实验十五：酸性磷酸酶的显示
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正常值： 血清2.2～10.5U／L。
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相关检查： 血清酸性磷酸酶、血清酸性磷酸酶 （ACP）。
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相关症状： 口粘腻、黄疸、呼吸异常、紫绀、心悸、 血尿。
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ห้องสมุดไป่ตู้相关疾病：
医学检验·各论 酸性磷酸酶
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别名： 酸性磷酸酶。
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简介： 酸性磷酸酶主要分布于前列腺、肝、
脾、乳汁、红细胞、血小板及骨骼等。以 前列腺含量最为丰富。
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临床意义：
增高：前列腺癌，特别是有转移时， 血清酸性磷酸酶可明显增高。变形性骨髓 炎、原发性骨肿瘤、甲状腺功能亢进、白 血病、乳腺癌、心肌梗死、肝炎、肝硬化、 胆囊炎、溶血性疾病、急性尿潴留时可增 高。此外，前列腺活检。膀胱镜检查、直 肠检查等也可使酸性磷酸酶活性增高。
乳腺癌、老年人前列腺癌、前列腺癌、甲 状腺功能亢进症、心肌梗死、急性心肌梗 死、骨肿瘤、甲型病毒性肝炎、乙型病毒 性肝炎。
谢谢！
实验八、巨噬细胞酸性磷酸酶显示资料讲解
作业
1、比较对照标本与正常处理标本结果的不同 2、比较吞噬活性强的大体积巨噬细胞和吞噬活
性弱的小体积巨噬细胞酸性磷酸酶的分布与活 性
蒸馏水
0．2mol／L醋酸缓冲液(pH4．6)
5％硝酸铅 3.2％β—甘油磷酸钠
90ml
12ml
2ml 4ml
配法：先将蒸馏水和醋酸缓冲液混合，随后分成大致相等的两份， 一份中加硝酸铅溶液，另一份加甘油磷酸钠溶液，然后再将两者 缓缓混合，边混边搅匀。 若pH不到5．0，可加少量醋酸的调整。 注意：配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀； 最好在临用 前配制，不能贮存。
附：0．2mol／L醋酸缓冲液（pH4．6）配制方法
0.2mol/l醋酸（ml） 25.5
0.2mol/l醋酸钠（ml）24.5
4、1％硫化铵溶液 硫化胺 1ml 蒸馏水 9ml
5、姬姆萨染液（1：30）
姬姆萨原液
3滴
磷酸盐缓冲液（pH6．8） 5ml
实验方法
1、巨噬细胞诱导：实验前2天开始，每日向小鼠腹腔注射6 ％淀粉肉汤1ml，连续注射3天。
酶的显示法是通过显示酶的活性来表明酶的存 在，而不是酶的本身。
将具有酶活性的组织放人含有一定底物的溶液 中孵育，底物经酶的作用形成初级反应产物， 它再与某种捕捉剂相反应，形成显微镜下可视 性沉淀，即最终反应产物。
4．核酸显示法
显示DNA的传统方法为Feulgen反应。
切片DNA经弱酸(1mol/LHcl)水解, 其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的 键打开,使脱氧核糖的一端形成游 离的醛基,这些醛基在原位与 Schiff试剂(无色品红亚硫酸钠溶 液)反应,形成紫红色的化合物,使 细胞内含有DNA的部位呈紫红色 阳性反应.紫红色的产生,是由于反 应产物的分子内含有醌基,醌基是 发色团,因此具有颜色.
