海马神经细胞培养

实验材料：

1、所有用于细胞培养的器械、器皿剂溶液必须灭菌消毒。

2、多聚赖氨酸铺板以磷酸盐缓冲液(PBS)或蒸馏水荣分解多聚赖氨酸（分子量为30-70KD）至1mg/ml。分装储存。临用前稀释至终浓度为20-60mg/ml过滤备用。在培养板或皿中加少量多聚赖氨酸溶液，以覆盖底部为宜，在37℃、CO2孵箱中过夜。次日，用移液管吸取多聚赖氨酸，并用水洗2-3遍，晾干备用，如果培养目的适用于电生理的单细胞记录或者免疫组化和荧光染色，则在培养皿的底部加上盖玻片，多聚赖氨酸铺于盖玻片上，则更易得到强烈的荧光信号。

3解剖液（HEPES平衡盐溶液）取100ml 10x 平衡盐溶液（Hank’s balance salt solution,HBSS）

HEPES 3.9g,

NaHCO3 0.84g，

青霉素 104 U,

链霉素 100mg，

H2O 800ml。

以1mol/LHCl调节PH至7.2，再加H2O之后总体积为1L，以0.2μm直径的滤菌器过滤，4℃保存。

4、DMEM 培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）DMEM 培养基500ml，加小牛血清和或马血清各10%（血清需经56℃，30min 灭活）1% 的青/链霉素.

5、无血清培养基最常用的一种无血清培养基为，Neurobasal+2%的b27+1%抗生素

6、2.5%胰蛋白酶（typsin）溶液临用前以解剖液稀释至终浓度0.125%。

7、台盼蓝(typan blue )溶液终浓度为0.2%-0.4%。

8、阿糖胞苷终浓度为8-10 μmol/L。

9、动物妊娠天数的选择通常选择出生24h之内的乳鼠。

实验步骤：

1、脱臼处死乳鼠，75%的酒精浸泡3-5min，将清洗完的乳鼠放入含预冷解剖液的培养皿中。

2、用两把尖镊逐个去除鼠的头部皮肤和颅骨，取出全脑，置于另一含预冷解剖液的（PBS？）培养皿中，小心剥离并去除脑膜及脉络丛。

3、在中线处用尖镊分离大脑半球，在解剖显微镜下小心去除嗅球、中隔、丘脑及下丘脑，剥离脑膜及脉络丛，在大脑皮层下方小心取出海马，置于含冰冷解剖液的6cm培养皿中。

4、用弯头尖镊把海马剪成小碎片，收集全部海马碎片，置于一含有0.25%胰蛋白酶溶液的培养皿中（该溶液必须在37℃孵箱中预暖），在孵箱中消化5-7min。

5、收集全部海马碎片，置于10ml预暖的DMEM培养基的试管中（培养基中含有10%的胎牛血清和或马血清各，1%抗生素，以及谷氨酰胺）。最好用培养基洗2-3遍，以中止消化反应。

6、加少量培养基于试管中，以中空塑料管反复吹打10-15次，直成细胞悬液。加培养基于同一试管中至约10ml，静置约10min。取1-2μl细胞悬液于99μl0.2%-0.4%台盼蓝溶液中，用细胞计数板计算存活和死亡的细胞数，从而测定细胞密度(细胞计数：活体细胞具有排斥台盼蓝的能力，而死亡细胞则能吸收台盼蓝变成蓝色)。

7、根据实验需要，以培养基稀释细胞悬液至所需的细胞密度，接种细胞至经多聚赖氨酸铺板过夜处理的培养皿或培养板中。通常细胞密度为（2-2.5）x105细胞/cm2.

8、待6-8h细胞贴壁后，换培养基为含2%B27的Neurobasal，含有B27 和0.5mM的谷氨酰胺。

9、培养2-3d培养基中加入8-10μmol的阿糖胞苷，以抑制或阻止非神经细胞和原代胶质增

殖。

10、每三天用Neuronbasal使用液半量换液

三、形态学观察

细胞接种6-12h，开始贴壁，细胞成圆形或椭圆形，两周后神经元最为丰满，胞体圆形或多角形，四周晕光明显，胞核及核仁清晰可见，位于细胞中央或一边，神经多而粗大，分支成网络。培养一月后，细胞开始退化。一般认为，培养2-4周开始实验比较适宜。

附：

血细胞计数法及台盼蓝测细胞活度

（一）

实验材料和实验前准备

1、显微镜，血细胞计数器，盖玻片

2、毛细移液管，1 ml血清移液管，5ml试管，擦镜纸或软布

3、0.4%的台盼蓝溶液，0.3%苯胺黑（nigrosin）溶液，95%，乙醇

4、用擦镜纸或者软布将血细胞计数板的计数池擦干净。再用酒精95%血细胞技术板和盖玻片，晾干备用。

5、讲清洁干净的盖玻片覆盖于血细胞技术板的计数池上。

6、胞浓度=4大格细胞数/4×稀释倍数×104/m

（二）实验步骤

1、制备制备细胞悬液取一试管，分别加入0.4%台盼蓝溶液0.2ml (或0.3%苯胺黑溶液)及混合均匀的细胞悬液0.8 ml，用手轻柔振荡试管，以混合悬液和染料。

2、以中空移液管轻柔混匀细胞悬液后，立即用毛细移液管吸取少量细胞悬液，置移液管尖头于细胞计数板计数池的边缘（小心不要移动盖玻片），缓缓释放细胞悬液。通常一侧计数池可以容纳20 ul细胞悬液。

3、细胞计数每个正方形的边侧都有三根线，在左侧和上方，应将接触到三根线的中线的内侧线的细胞计算在内，技术两侧计数池，共八个正方形。

四、注意事项

1、L-多聚赖氨酸（0.1mg/ml）包被培养板后，要待其干后才能接种，因为其对神经元有毒性。L-多聚赖氨酸（0.1mg/ml）能回收再利用。

2 、取脑组织时动作尽量要快，并且尽量低温操作。

3 、分离皮层和海马时，要尽量分离脑膜和血管，否则有大量的成纤维细胞。

4 、用吸管轻轻吹打细胞时，尽量不起泡沫，以免损伤神经元。

5 、接种细胞的过程，动作要快，以免细胞聚集。

6 、接种细胞后，24h勿移动，以免影响细胞贴壁。

五、结果、

大多数神经元在接种1h内贴壁，3-5h开始变平，并长出1-2个突起。3天后，许多细胞从胞体长出数个突起。神经元在7-10天开始成熟，胞体逐渐长至30-40um,晕光明显，胞核和核仁清晰可见，突起变粗，变长并且有分支，边缘清楚，发亮，形成明显的神经网络。神经元可存活1-2月