第5节 单倍体植物

➢ ⑶缩短育种年限 在杂交育种中， 应用胚 培养技术可以缩短育种周期1～2年。
2胚培养方法
➢ 离体胚培养包括胚胎发生过程中不同发育 期的胚， 一般可分为成熟胚和幼胚培养。
（1）成熟胚的培养
•材料的消毒与接种
健壮优良的个体自交种或杂交种子，常规消毒灭菌， 剥离胚。
•培养基 大量元素和微量的无机盐为基本成分
思考题
➢1、如何剥离幼胚？ ➢2、为什么幼胚比成熟胚培养要求
的培养基成分复杂？
➢3、胚胎培养技术在育种工作中有 哪些应用？
第5节 单倍体植物培养
1单倍体概念
➢ 单倍体生物是指细胞中仅含配子染色体的个体。 单倍体植物比单倍体动物多见。
➢ 在自然界中偶尔也能见到天然诱发的单倍体植株。 它们通常经以下途径发育而成：
➢ (1)孤雌繁殖途径体植株。植物卵细胞不经受精而 发育成单倍体胚，继而长成单倍
➢ (2)孤雄繁殖途径 精子进入胚囊后不与卵细胞受 精而独自发育成单倍体胚，再发育成株，卵细胞 退化消失。
3花粉及小孢子培养
➢ 3.1花粉培养的基本程序： ➢ 取材时期的确定→外植体(花蕾)预处理→外
植体消毒→花粉或小孢子的分离→接种→ 培养
➢ 3.2取材时期的确定 ➢ 四分体→单核早期→单核晚期→双核早期
→双核晚期→三核期
➢ 预处理有利于改变正常的发育途径，而且 还可以促进花粉植株的形成
➢ 3.3花粉或小孢子的分离:
谷氨酰胺作为氮源，可以促进胚生长
附加成分
植物天然浸提物（YE）促进胚生长 硫氨素促进胚根的伸长
生长素低浓度促进胚的发育（胚根）
赤霉素促进有后熟作用的种子萌发
•培养条件 pH一般为5.2~6.3
12小时光照和25C，热带兰花杂交种胚30 C
（2）原胚(幼胚)的培养
➢ 培养方法
取材：子房 常规表面消毒 在高倍显微镜下 剥离幼胚，接 种于培养基 送入培养室培养
花粉培养
低温预处理
消毒
选幼年树花蕾
预培养数天
取下花蕾（镜检）
接种
分离 花粉
❖药壁向花粉提供营养物质；过滤离心
❖通过药壁吸收、贮存和转 化培养基中的外源物质
取花药 再生
第6节 合子胚培养
1胚培养概述
➢ 定义：植物胚胎培养是胚及胚器官（如子 房、 胚珠）在离体无菌条件下，使胚发育 成幼苗的技术。 包括幼胚培养、成熟胚培 养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养等。
➢ 原胚培养的条件
➢ 未成熟的幼胚，当它在胚囊里生长时， 不仅依赖于周围细胞中的代谢，而且依赖 于周围胚乳消耗的养料。与成熟胚的相对 自养性比较，幼胚则完全是异养的，在离 体情况下，要求更复杂的培养基。除了一 般的无机盐成分外，还要加入微量元素和 各种生长辅助物质。胚龄越小，要求的培 养基成分就越复杂。
➢ 花药→小烧杯(有基本培养基)→挤压花药(注射器 内管) 花粉释放→过滤(尼龙筛)→低速离心（100160r/min)→吸管吸掉碎片→加入新鲜培养基→连 续进行两次过滤，到每毫升含103-104个花粉/mL （即花粉悬浮培养液）
➢ 3.4培养方法
➢ 花药看护培养，花粉悬浮培养（微室培养）
➢ 看护培养法：无菌条件下，将花药接种在固体培 养基上→花药上面盖一层圆形滤纸→吸取1滴每毫 升含10粒花粉粒的悬浮液接种在瓶内滤纸中央→ 形成胚状体→分化为单倍体植株。
➢ 2.2花药培养的基本程序是：
➢ 外植体选择－外植体(花蕾)预处理—外植体消 毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培养
➢ （1）花药材料的选择
➢ 关键选取处于合适发育期的花药，离体培养后才 能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双 核期的花药，均有可能诱导离体孤雄发育。
➢ 大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期 为单核靠边期。
➢ 无机氮：
包括硝酸盐、亚硝酸盐或铵盐；
➢ 渗透压：
蔗糖，8%-10%，不同发育期，渗透压不一样， 初期高（WHY）。因为自然条件下，原胚被 一层高渗液体包围着。
➢ 复杂的天然提取物：
椰乳 CM有促进幼胚生长和分化的作用
➢ 活性炭： 吸附有毒物质
➢有利幼胚培养的因素