《酸性磷酸酶的》课件
基因克隆与表达
基因克隆
通过分子生物学技术，从生物体中提取酸性磷酸酶基因的全 长或部分序列，并在实验室中进行复制。
基因表达
将克隆的酸性磷酸酶基因转染至适当的细胞或生物体中，使 其表达产生相应的蛋白质。
基因突变与功能研究
基因突变
研究酸性磷酸酶基因突变对其功能的 影响，包括酶活性、底物特异性等方 面的变化。
功能研究
通过体外实验和体内实验，深入了解 酸性磷酸酶在生物体内的生理功能和 作用机制。
基因治疗与药物研发
基因治疗
利用酸性磷酸酶基因或其相关分子进行治疗，以纠正或补偿某些遗传性疾病或病理状态 。
药物研发
基于酸性磷酸酶的特性，开发具有治疗作用的新型药物，用于癌症、感染性疾病等的治 疗。
06 酸性磷酸酶的未来研究方 向与展望
低副作用。
抑制剂的优化
02
对已有抑制剂进行结构优化，以提高其选择性、稳定性和口服
生物利用度。
抑制剂的作用机制研究
03
深入探讨酸性磷酸酶抑制剂的作用机制，为进一步的药物设计
和优化提供理论支持。
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感谢您的观看
药效学特性
抑制剂对酸性磷酸酶的抑制作用具有选择性，对其他酶的影响较小。抑制剂的作 用强度与抑制常数（Ki）成反比，Ki越小，抑制作用越强。
药代动力学特性
抑制剂在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程受多种因素影响。药物的生物利用 度、半衰期、血药浓度等药代动力学参数对药物的疗效和安全性具有重要影响。
05 酸性磷酸酶的基因工程研 究
它具有一些重要的特性，包括 对pH值的敏感性，通常在酸性 环境下表现出较高的活性。
此外，酸性磷酸酶还具有底物 特异性，只作用于特定的磷酸 酯底物。
酸性磷酸酯酶基础实验
实验一 酶促反应与时间的关系——初速度时间范围测定[原理]酸性磷酸酯酶（Acid phosphatase E.C.3.1.3.2）广泛分布于动物和植物中，植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺中。
它对生物体核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢，骨的生成与磷酸的利用，都起着重要的作用。
酸性磷酸酯酶是酶动力学研究的好材料。
它能专一性水解磷酸单酯键。
本实验选用绿豆芽作材料，从中提取酸性磷酸酯酶。
以人工合成的对-硝基苯磷酸酯(NPP)作底物，水解产生对-硝基酚和磷酸。
在碱性溶液中，对-硝基酚盐离子于405nm 处光吸收强烈，而底物没有这种特性。
利用产物的这种特性，可以定量地测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。
即测定单位时间内405nm 处光吸收值的变化，来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol 产物所需的酶量。
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。
可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围。
本实验进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。
从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。
随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。
要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。
求出酶反应初速度的时间范围是酶动力学性质的一系列研究中的组成部分和必要前提。
[试剂和器材] 1、试剂：（1）酸性磷酸酯酶原酶液取萌发好的绿豆芽，剪去根的头部，称取豆芽茎20g ，用蒸馏水洗干净，用研钵研碎，加0.2mol/L 乙酸盐缓冲液4mL ，置冰箱6小时以上。
将上述绿豆芽浸液倒入纱布内压榨，榨出液3 000r/min 离心15min ，上清液置透析袋对蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h 以上。
将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽茎克数相等，以3 000r/min 离心30min ，所得的上清液即为原酶液，置冰箱待用。
