实验六酸性磷酸酶的显示剖析
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医学检验·各论：酸性磷酸酶 >>>
正常值： 血清2.2～10.5U／L。
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相关检查： 血清酸性磷酸酶、血清酸性磷酸酶 （ACP）。
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相关症状： 口粘腻、黄疸、呼吸异常、紫绀、心悸、 血尿。
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ห้องสมุดไป่ตู้相关疾病：
医学检验·各论 酸性磷酸酶
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别名： 酸性磷酸酶。
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简介： 酸性磷酸酶主要分布于前列腺、肝、
脾、乳汁、红细胞、血小板及骨骼等。以 前列腺含量最为丰富。
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临床意义：
增高：前列腺癌，特别是有转移时， 血清酸性磷酸酶可明显增高。变形性骨髓 炎、原发性骨肿瘤、甲状腺功能亢进、白 血病、乳腺癌、心肌梗死、肝炎、肝硬化、 胆囊炎、溶血性疾病、急性尿潴留时可增 高。此外，前列腺活检。膀胱镜检查、直 肠检查等也可使酸性磷酸酶活性增高。
乳腺癌、老年人前列腺癌、前列腺癌、甲 状腺功能亢进症、心肌梗死、急性心肌梗 死、骨肿瘤、甲型病毒性肝炎、乙型病毒 性肝炎。
谢谢！
实验八、巨噬细胞酸性磷酸酶显示资料讲解
作业
1、比较对照标本与正常处理标本结果的不同 2、比较吞噬活性强的大体积巨噬细胞和吞噬活
性弱的小体积巨噬细胞酸性磷酸酶的分布与活 性
蒸馏水
0．2mol／L醋酸缓冲液(pH4．6)
5％硝酸铅 3.2％β—甘油磷酸钠
90ml
12ml
2ml 4ml
配法：先将蒸馏水和醋酸缓冲液混合，随后分成大致相等的两份， 一份中加硝酸铅溶液，另一份加甘油磷酸钠溶液，然后再将两者 缓缓混合，边混边搅匀。 若pH不到5．0，可加少量醋酸的调整。 注意：配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀； 最好在临用 前配制，不能贮存。
附：0．2mol／L醋酸缓冲液（pH4．6）配制方法
0.2mol/l醋酸（ml） 25.5
0.2mol/l醋酸钠（ml）24.5
4、1％硫化铵溶液 硫化胺 1ml 蒸馏水 9ml
5、姬姆萨染液（1：30）
姬姆萨原液
3滴
磷酸盐缓冲液（pH6．8） 5ml
实验方法
1、巨噬细胞诱导：实验前2天开始，每日向小鼠腹腔注射6 ％淀粉肉汤1ml，连续注射3天。
酶的显示法是通过显示酶的活性来表明酶的存 在，而不是酶的本身。
将具有酶活性的组织放人含有一定底物的溶液 中孵育，底物经酶的作用形成初级反应产物， 它再与某种捕捉剂相反应，形成显微镜下可视 性沉淀，即最终反应产物。
4．核酸显示法
显示DNA的传统方法为Feulgen反应。
切片DNA经弱酸(1mol/LHcl)水解, 其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的 键打开,使脱氧核糖的一端形成游 离的醛基,这些醛基在原位与 Schiff试剂(无色品红亚硫酸钠溶 液)反应,形成紫红色的化合物,使 细胞内含有DNA的部位呈紫红色 阳性反应.紫红色的产生,是由于反 应产物的分子内含有醌基,醌基是 发色团,因此具有颜色.
