类号１ ６ ３ Ｒ３ １．
【 文献标识码Ｉ 【 ９２０）４ ０ ０－ ３
的海 马较胎 鼠好 定位 ， 易取 材 ， 多 采用乳 鼠海 马作为 故
海 马神 经元作为边缘 系统 的重要组 成部分 ， 在结构
上具有高 度序化 板层结 构和神 经元相对 独立分布 等特 点， 因而成为理 想的神经 科学研 究模型…。 鼠类出生时的
１． 统 计 分析 采 用 Ｓ Ｓ ｌ ． 统 计 软 件 ， 凇 验 进 ３ Ｐ Ｓ １０ 以 行统 计处 理 。
接 受训练的身体 部位在皮层 的支配 区域 也会扩大 。 传导 兴奋 的神 经 回路的传递 效 率明显 提高 ， 反之 ， 意运动 随 训练 减少 ， 动功能恢 复的可能性 降低…。 运 因此 ， 复训 康 练 有利于新的神经 回路和正 常运动程序 的建立 。 也就 是 说， 采取积 极的 康复护 理 ， 可促 进相关 神经 细胞 的轴突 发芽 ， 成新的突触 ， 形 通过 反复训练 ， 使这些突触建立起 接近 正常功 能的新 的神 经网络 ， 实现 中枢神 经功能重新 组合， 同时抑 制异 常的 低位 中枢 控 制的运 动 ， 其突 触 使 链处 于受抑 制的多阂值状 态 ， 而改善患侧肢体 的功能 从 】 对 急性 脑血 管病病人 的康 复有积极 的意义 。 但对于还 没有度过脑血管病 急性期 （ 发病 １ 约 周内． ） 的病人 康复护理应 十分慎重 ， 因为处在 急性 期 的脑血 管 壁脆 性高 ， 发病 部位 尚未形 成牢 固而稳 定 的血栓栓 塞 ， 盲 目的超早 康复护 理可 能引起 梗死 后再 灌 损 伤及 出 血 后 的再 出血 等。
实验研 究对 象＿。 ２ 出生 １ ２ 的大鼠数量很难掌握 ， 】 －ｄ 做实验 时有时得到 的细胞会 多于计划量 有时会少于计 划量 ， 这
浅谈运用中医药治疗先兆流产的临床体会
主药，临证应结合 肾之 阴阳偏盛 ，选加温 肾或滋 阴之 品 “ 肾旺 自能荫胎 也” 。防治之法 以固肾为本 。正如赵养葵所论述：“ 或
问 白术、黄芩 ，安胎 之圣药，此二味，恐胎前必不可缺乎 ？日： 未必然也。胎茎之系于脾 ，犹盅之系于梁 也。若栋柱不 固，栋
情绪常易紧张不安。尤其 前有 坠胎 史， 多年艰嗣 ， 或 思子心切，
一
旦受孕而见，难免忧心仲仲，以致寝食不安 ，情绪 绪不宁。“ 心为五脏六 腑之大主 ” ，悲哀 忧愁则心动 ，动则五脏 六腑 皆摇 。七情所伤可致胎动不安甚至胎坠，古人对此早有训
梁必扰 。所 以安胎先 固两肾 ，使肾中和暖，始脾有生气 ，何必 定以白术、黄 芩为安胎 耶。凡腹 中有热 ，胎不安 ，固用凉药 。 腹中有寒 ，胎亦不安 ，必用温药 ，此常法也 。殊不知两 肾中，
其 水火之源 ，冲任之根 ，胎元之所系甚要 ，非 白术 、黄芩之所 安也 。如 肾中无水 ，胎不安 ，用六味地黄壮水 。肾中无火 ，用
诫 。胎儿在母 限之中，全赖母之 真气 ，情志失调 ，脏腑不安 ，
气血难 以顺和，始必 失所养 。当代医家夏桂成【 为 “ ２ 】 认 心得降 ，
肾得实 ，精得 定，子宫得固藏 ” ，注重在宁心的前提下补 肾，
通常做海马神经 元原带培养 ，采用胎 鼠细胞是最佳来源 ， 但 代价 比较 昂贵，取材 比较繁琐 困难 。大 鼠繁殖周期 比较短 ，
实验中，我们采取 １ ～２天 的乳 鼠来培养 ，这样 既保存 了母 鼠， 还 可以扩大海马组织 来源 ，同时较胎 鼠而言 ，乳 鼠体积较大 ， 可 采取 断颈 处死 的方法 ，取海 马、剥离筋膜组织容易操作 。
ｏ ｔ ｅ ｌ ｅ ａｕ ｅ ｆ ｈ ｔ ｒ ｔｒ ． ｉ
原代细胞分离培养鉴定4(SD 大鼠骨骼肌卫星细胞、海马神经元细胞)
骨骼肌
由骨胳肌细胞构成的一种肌组
b
织，是横纹肌的一种。大多数
骨胳肌都附着于骨上，是体内
数量最多的组织，在人体中占
体重的40%。
a
骨骼肌卫星细胞
肌卫星细胞指的是骨骼肌中除骨骼肌纤维（肌细胞）外的一种扁平、有突起的细 胞。是位于肌肉纤维膜和基底膜之间的一种单核细胞，是动物出生后的骨骼肌的生长 和再生的主要细胞来源。
IF：细胞核内 MAP2阳性表达（红色荧光）
MAP2在中枢神经系统神经元细胞体和树突特异 性表达，而在AS（星形胶质细胞）及少突胶质细 胞中不表达，是目前公认的神经元特异性标志物。
13
14