实验5巨噬细胞酸性磷酸酶的显示
实验5 巨噬细胞酸性磷酸酶的显示姓名：李思露学号：131140040一、实验目的以小鼠腹腔巨噬细胞为材料，通过显示其溶酶体代表酶—酸性磷酸酶，学习酶细胞化学的一般原理及方法。
二、实验原理酸性磷酸酶是动物吞噬细胞溶酶体的标志性酶。
其能分解磷酸脂（常用β-甘油磷酸钠）而释放出磷酸基。
在pH5.0的环境中，磷酸基能与铅盐（硝酸铅，捕捉剂）反应形成无色的磷酸铅（微细沉淀，可在电镜下观察），再经过与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀（可在光镜下观察），以此显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。
三、实验材料、试剂及用品（一）材料小白鼠：6~8周龄小白鼠。
处理1：小鼠实验前2天，腹腔注射4%淀粉肉汤1 mL诱导及活化巨噬细胞；处理2：小鼠实验前2天，腹腔注射生理盐水1 mL。
（二）试剂（1）4％淀粉肉汤：牛肉膏0.3g,蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，可溶性淀粉4g，蒸馏水100mL，高压蒸汽灭菌20min，保存于4℃冰箱。
（2）10％中性福尔马林（pH6.8~7.1）。
（3）酸性磷酸酶作用液（现配）：蒸馏水90mL，0.2mol/L乙酸缓冲液（pH4.6）12mL,5%硝酸铅2mL,3.2%β-甘油磷酸钠4mL。
配法：先将蒸馏水和乙酸缓冲液混合，随后成分大致相等的2份，向其中一份加硝酸铅溶液混匀，向另一份加β-甘油磷酸钠溶液混匀；然后将其中一份溶液缓缓加入另一份溶液中，且边加边用玻璃棒搅拌。
用乙酸调pH为4.8~5.0。
注意：配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀；最好在临用前配制，不能储存。
（4）1％硫化铵溶液。
（三）用品水浴箱（50℃，37℃）、低温冰箱、普通光学显微镜、小剪刀、5mL一次性注射器、10mL玻璃离心管、试管架、胶头滴管、载玻片染色盒（缸）、5片装玻璃染色缸、载玻片。
四、实验操作1.巨噬细胞：腹腔注射生理盐水2mL，3min后抽取腹腔液。
2.细胞黏附及酶灭活：每人3片，标示1、2、3。
在1和2中央位置滴加处理1小鼠腹腔液2~3滴，在3中央位置滴加处理2小鼠腹腔液2~3滴；将1和3置4℃冰箱黏附30min，将2置湿盒（铺有数层湿纱布的不锈钢饭盒）内，50℃水浴或恒温箱30min，灭活酸性磷酸酶。
实验六酸性磷酸酶的显示
学习酸性磷酸酶的显示方法
酸性磷酸酶的显示方法有多种，包括 化学染色法、荧光染色法、同位素示 踪法等。
其中，化学染色法是最常用的一种方 法，通过特定的化学反应将酸性磷酸 酶催化生成的磷酸酯与特定的指示剂 结合，从而显示出酶的活性。
掌握实验操作流程
实验操作流程包括组织或细胞的处理、酶反应、结果观察等 步骤。
的转移和代谢。
在骨组织中，酸性磷酸酶参与骨质的矿化和骨细胞的凋亡过程。
03
显示酸性磷酸酶的化学反应原理
01
02
03
在酸性条件下，酸性磷 酸酶能够催化磷酸单酯 水解，释放出无机磷酸
。
无机磷酸与染色剂（如 茜素红、甲苯胺蓝等） 反应，生成有色产物， 从而显示出酸性磷酸酶
的存在。
染色剂的颜色变化与无 机磷酸的浓度呈正比关 系，因此可以通过观察 颜色变化来判断酸性磷
02 了解其活性调节的分子机制，为药物设计和疾病治疗
提供理论支持。
发展新型酸性磷酸酶显示技术
03
针对现有技术的不足，开发更加灵敏、特异和便捷的
显示方法。
感谢您的观看
THANKS
实验技能提升
通过本次实验，我掌握了酸性磷酸酶的显示方法，提高了实验操作 技能和实验数据分析能力。
理论知识应用
实验过程中，我深刻体会到了理论知识与实际应用的结合，加深了 对相关酶学反应的理解。
团队合作意识
实验需要多人协作完成，锻炼了我的团队协作意识和沟通能力。
实验不足与改进建议
实验操作细节需优化
在实验过程中，我发现有些操作步骤不够严谨，影响了实验结果的可重复性。未来应更 加注重操作的规范性和细节处理。
在实验操作过程中，需要注意实验条件、试剂浓度、反应时 间等因素对实验结果的影响，确保实验结果的准确性和可靠 性。
酸性磷酸酶显示方法的研究
酸性磷酸酶显⽰⽅法的研究鸡肝酸性磷酸酶显⽰⽅法的研究酸性磷酸酶(acid phosphatase ACP)是指⼀组⾮特异性磷酸酯酶，在酸性条件下能⽔解各种磷酸脂。
