海马细胞培养与鉴定

3、分装：胰酶：1ml、D-hanks:100ml、青霉素：500ul、链霉素：500ul、胎牛血清：10ml、
DMEM：90ml、B27：40ul、Neurobasal：1.6ml
4、玻璃器皿：移液管，培养皿，24孔板内的玻璃片，泡酸过夜，自来水清洗10遍，一蒸10遍，三蒸3遍，烤干，高压，再烤干
GAP-43的荧光显色结果：阳性反应物呈明亮的绿色荧光，反应物主要分布在胞体和粗大的轴突，树突无染色，胶质细胞无染色。染色显示培养一周左右的海马神经元胞体饱满，呈椭圆形，轴突粗大发达。
MAP2荧光显色结果：阳性反应物呈绿色银光，反应物分布于神经元的胞体和树突，轴突及胶质细胞均不染色。染色显示培养7、8天的海马神经元树突发达，相互交错，形成极发达的神经纤维网络。
5.去除DAB染色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应。
6.对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后，如有必要可以用中性红染色液(neutral red staining solution)染色，以便于观察。对于膜，显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。
常见问题：
1.背景显色太深。
a.在免疫组化时如果背景显色太深，一方面需考虑使用适当的封闭液进行封闭，例如选购适当的封闭液
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0.01mol/LPBS液中洗15 m in;（5min×3次）
正常山羊血清(体积比为1:100)中孵育3 h,以消除非特异性染色;
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甩掉山羊血清（不清洗）,加一抗，4度过夜或37度温箱1-2小时
↓
0.01 mo l/LPBS液中洗15m in;（5min×3次）
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加二抗，孵育2 h;或37度30min
2.按照如下比例依次加入各溶液，混匀后即配制成DAB染色工作液：
DAB显色液A
0.5ml
5ml
DAB显色液B
0.5ml
5ml
DAB染色工作液
1ml
10ml
3.最后一次洗涤完毕后，去除洗涤液，加入适量DAB染色工作液，确保能充分覆盖样品。
4.室温避光孵育3-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅。
少量0.15M PH7.4的PBS中。
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(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用
萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保
存。
过碘酸盐氧化法操作步骤：
1、称取5mgHRP溶解于0.5ml蒸馏水当中
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2、向溶液中加入0.5ml新配的0.1m的Nalo4溶液，混匀，4°C静置30min
MAP2：MAP2是一种细胞骨架蛋白，定位于海马神经元的胞体和树突。
方法:辣根过氧化物酶标记SABC法（NSE，1:100），FITC标记免疫荧光法（MAP2，1:100;GAP-43,1:250）。
鉴定标准:
NSE的DAB显色结果：NSE免疫阳性反应物呈棕黄色颗粒，主要分布在神经细胞的胞浆及部分较粗大的突起中，胶质神经细胞不着色，阴性对照细胞未件着色。化学染色显示海马神经细胞形态均匀，体积相似，胞体饱满，呈椭圆形或多边形。
2、从断头处死鼠到胰酶消化前整个过程都要在冰上进行。
3、如果是胎鼠，不要取一个分离一个，而是要快速把所有胎鼠大脑都迅速取出放到预冷的液体中。
4、一定要尽可能的去掉所有的血管和血管膜。
5、吹打动作要轻柔，以免损伤细胞。
6、种板时密度很重要，过密和过稀都会影响细胞生长。
7、种板后需轻摇晃板，切记！不能圈圈摇晃。应左右平行，上下平行摇晃。
2.没有显色或显色太弱。
a.可以考虑适当提高一抗或二抗的浓度。检测二抗效果，滴一滴稀释二抗在膜上，检测二抗是否可以被正常显色。
b.可以考虑使用更加灵敏的放大检测体系，例如使用生物素检测体系。
c.可以适当延长显色时间，另外确定抗原修复是否对于使用的一抗是必需的。
免疫组化反应步骤:
将长有海马和皮层神经细胞的爬片顺序置入以下介质中进行操作:
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0.01 mol/LPBS液中洗15 m in;（5min×3次）
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SABC孵育，湿盒内37度，20min
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0.01 mol/LPBS液中洗15 m in;（5min×3次）
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DAB显色，配法按说明书
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自来水洗5min
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苏木素复染10min
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自来水洗5min
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树胶封片
若长期保存片子，可以对爬片进行脱水处理：70%（1次，1min）,80%(1次，1min),95%(1次，1min),无水乙醇（2*3min）,二甲苯（2*1min）
吸去培养液用PBS液冲洗3遍
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质量分数为4%的多聚甲醛固定15 m in;
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0.01mol/LPBS液中洗15 m in;（5min×3次）
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质量分数为0.4%的Triton X-100湿盒反应40 m in;
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0.01mol/LPBS液中洗15 m in;（5min×3次）
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3%H2O2孵育15min,消除内源性的过氧化物酶
免疫组化反应对照实验：
非特异性对照:用正常羊血清代替兔抗特异性烯醇化酶(NSE)多克隆抗体,其它实验步骤上。
阴性对照:用PBS代替兔抗特异性烯醇化酶( NSE )多克隆抗体,其它实验步骤同上。
纯度计算：高倍镜视野下，随机选取计数视野，计数100个细胞中阳性神经元的数目，重复5次后，计算均值。
3.1海马原代培养操作
准备：
1、取海马：培养皿6个（3对），D-hanks（100ml，提前预冷），75%酒精，眼科镊2把，小剪刀3把，小镊子4把（三个弯头，一个直头），冰袋3个，中号镊一把。
2、细胞室：小dish，多聚赖氨酸（1个EP），纸抽，细胞剪，胰酶（2个EP），DMEM（10%胎牛血清+青霉素+链霉素，提前拿出），离心管2个，24孔板1个，细胞筛2个，废液缸1个, D-hanks
步骤：
1、培养前30min包被多聚赖氨酸置于培养箱中备用；
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2、75%酒精浸泡鼠，断头取脑（1把中镊，1把中剪）