胚乳看护培养，利于原胚的生长有明显的促进 作用。 胚柄的存在对于幼胚的存活至关重要： 胚柄促进生长的活性，心形早期活性最高。而 且保留胚柄减少对胚的直接损失。
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➢ （3）消毒接种培养 ➢ 由于花药消毒比较简便，所以应从健壮无病植株中采集花
蕾，因为未开放的花蕾中的花药为花被包裹，本身处于无 菌状态，可仅用70％酒精棉球将花的表面擦洗即可。也可 按对其他器官消毒处理方法进行，先用70％的酒精浸一下 后，在饱和漂白粉溶液中浸10~20min，或用0．1％升汞 液消毒7~lOmin，然后用无菌水洗3~5次。 ➢ （4）培养基的选择 ➢ 基本培养基可用MS、B5、N6等； ➢ ⑸培养条件 ➢ 温度：23－28℃； ➢ 光强：2000～4000ｌｘ；（书上5000~1000LX） ➢ 光照时间：16ｈ左右。 ➢ 花药因子：此外，培养条件是一个值得注意的问题。由于 花药中含有至今成分不明的水溶性“花药因子”，只有当 培养基中的“花药因子”积蓄到一定程度，添加外源激素 才会奏效。
2花药培养
➢ 2.1概念： ➢ 花药培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，
来改变花粉的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化 成胚状体，产生再生植株，或形成愈伤组织，由愈伤组织 再分化成植株。属器官培养还是细胞培养 ？（提问） ➢ 花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作 为外植体进行离体培养的技术。由于花粉已是单倍体细胞， 诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株。 ➢ 优点：不受花药的药隔，药壁、花丝等体细胞的干扰； ➢ 缺点：较花粉培养难度大。属器官培养还是细胞培养 ？ 为何更多的要花药培养?(药壁提供营养) （提问） ➢ 共同的目的：花粉细胞→单倍体(haploid)细胞→单倍体植 株（但不是最终目的但具应用潜力，为什么？）→经染色 体加倍→正常结实二倍体植株。
➢ 培养对象 胚胎发生过程中的不同发育时期 的胚和具胚的器官。如：成熟胚、幼胚、 胚珠培养、子房培养。
➢ 1.1胚胎培养的意义
➢ ⑴克服远缘杂种的不育性 在高等植物的种 间和属间胚败育， 胚发育不全而不能正常 萌发，因而得不到杂种种子，用胚胎培养 和试管受精技术就可以解决这些问题。
➢ ⑵使胚发育不全的植物获得后代 如兰花、 天麻的种子成熟时，胚只有6～7个细胞， 多数胚不能成活。如在种子接近成熟时， 把胚分离出来进行培养，就能生长发育成 正常植物。
➢ （2）外植体(花蕾)预处理：
➢ 花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的。 烟草、茄子 3～5℃ 72小时 水稻 10℃ 10～14天 柑橘 3℃ 5～10天 马铃薯 4℃ 48小时
➢ 低温处理的作用： 可以激发花粉母细胞产生两个相等核:一个营养核一个生 殖核； 保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老； 激发花粉产生原胚； 促使细胞同步分裂。
➢ 1.2单倍体的应用潜力（意义）：
➢ ①迅速获得纯合型材料，缩短育种年限；②获得 育种中间材料；③与诱变育种相结合可以提高诱 变频率；④与细胞融合相结合，使这一育种途径 更具有实际应用意义；⑤作为遗传工程受体更为 有效（当代表达）；⑥用作基础遗传研究的各个 领域
➢ 1.3加倍后的二倍体特点：
➢ 属于真正的纯系。和常规多代自交纯化方法相比， 可节省大量的时间和劳力。
➢ (3)无融合生殖 精卵结合后，不仅受精卵发育， 由于某种原因，助细胞或反足细胞也与受精卵形 成的二倍体胚同步发育成单倍体胚，形成双胚或 多胚种子。
➢ 主要手段：刺激子房单性结实、花药和花粉培养
➢ 1.1单倍体植物三个明显的特点： 体细胞染色体数减半；生长发育弱，体形小、
各器官明显减小；雌雄配子严重败育，有的甚至 不能进入有性世代。