ACP分布⼴泛，它能够催化磷酸单酯键的⽔解并释放⽆机磷酸，是⽣物磷代谢的重要酶类，ACP活性的⾼低与⼈和动物的病理状态密切相关。
酸性磷酸酶是溶酶体的标志酶。
溶酶体作为细胞内起消化功能的细胞器，含有⼤量酸性⽔解酶，在细胞内外物质代谢过程中起着⼗分重要的作⽤。
ACP的活性变化直接体现溶酶体的功能状态[1]。
在⼤部分组织中，它主要定位于溶酶体内。
在溶酶体膜完整时，底物不易渗⼊，ACP活⼒微弱或⽆活性。
经固定后，在合适的pH条件下，膜本⾝变得不稳定，逐渐改变其渗透性，底物可以渗⼊，酶活⼒被显⽰。
此酶在pH5.0的环境中发⽣作⽤，分解磷酸脂⽽释放出磷酸基，磷酸基能与铅盐反应形成磷酸铅。
但因其是⽆⾊的，所以再经过与硫化铵作⽤，形成棕⿊⾊的硫化铅沉淀，由此就能显⽰酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布[2]。
国内外也发布不少有关酸性磷酸酶在细胞中的定位研究的报道，例如：⽯长应等[3]已经利⽤电镜酶细胞化学⽅法，对⼤尾柱⾍(Urostyln grandis)、冠突伪尾柱⾍(Pseudorostyld cristata)、魏⽒拟尾柱(Paraurostyla weissei)三种纤⽑⾍细胞内的酸性磷酸酶进⾏了定位观察。
发现在它们体内ACPase的阳性反应颗粒除分布在消化腔隙内独⽴的泡状结构上和被消化的⾷物组织中外，在细胞质中的⼩圆泡内也有分布。
近年来研究⼈员应⽤超微结构酶细胞化学技术研究了家蚕幼⾍中肠ACPase活性的亚细胞分布[4]，结果表明ACPase主要分布在圆筒形细胞的细胞核内，核周围的内质⽹及溶酶体中，杯形细胞的细胞核，细胞底部的内褶膜上也有少量的酶活性存在。
采⽤酶组织化学⽅法，孙建梅等[5]⾸次报道了ACP在⽂昌鱼组织中分布。
ACP在⽂昌鱼组织中分布⼴泛，在表⽪、消化道及⽣殖腺中均有分布。
植物根系酸性磷酸酶活性测定
植物根系酸性磷酸酶活性测定1.原理该方法以对硝基苯磷酸二钠（即p-NPP）为底物，该底物在土壤酸性磷酸酶的催化下水解生成黄色的对硝基苯酚（即p-NP），该黄色溶液在410nm处有最大吸收光值，根据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量分析，以此来反映土壤酸性磷酸酶的活性。
酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解p-NPP生成的对硝基苯酚（p-NP）的量来表示（μg·h-1·g-1鲜根或μg·h-1/株）。
2.测定方法1）称取（1.2±0.1）g鲜根，加入8 mL 0.2mol/L醋酸钠缓冲液（pH 5.8），然后进行冰浴研磨，双层纱布过滤，12000 r/min离心15min，静置。
2）取上清液1mL于15mL离心管中，加入2mL 0.05mol/L对硝基苯磷酸二钠（醋酸钠缓冲液配制），摇匀后加盖，于37℃水浴30min。
3）水浴后加入2mL 0.5mol/L CaCl2及2mL 2mol/L NaOH以终止反应，摇匀。
4）2500r/min离心5min，取上清液于15mL离心管中，4000r/min下再离心5min。
5）取上清液在410nm波长比色，并记录吸光值A410。
3.标准曲线的制作1）取13支15mL离心管，按顺序编号，并按表1加入试剂。
表1对硝基苯酚标准曲线配制表2）混匀后，在2500r/min 下离心5min ，再在4000r/min 下离心5min 以0号作为对照，在410nm 波长下测光吸收值，并记录光吸收值A 410。
3）以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx 及相关系数R ，即对硝基苯酚含量410)(A b a mol n ⨯+=μ。
4.计算方法根系酸性磷酸酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解p-NPP 生成的对硝基苯酚（p-NP ）的量来表示（μg·h -1·g -1鲜根或μg·h -1/株）。
酸性磷酸酶的检测实验报告
酸性磷酸酶的检测实验报告一．实验目的1.以Gomori铅法为例学习细胞化学方法检测水解酶的原理和方法。
2.掌握小鼠等实验动物腹腔巨噬细胞采集和制片的方法。
3.观察巨噬细胞内酸性磷酸酶的分布进一步了解溶酶体的结构和功能。
二．实验原理1.向小鼠腹腔内注射无菌淀粉肉汤，排异反应使小鼠产生大量巨噬细胞，且巨噬细胞吞噬淀粉肉汤后不会对细胞造成伤害，反而被“喂养”。