早期卫星细胞（分化据-SMA（Red） 均在胞浆中表14达，有强有弱。
8、SD大鼠海马神经元细胞的分离
目的与意义
神经元细胞原代培养是体外研究神经系统疾病的重要手段之一，也是对神经 系统损伤进行细胞分子水平研究的基础。因此，建立良好的神经元细胞体外培养 模型，对研究神经系统疾病，特别是在神经元发育、损伤和修复中的作用尤为重 要。海马是大脑边缘系统的重要组成部分，参与个体学习、记忆及情绪反应等多 种生理功能，与新生儿缺血性脑损伤及多种神经、精神疾病的发生密切相关。
快收缩肌的3-4倍）；
3、采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶二步消化法，卫星细胞位于肌束的浆膜和基底膜之间这种特殊位置使其能抵抗一般
消化酶的作用，Ⅰ型胶原酶只能消化肌束之间的连接，起到分离肌束的作用，而不能分离肌束上的卫星细胞，只有胰蛋白 酶才有此能力；
4、消化时间不宜过长，应控制在30min内，可以提高细胞存活率与贴壁率。采用胰蛋白酶分步消化 法，多次消化，及时收集消化下来的细胞，既可以保证肌组织的充分消化，又可以避免蛋白酶对 已消化下来的细胞的进一步损伤，以提高卫星细胞的活性；
丹参酸B抗体外培养的海马神经元OGD损伤的作用机制研究
倒 置 相 差 显 微 镜 观察 细 胞 形 态 ， Ｍ １ Ｔ ｒ 法 测定 细 胞 活 力 ：采 用 黄 嘌 呤 氧 化 酶法 测 量 Ｓ Ｏ Ｄ活 性 和 硫 代 巴 比 妥 酸
比色 法 （ Ｔ Ｂ Ａ） 测 定 ＭＤ Ａ 含量 。结 果 Ｏ Ｇ Ｄ模 型 组 中 Ｓ Ｏ Ｄ活 性 下 降 ， ＭＤ Ａ 含量 增 加 ； 丹 酚 酸 Ｂ组 能 提 高 Ｓ Ｏ Ｄ
ｍｏ ｄ ｔ ｈ ｅ Ｓ ａ ｌ Ｂ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｃ ｔ ｓ ｎ ｅ ｕ ｒ ｏ ｎ ｓ ｉ ｎ ｒ ａ ｔ ｓ ．Ｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ：Ｐ ｒ ｉ ｍａ ｒ ｙ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｄ ｈ ｉ ｐ ｐ ｏ ｃ ａ ｍｐ ａ ｌ ｎ ｅ ｕ ｒ ｏ ｎ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ
活性 与 降 低 ＭＤ Ａ含量 ， 且 中剂 量 组 疗 效 最 佳 。 结 论 丹 酚 酸 Ｂ在抗 自由基 损 伤 方 面 对 缺 血 缺 氧 再 灌 注 损伤
的海 马 神 经元 具 有 保 护 作 用
细胞损伤模型
一、体外肝细胞损伤模型建立（CCl4和H2O2）1大鼠肝细胞的分离和培养大鼠4％戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。
将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去肝包膜后，加入含5％小牛血清的清洗液，用吸管吹打成单个肝细胞悬液，200目尼龙网过滤，低速离心（500 r·min-1，1 min，4℃）弃上清，同法用清洗液反复洗3次。
然后用完全1640培养液（内含10％小牛血清，105U·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素和10 mg·L-1胰岛素）制成1×109个·L-1肝细胞悬液。
分离的肝细胞经0.6％台盼蓝拒染法测得细胞活力大于90％，高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定99％为肝实质细胞。
将上述肝细胞悬液分别加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。
12～16 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长。
2CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立肝细胞培养12 h后，吸弃上清，更换培养液并加入不同浓度的CCl4〔（1～16mmol·L-1），以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为0.1％（体积分数）〕，作用不同时间（1～12 h）后，收集24孔板中培养上清检测AST，以及肝细胞的MDA含量和GSHpx活性；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT 反应。
根据检测结果制备CCl4诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线。
选择最造损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设3个复孔。
3H2O2诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立同法更换培养液，加入不同浓度的H2O2（0.2～3.2 mmol·L-1），作用不同时间（0.5～4 h）后，收集24孔板中培养上清检测ALT，测定肝细胞的MDA含量；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。
唐氏综合征小鼠海马神经元电镜观察
唐氏综合征小鼠海马神经元电镜观察史烨;王秋伟;虞斌;邢宝玲;张玢;孔静【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2014(24)15【摘要】目的研究唐氏综合征(DS)小鼠海马神经元凋亡情况.方法建立DS小鼠模型,于小鼠16～18周取海马组织;同时取材正常小鼠作为对照组,应用透射电镜观察海马神经元细胞凋亡情况.结果与对照组小鼠相比,DS小鼠神经元细胞出现不同程度的凋亡改变,细胞体积缩小、染色质固缩或浓聚成块状位于核周边、细胞核皱缩、细胞萎缩.结论 DS小鼠模型海马神经元的凋亡可能与唐氏综合征患者神经退行性病变有关.【总页数】3页(P48-50)【作者】史烨;王秋伟;虞斌;邢宝玲;张玢;孔静【作者单位】常州市妇幼保健院生殖健康实验室,江苏常州212003;常州市妇幼保健院生殖健康实验室,江苏常州212003;常州市妇幼保健院生殖健康实验室,江苏常州212003;常州市妇幼保健院生殖健康实验室,江苏常州212003;常州市妇幼保健院生殖健康实验室,江苏常州212003;常州市妇幼保健院生殖健康实验室,江苏常州212003【正文语种】中文【中图分类】R714.5【相关文献】1.体外培养乳鼠海马神经元的扫描电镜观察 [J], 王增贤;王怀经;李振中;王怀星;王越2.人参皂甙降低老龄大鼠海马CA3区神经元酸性磷酸酶活性的光、电镜观察 [J], 赖红;吕永利;包峰;刘子娟3.前体蛋白N端11肽对糖尿病小鼠脑海马神经元神经生长因子、神经元纤维蛋白及早老蛋白1表达的影响 [J], 杨芳;姬志娟;王蓬文;赵志炜;盛树力4.迟发性神经元损伤的实验研究：沙土鼠脑海马区电镜观察 [J], 欧阳一冰;刘多三5.唐氏综合征细胞黏附分子在APP转基因小鼠海马中的表达变化及其意义 [J], 贾永林;张保华;付志新;贾延劼因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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-94- Clinical Journal of Chinese Medicine 2011 V ol.(3) No.19家尤昭玲[3]治疗先兆流产时亦主张补肾健脾宁心，宁心之品多选用苎麻根、莲子心。
苎麻根甘咸入心，能布散其光明，而不为郁热，此安胎良药也。
莲子心味甘涩，性平，入心、脾、肾经，具有补脾益肾、养心安神的功效，还能收敛浮躁的心火，让人宁静且容易入睡。
正如《女科集略》云：“受妊之后，宜令镇静，则血气安和。
”又如《竹林寺女科秘要》所云：“胎气宜清不宜热，宜静不宜动。
”先贤所论安胎诸法，悉从其亲身实践总结而来，然如景岳所说：“胎气不安，证本非一，治亦不同。
……去其所病，便是安胎之法。
”同时又指出：“安胎之方不可执，当随证、随经、因其病而药之，乃为至善。