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3、剥离海马（D-hanks液，冰盒，4把小镊）
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4、去血管、被膜（显微镊2把）
↓（进细胞间）
5、吸去多余D-hanks，剪碎，吸入15ml离心管
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6、D-hanks：胰酶=1:1，吹打20次
3.2海马细胞的鉴定：
取培养7-9天的细胞
海马神经细胞特异性抗体：神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白质2（MAP2）、生长相关换蛋白43（GAP-43）
NSE：神经元特异性烯醇化酶，血清NSE是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶
GAP-43：GAP-43是一种膜相关的鳞蛋白，与神经纤维生长的调节有关，主要分布于海马神经元的轴突
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15、弃上清，得沉淀，加DMEM，吹打
↓
16、200目过筛
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17、计数（1×106）
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18、500微升/孔（24孔板）
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19、24孔板放入恒温培养箱中，37℃，5%CO2
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20、第二天换Neurobasal+B27（N:1.6ml，B27:40ul）
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21、隔三天换液
注意事项：1、取海马的操作过程要迅速，提高神经细胞的存活率。
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3、加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml,混匀，静置30min
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4、5mg抗体的水溶液1ml，混匀装入透析袋，pH9.5碳酸盐缓冲液透析，4度过夜。
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5、加0.2ml新配的5mg/mlNaBH4液，混匀，再置4度，2小时。
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6、在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4度1小时
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7、3000r/min离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗两次，最后沉淀物溶于少量0.15mol/LpH7.4的PBS中
或使用和一抗相同来源的血清(10%)进行封闭。另一方面，请注意选购经过适当吸附的二抗，以减小二抗的非特异性吸附。
b.在免疫组化时如果背景显色太深，需注意灭活内源性过氧化氢酶。可以在4体积甲醇中加入1体积3%过氧化氢，混匀后用于内源性过氧化氢酶的灭活。
c.可以考虑缩短显色时间，或降低二抗浓度。另外，选择适当强度的洗涤液，或延长洗涤时间也会有所帮助。
搅拌。
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(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
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(4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。
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(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
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(6)在搅拌ห้องสมุดไป่ตู้逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
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(7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于
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7、15-20 min，37℃，期间5min震荡一次
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8、1:1比例加（DMEM+青链+胎牛血清）终止消化，吹打20次
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9、配平，1000rpm，5min
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10、弃上清，得沉淀
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11、加（DMEM+青链+胎牛血清），吹打20次
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12、100目过筛，
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13、放入15ml离心管，吹打
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14、配平，1000rpm，5min
辣根过氧化物酶标记法：戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法（常用）
戊二醛交联法操作步骤：
（1）称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。
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(2)反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分
钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢
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8、将上述溶液装入透析袋中，对0.15mol/LpH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后（用
萘氏试剂检测），10000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒
产品编号: P0202
产品包装:共20ml
产品价格: 73.00元
使用说明：1.对于组织切片或细胞样品或膜，在与辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。对于检测内源性辣根过氧化物酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。