连续多天注射使小鼠腹腔内聚集大量巨噬细胞。
2.由于无法直接观察酸性磷酸酶的分布，可以通过检测酸性磷酸酶代谢产物的方法间接观察。
酸性磷酸酶催化反应。
再通过福尔马林-钙固定，再通过显色与染色过程。
在光镜油镜下可观察到黑色颗粒，也就是硫化铅沉淀，从而观测酸性磷酸酶在巨噬细胞中的分布。
三．实验材料及设备1.实验材料：a)连续三天向腹腔中注射1mL6%淀粉肉汤的小鼠一只b)酸性磷酸酶工作液，c)福尔马林-钙固定液d)2%硫化铵溶液e)0.1%沙黄染液2.实验设备：a)普通光学显微镜b)载玻片若干c)4摄氏度冷藏柜d)染色皿若干、吸水纸、滴管、剪刀、白瓷板等四．实验方法及步骤（一）实验组：1.巨噬细胞采集与附着a)配置6%淀粉肉汤，连续三天向小鼠腹腔内注射，注意不要伤害小鼠器官。
b)用脊髓脱臼法快速处死小鼠。
在白瓷板上用剪刀打开小鼠腹腔，用适量生理盐水冲洗小鼠内脏。
c)用胶头滴管吸取生理盐水冲洗液，滴于洁净的载玻片上，注意不要涂抹，每个载玻片各滴两滴，注意做好编号与正反标记。
d)将载玻片置于有U形玻璃支架的大型培养皿中。
培养皿在4摄氏度的冷藏柜中放置30min。
用吸水纸吸去多余生理盐水，注意不要让细胞完全干燥。
2.酶的反应将玻片置于37摄氏度的酸性磷酸酶工作液中，温浴30min。
生理盐水小心冲洗，吸去多余水分。
3.细胞的固定将玻片置于福尔马林-钙固定液的染缸中，固定5min。
蒸馏水冲洗，吸去多余水分。
4.显色a)2%硫化铵溶液中处理3~5min，取出载玻片，用蒸馏水漂洗。
巨噬细胞酸性磷酸酶的显示
巨噬细胞酸性磷酸酶的显示一、实验目的以小鼠腹腔巨噬细胞为材料，通过显示其溶酶体代表酶—酸性磷酸酶，学习酶细胞化学的一般原理及方法。
二、实验原理酸性磷酸酶能分解磷酸脂（常用β-甘油磷酸钠）而释放出磷酸基。
在pH5.0的环境中，磷酸基能与铅盐（硝酸铅，捕捉剂）反应形成无色的磷酸铅（微细沉淀，可在电镜下观察），再经过与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀（可在光镜下观察），以此显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。
三、实验仪器及试剂a)小白鼠：实验前2天，一部分腹腔注射4%淀粉肉汤1 mL诱导及活化巨噬细胞，另一部分不作处理。
b)试剂：4％淀粉肉汤，10％中性福尔马林（pH6.8~7.1），酸性磷酸酶作用液（现配），1％硫化铵溶液。
c)水浴箱（50℃，37℃）、低温冰箱、普通光学显微镜，小剪刀、5mL一次性注射器、10mL玻璃离心管、试管架、塑料滴管、载玻片染色盒（缸）、自制湿盒、塑料培养皿、盖玻片、载玻片。
四、实验步骤a)巨噬细胞收集：分别用脱颈法处死一只腹腔注射4％淀粉肉汤1mL的小鼠和一只不注射的小鼠。
然后都在腹腔注入2mL生理盐水，揉匀；剪开腹部皮肤，暴露腹膜；用带针头的注射器插进腹腔吸取腹腔液。
b)细胞黏附：对于注射了淀粉肉末的小鼠腹腔液一组共做6片，每片2~3滴，其中放入4℃冰箱黏附30min的每人一片；而放入湿盒内，50℃水浴30min，灭活酸性磷酸酶的则2人一片。
对于未注射淀粉肉末的小鼠腹腔液则只做置于4℃下的4个片子即可。
c)固定：将所有载玻片置于放有预冷的10％中性福尔马林的缸内在4℃冰箱中固定30min。
d)自来水漂洗并浸于自来水中5min。
e)加酸性磷酸酶作用液反应：再将水甩干，每个装片加入足量的酸性磷酸酶作用液，放在37℃的水浴锅中反应30min。
f)用自来水漂洗片刻。
g)加硫化铵反应：在通风橱中，加入1%硫化铵溶液后反应10min。
h)在通风橱中自来水冲洗。
i)带水加盖玻片显微观察。
实验三、 细胞中酸性磷酸酶的定位
在高等动物中存在大小两类吞噬细胞（巨噬细胞和嗜中性粒细 胞），专司吞噬作用，在细胞的非特异免疫功能中发挥重要作 用。 1.单核细胞 单核细胞来自骨髓的前单核细胞，发育成熟后释放到血液中。 血液中单核细胞已向全身各组织并进一步分化成各种组织的巨噬 细胞。血液中单核细胞为圆形或椭圆形，直径14-20微米，在形态 上很难和其他独核细胞相区分。胞质中含有嗜天青颗粒，它是一 种溶酶体，其中含有过氧化物酶，酸性磷酸酶，非特异性酯酶和 溶菌酶等，这些酶与单核细胞的杀伤和消化功能有关。单核吞噬 细胞在血液中约占白细胞的1%-3%，其在血液中的半衰期约为810个小时，一旦进入组织分化为巨噬细胞后，其生命周期可长达 数月至数年。