”参考文献：[1]盛爱华,黄爱武.健脾补肾法配合黄体酮治疗先兆流产80例[J].浙江中医杂志,2007,42( 11):644[2]夏桂成.中医妇科理论与实践[M].北京:人民卫生出版社,2003:308-312[3]付灵梅,尤昭玲,陈宗光.补肾健脾宁心方治疗脾肾亏虚型先兆流产30 例中国实验方剂学杂志[J].2011,17(2):232~234作者简介：冯光荣（1979-），女，河南郑州人，郑州市妇幼保健院副主任中医师，博士，主要研究方向不孕症的治疗。
编号：EA-11071239（修回：2011-10-11）乳鼠海马神经元细胞元代培养及AD损伤模型制备 Hippocampus neurons primary cultured and the AD cell model established姜海英杨进刘涛（南京中医药大学基础医学院，江苏南京，210029）中图分类号：R574.62文献标识码：A 文章编号：1674-7860（2011）19-0094-02【摘要】采用乳鼠海马做神经元细胞的原代培养和鉴定，并利用Аβ25-3损伤处理细胞，制备ＡＤ损伤细胞模型，为后继研究中药脑脊液和血清对神经元保护试验的奠定前期基础。
【关键词】乳鼠海马；神经元细胞；AD损伤模型；【Abstract】Using the hippocampus neurons of the new born mice within 2～3 days to do the primary cell culture and do the appraisal . Using Аβ25-35 (aging treateded , final concentration 5μmol/L) on primary cultured hippocampus neurons to establish the AD cell model in order to study the protection of chinese medicine。
【Keywords】Rat hippocampus; Neurons cell; The AD cell model通常做海马神经元原带培养，采用胎鼠细胞是最佳来源，但代价比较昂贵，取材比较繁琐困难。
大鼠繁殖周期比较短，实验中，我们采取1～2天的乳鼠来培养，这样既保存了母鼠，还可以扩大海马组织来源，同时较胎鼠而言，乳鼠体积较大，可采取断颈处死的方法，取海马、剥离筋膜组织容易操作。
1 实验材料和仪器Aβ25-35，B27、neurons培养基、胰蛋白酶（Sigama），12%胎牛血清（杭州四季青生物制品有限公司），NSE试剂盒、SW-CJ-2FD型超净工作台、CO2细胞培养箱、倒置相差显微镜。
2 细胞培养和鉴定2.1 细胞培养收获乳鼠后，置于75%的酒精中清洗，去除身上的垫料杂质，注意避免乳鼠呛到酒精。
用酒精棉球反复擦拭后，至于灭菌的脱脂棉中，于无菌操作台中备用。
同时注意保温，避免乳鼠产生过多的应激反应。
酒精棉球反复擦洗，无菌操作台断颈处死乳鼠。
揭开脑壳，剥离脑膜，露出完整的脑组织。
这对于完整分离海马很关键，海马的形状很容易分辨，取出海马组织，至于冷生理盐水中。
全部材料取出后，在生理盐水中，小心用灭菌的吸管和镊子分离海马无关组织。
反复沉淀清洗，仔细去除血管、筋膜及非海马结构（取材干净非常关键）。
多次沉淀清洗的过程中，可以将渗入的血细胞和其他杂质细胞去除掉。
然后置于0.125%的胰酶中消化，用弯头吸管边消化边吹打，吹打动作要轻柔。
夏天可以在室外操作，消化时间大约20～30min（冬季至于37℃培养箱内消化25min）。
由于脑组织细胞结构疏松，很容易将组织细胞吹散。
在此过程中，用吸管将悬浮的筋膜组织去除干净，加入含血清的全培养液终止消化。
200目的尼龙筛，剪成3～5m2见方的正方形，在高温灭菌前，折叠成漏斗状，置于5ml或10ml离心管中。
每只试管中可以放置多个。
尼龙膜在高温灭菌的过程中，形状被固定，在过滤的过程中，由于组织粘附滤膜，会堵塞网口，导致过滤失败。
该方法操作简单，有粘附组织存在时，用单陪冲洗，关键可以随时更换，经济实用。
用三层尼龙网过滤时，既可以有效去除细胞和组织团块，避免其对细胞贴壁的影响，同时可以有效地降低污染。
将细胞用尼龙网滤过之后，1000转/min离心10min，用含10%血清的高糖DMEM全陪吹散细胞。
计数细胞密度，接种密度在2×106。
经验值为5～6只乳鼠可以接种一块6孔板。
在细胞接种前，6孔板中置放涂布10%无菌多氨酸的盖玻片，紫外照射。