通常酸性磷酸酶在pH5.0左右发生作用，能分解磷 酸酯而释放出磷酸基，磷酸基能与铅盐反应形成磷 酸铅沉淀物。但因其是无色的，需再经过与硫化铵 作用，形成棕黄到棕黑色的硫化铅沉淀，由此能显 示酸性磷酸酶在细胞中的存在与分布。
反应如下：
β-甘油磷酸钠---β- 甘油 +PO4 3PO43-+Pb(NO3)2 -----Pb3(PO4)2（沉淀） Pb3(PO4)2 +(NH4)2S----PbS (棕黑色)
2.巨噬细胞的特性
组织中的巨噬细胞则呈显著的多形性，在培养条件下对塑料或 玻璃表面具有极强的粘附性，一次可利用这一特性分离巨噬细 胞并与非粘附性细胞分开，但其作用机制不详。巨噬细胞在体 内可借其表面粘附分子与其它细胞或细胞外基质黏附在一起。 巨噬细胞的另一特性是对异物通过不同机制具有吞噬作用 （phagocytosis）,吞饮（endocytosis）或胞饮作用 （pinocytosis）。可将异物吞入胞内，并借其胞浆内的大量液 泡及颗粒中的内含物和代谢产物将吞入的异物降解，消化和清 除。
酸性磷酸酶活性测定方法
实验九酸性磷酸（酯）酶活性测定1．目的要求掌握酸性磷酸（酯）酶活性测定的原理和方法。
2．方法原理酸性磷酸（酯）酶是一种存在于生物体内水解有机磷酸酯键的酶。
以对硝基酚磷酸钠作为底物，在酸性磷酸酯酶的作用下，在碱性条件下水解生成黄色的对硝基酚，可用分光光度计进行比色测定。
它们在各类种子中普遍存在，且含量较多，在萌发前期，随着种子的萌发进程活性增加，通常酸性磷酸酶活性与种子活力呈正比。
3．主要实验仪器及材料干种子或吸胀种子、电子天平、分光光度计、恒温水浴箱、带塞刻度试管、小烧杯、研钵、塑料管、剪刀。
4．掌握要点掌握常用的测定酸性磷酸（酯）酶活性的方法——对硝基酚磷酸钠法。
5．实验内容（1）酶液提取。
称取1g样品，用5mL研磨缓冲液在研钵中冰浴研磨成浆，再用5mL 研磨缓冲液冲洗，转移至离心管中，在20000rpm下离心10min。
吸出上清液，即为酶粗提液。
可放在冰箱中储存备用。
（2）活力测定。
取酶液0.1—1mL（视酶含量多少而定），加水至1mL，然后加入缓冲液1mL和对硝基酚磷酸钠溶液0.1mL。
空白对照用1mL研磨缓冲液代替酶制剂。
充分混匀后，放在30℃恒温箱中保温10min，时而摇动。
10min后，加入1m0.5mol/LNaOH溶液，充分混合，终止反应，并使对硝基酚呈黄色。
在400nm波长下测吸光度A。
（3）计算酶活性，以每毫克种子每分钟水解底物的nmol数表示。
酶活性nmol/min.mg=）（）（试样的gWVVA⨯⨯⨯min1011.3019.0式中0.019为pH=14时，对硝基酚的µmol吸光系数，即对硝基酚的浓度为1mol/L时，其A=0.019；3.1为0.0031×1000，反应混合液的体积为3.1，将µmol化为nmol乘上1000；V为酶制剂总体积；V1为每次用酶体积。
在实验中要保持酶制剂处于低温下以免酶活性下降，可在冰箱中提取和保存。
酸性磷酸酶Km和Vmax值测定课件
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• 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 • （目的：选取合适的反应时间）
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加液程序表
管号
1234560
磷酸苯二钠 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
?11豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取?22制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线?33制作酚标准曲线?44s与vv00关系实验?55双倒数作图法计算vmax和km文档仅供参考不能作为科学依据请勿模仿
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一、概述 酸性磷酸酶：
催化磷酸单酯的水解反应 存在于人的肝脏，前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。
是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测指 标。
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二、实验原理
磷酸苯二钠
酶液
苯酚 ＋ 磷酸氢二钠
folin-酚测定酚的浓度
计算出反应速度（用产物生成量/min来表示）
根据双倒数法计算出Km及Vmax
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以酚含量（μmol）为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制标准曲线。
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• 4、[S]与V0关系实验
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实验加液程序表
管号
1234560
酸性磷酸酶的.pptx
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3.各上清液中ACP比活性分析
ACP活性单位定义：每分钟每毫升酶液产生 1nmol酚即nmol/min·ml为1个活性单位；
比活性=
酶活性 U/ml 蛋白质含量mg/ml
目的要 求
1. 巩固诊断酶学有关的理论与实验知识； 2. 掌握酶的分离纯化方法； 3. 掌握酸性磷酸酶（aicd phosphatase ACP）活性测定的原理、方法和影响因
素； 4. 熟悉酶活性测定的条件选择和方法建立。
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试剂与器材
一、ACP的分离纯化试剂：见实验 教材P31； 二、ACP动力学分析试剂：见实验 教材P35；
线 5.抑制剂-速度（[I]-V）曲线
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一、 ACP的分离纯化
1.概况： ACP分布广泛 分子量100kD 最适pH5.0 热稳定性较好 溶解度较高 临床应用广
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2. ACP的分离纯化方法 ♥ 根据ACP的理化性质，可以用层析、电
泳、透析等多种方法分离纯化。
♥本实验采用分级离心+分段盐析法：
感谢您的观看！
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心
缓慢搅拌
上清液 I
1mol/L MnCl2
4000rpm，10min离心
2ml/100ml上清液 I
（激活并稳定ACP， 沉淀杂蛋白）
上清液 II
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上清液 II
饱和硫酸铵 54ml /100ml上清液 II
4000rpm，8min离心
（溶解ACP， 沉淀杂 蛋白）
土壤磷酸酶（酸性、中性和碱性磷酸酶
土壤磷酸酶测定（酸性、中性和碱性磷酸酶）1. 分析意义土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。
在pH4-9的土壤中均有磷酸酶。
积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。
研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。
磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。
2. 试验原理Kroll等（1955）最早提出用苯基磷酸盐作基质，以酚的释放量表示磷酸酶活性。
测定磷酸酶主要根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。
前一种通称为有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法。
后一种称为无机磷含量法。
研究证明，磷酸酶有三种最适pH：4-5，6-7和8-10。
所以，测定酸性、中性和碱性反应土壤的磷酸酶，要提供相应的pH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。
测定磷酸酶常采用的pH缓冲体系有醋酸盐缓冲液（pH5.0-5.4），柠檬酸盐缓冲液（pH7.0），三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0-8.5），硼酸缓冲液（pH9-10）。