因为不贴壁的细胞数量较多，因而细胞至于培养箱中后，CJCM 中医临床研究 2011年第3卷第19期-95-隔6～8h镜下观察贴壁情况，轻轻晃动培养液（动作一定要轻柔），让不贴壁细胞离开，增加细胞贴壁率。
24小时候后，换液。
用单陪轻柔的清洗一次，目的是去除不贴壁细胞。
然后加入含有2% B27的神经细胞培养液继续培养。
每隔二到三天半定量换一次含2% B27的Neuronal培养基。
大约六到七天左右，可以看到神经元细胞胞体丰满，轴突舒展，神经细胞形态非常明显，可以用来实验操作。
2.2 海马神经元鉴定NSE免疫细胞化学染色尼氏体染色结果提示，培养出海马神经元细胞纯度较高，生长状态良好的。
见图1。
海马神经元细胞烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染色尼氏体染色图1 海马神经元细胞细胞及鉴定3 讨论这种方法组织来源上，取材方便，1～3内的新生鼠可以集中处理。
实验中需注意在海马分离过程中，对组织的选取要严格，原因在于海马神经元细胞与其他脑组织神经元细胞形态是相同的。
组织一定要反复清洗干净，避免血细胞和其他组织细胞的量过多。
消化结束后用200目尼龙膜过滤去除残余组织和细胞团块，可以避免接种时，细胞量达不到所需的要求或者由于其他细胞含量高，影响神经元细胞的贴壁。
尼龙网制备操作简单，实用，可以有效提高制备的细胞质量。
细胞培养6～8h 左右，轻轻晃动培养板，使未贴附细胞离开，可以增加海马神经元细胞的贴壁率，这一点非常关键。
含有B27的培养液，基本可以抑制胶质细胞的增值。
3.1 Аβ诱导的海马神经元细胞损伤的建立3.1.1 海马神经元细胞损伤模型的建立将海马神经元细胞分为2组：空白对照组、模型对照组，37℃孵育2h。
模型组加入经老化处理的Aβ25-35（终浓度为5μmol/L），空白组加入等量的培养液，继续孵育24h，建立Аβ诱导的海马神经元细胞损伤模型。
3.1.2 MTT检测检测海马神经元细胞存活情况96孔培养板，每组设置12平行样本，取均值。
收获细胞4h前，每孔加入20μlMTT，收获细胞后弃培养液，加入150μlDMSO，振荡8min，待紫色晶体充分溶解后，酶标仪检测个空吸光值，空白孔调零，波长570 nm。
3.1.3 讨论Aβ25-35 水溶性特别差，为了避免造模不均的影响，我们采用用DMSO溶解。
同时发现低浓度的DMSO对神经细胞的生长没有明显的影响。
我们采用10mol/L Aβ25-35造模，结果发现Aβ25-35 能在短时间内引发海马神经元细胞的快速凋亡，添加Aβ25～35 4h 左右，就可以看到神经细胞树突收缩，有细胞脱落的现象出现，12h后，贴壁细胞量已经不能满足试验要求，因而本实验中采用终浓度5μmol/L。
MTT结果显示，模型组海马神经元的平均光密度与空白组相比较有非常显著性差异（P<0.01），说明模型组海马神经元的数量和存活情况显著低于空白组。
结果见表1在海马神经细胞形态改变方面，空白组细胞胞体丰满，呈锥形或梭形，折光率好。
突触长伸展，彼此交织呈网状。
模型组加淀粉样蛋白4h后，胞体皱缩，体积变小，细胞突触回缩，甚至消失。
结果见下图2。
表1 MTT法检测海马神经元细胞存活情况（sx±）（平均光密度）n 平均光密度空白组12 0.775±0.086**DMSO组13 0.669±0.057+模型组13 0.301±0.054注：*：与模型组比较；**：P<0.01空白组DMSO组模型组图2 海马神经细胞形态改变中药方剂成分复杂，但对于老年性疾病的康复具有西药无可比拟的优势。
研究中药方剂对脑神经细胞损伤的保护和修复作用机制，海马神经元细胞是一个不错的选择，而老年痴呆的主要损伤机制是大脑中淀粉样蛋白，因而我们采用Аβ25-35处理原代培养海马神经元细胞来制备AD模型，为后期利用中药脑脊液和血清研究中药方剂对海马神经元细胞损伤模型的形态结构以及基因表达调控机制的影响。
参考文献：[1]周君,陈勤.神经细胞尼氏体染色方法改良[J].生物学杂志,Journal of Biolo -gy,2010,5:94-95作者简介：刘涛，通讯作者。
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30672694），江苏省教育厅自然科学基金资助项目（06KJD360145）。
编号：E-11100940（修回：2011-10-09）。