测定磷酸酶时，用各种磷酸一酯作为基质。
常用的基质有苯磷酸二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、α或β萘酚磷酸钠、ρ-硝基苯磷酸钠等。
3. 试剂配制a. 0.5％磷酸苯二钠（用缓冲液配制）；b. pH5醋酸盐缓冲液、pH7柠檬酸盐缓冲液、pH9.4硼酸盐缓冲液；c. 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2.6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用；d. 酚的标准溶液：酚原液－取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中；酚工作液－取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）；e. 甲苯；f. 0.3％硫酸铝溶液。
4. 标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022和0.0026mg ·g -1浓度的酚标准溶液梯度。
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谢途径和细胞增殖周期；（3）利用免疫学原理的染色方法：大 分子物质具有免疫原性可制备特异抗体。用各种标记物如荧光素 、辣根过氧化物酶和胶体金等标记该抗体，利用免疫学抗原抗体
反应原理，用标记抗体显示相应抗原。
• 5．酸性磷酸酶的显示方法：酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）主要存在于巨噬细胞，定 位于溶酶体内。在溶酶体膜稳定完整时，底物不 易渗入，ACP活力微弱或无活性，经固定，在合 适pH条件下，膜本身变为不稳定，逐渐改变其渗 透性，底物可以渗入，酶活力被显示。ACP在酸 性条件下（pH4.7）可使作用液中的底物β-甘油磷 酸钠的磷酸根解离出来，进而与溶液中硝酸铅结 合形成磷酸铅沉淀，因其是难溶解的无色沉淀物 ，需要与黄色的硫化铵作用，生成棕黑色PbS沉 淀而被显示出来。
实验十五：酸性磷酸酶的显示
• 4．染色的方法：（1）利用化学原理进行的染色方法：金属沉淀 法：利用酶催化反应形成的分解产物与金属化合物反应，最终生 成有色沉淀，借此辨认所要检查的酶的活性。偶氮偶联法：用人 工合成的酶底物在酶的作用下产生分解产物，后者与重氮盐结合
形成不溶性的偶氮色素。Schiff反应法：游离的醛基可使Schiff试 剂中的无色品红变为紫红色产物，这种反应通常用于显示多糖类
• β-甘油磷酸钠 甘油+PO3-
• PO4 +Pb（NO3)2
Pb2（PO4)2
• Pb2（PO4)4 +（NH4)2S PbS
• 【实验用品】
• 1．器材：注射器、解剖用具、恒温水浴锅、载玻 片、盖玻片
• 2．试剂：3%淀粉溶液；ACP作用液；2%硫化铵
• Gomori硝酸铅作用液
• 0.05mol／L醋酸缓冲液（pH5)
lOOml
• 0.6醋酸加蒸馏水200ml、取其
42ml
• 醋酸钠1.36g加蒸馏水200ml，取其158ml共
200ml
• B-甘油磷酸钠
2g
• 醋酸铅
2g
• 5％氯化镁
5ml
• 以上作用液在临用时配制，最终在pH5～5.2，过 滤使用。
• 3．材料：小鼠腹腔液涂片
• 【方法步骤】 • 1．免疫动物：实验前4～6天用无菌注射器取已
灭菌的3%淀粉溶液1ml注射于小鼠腹腔内，每天 一次。 • 2．颈椎脱臼处死小鼠，打开腹腔。 • 3．吸取少量腹腔液，在玻片上涂层一薄层，室温 晾干。 • 4．将涂片滴置于温盒中，滴加适量ACP作用液， 37℃作用30分钟。取出后，蒸馏水漂洗。用10% 甲醛钙溶液后固定5min。 • 5．玻片入2%硫化胺溶液作用2～3min，进行显 色。取出后蒸馏水漂洗，镜检。 • 6．对照组的作用液中不加β-甘油磷酸钠，而以蒸 馏水代替；或入作用液前先用高温（50）处理 30min，使酶失去活性，作好标记，然后同时进 行上述实验。
• 【实验结果】
• 酸性磷酸酶活性结构呈棕黄色至棕黑色。
• 对照：在处理过程中，在作用液中不加入甘油磷酸钠而加 入蒸馏水，则呈 阴性。
• 【实验报告】
• 1．绘图表示酸性磷酸酶在细胞中的分布情况；说明阴性 对照在实验中的作用。
• 2．试说明酸性磷酸酶活性结构为何种细胞器？