浅谈红细胞葡萄糖—6—磷酸脱氢酶检测结果分析
浅谈红细胞葡萄糖—6—磷酸脱氢酶检测结果分析目的探讨开展G6PD检测的临床意义。
方法对近2年内笔者所在医院出生的3809例新生儿进行细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶检测。
结果男性新生儿G6PD 缺乏率为12.04%，女性新生儿为7.75%，比较有统计学意义（χ2=6.107，P=0.026），总缺乏率为10.11%；G6PD具体数值为57～2452 U/L，轻度缺乏242例（62.86%），中度缺乏49例（12.73%），明显缺乏63例（16.36%），重度缺乏31例（8.05%）。
结论开展红新生儿细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶检测可帮助临床及早采取预防措施，控制诱因，预防溶血性贫血的发生，对G6PD缺乏患儿健康成长具有重要意义。
Abstract：Objective Discussion on developing the clinical significance of detecting G6PD. Methods For cell glucose -6- phosphate dehydrogenase detected in 3809 cases of newborns in the recent 2 years in our hospital was born. Results Male neonatal G6PD deficiency rate is 12.04%，the female newborns was 7.75%，compared with statistical significance （χ2=6.107，P=0.026），the total lack of rate was 10.11%；the G6PD value for the 57～2452 U/L concrete，242 cases of mild deficiency （62.86%），moderate deficiency in 49 cases （12.73%），significant lack of 63 cases （16.36%），severe deficiency in 31 cases （8.05%）. Conclusion The development of red cell glucose -6- phosphate dehydrogenase of neonatal clinical early detection can help to take preventive measures，control incentives，prevent the happening of hemolytic anemia，and it has important significance to the healthy growth of children with G6PD deficiency.Key words：Cell glucose-6-phosphate dehydrogenase；Inspection；Newborn；G6PD deficiency葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症为临床常见的遗传性代谢疾病，多发病于新生儿时期，发病时的主要临床症状多表现为新生儿黄疸与溶血性疾病等，且病情普遍比较凶险，故被临床界定为新生儿重要急症之一，且尽早对G6PD缺乏新生儿做出准确诊断具重要临床意义[1]。
《酸性磷酸酶的》课件
基因克隆与表达
基因克隆
通过分子生物学技术，从生物体中提取酸性磷酸酶基因的全 长或部分序列，并在实验室中进行复制。
基因表达
将克隆的酸性磷酸酶基因转染至适当的细胞或生物体中，使 其表达产生相应的蛋白质。
基因突变与功能研究
基因突变
研究酸性磷酸酶基因突变对其功能的 影响，包括酶活性、底物特异性等方 面的变化。
功能研究
通过体外实验和体内实验，深入了解 酸性磷酸酶在生物体内的生理功能和 作用机制。
基因治疗与药物研发
基因治疗
利用酸性磷酸酶基因或其相关分子进行治疗，以纠正或补偿某些遗传性疾病或病理状态 。
药物研发
基于酸性磷酸酶的特性，开发具有治疗作用的新型药物，用于癌症、感染性疾病等的治 疗。
06 酸性磷酸酶的未来研究方 向与展望
低副作用。
抑制剂的优化
02
对已有抑制剂进行结构优化，以提高其选择性、稳定性和口服
生物利用度。
抑制剂的作用机制研究
03
深入探讨酸性磷酸酶抑制剂的作用机制，为进一步的药物设计
和优化提供理论支持。
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药效学特性
抑制剂对酸性磷酸酶的抑制作用具有选择性，对其他酶的影响较小。抑制剂的作 用强度与抑制常数（Ki）成反比，Ki越小，抑制作用越强。
药代动力学特性
抑制剂在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程受多种因素影响。药物的生物利用 度、半衰期、血药浓度等药代动力学参数对药物的疗效和安全性具有重要影响。
05 酸性磷酸酶的基因工程研 究
它具有一些重要的特性，包括 对pH值的敏感性，通常在酸性 环境下表现出较高的活性。
此外，酸性磷酸酶还具有底物 特异性，只作用于特定的磷酸 酯底物。
磷酸酶实验报告
一、实验目的1. 了解磷酸酶的基本性质和作用；2. 掌握磷酸酶活性测定的原理和方法；3. 学会使用分光光度计进行酶活性测定；4. 熟悉磷酸酶的动力学分析。
二、实验原理磷酸酶是一类催化磷酸酯键水解的酶，具有广泛的生物学功能。
磷酸酶活性测定通常采用分光光度法，通过检测底物或产物浓度的变化来反映酶的活性。
本实验采用磷酸苯二钠为底物，在碱性条件下，磷酸酶将磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸盐。
苯酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌的衍生物，根据红色深浅可测出酶活力高低。
三、实验器材与试剂1. 器材：试管架、试管、移液管、移液枪、恒温水浴箱、721型分光光度计、移液器、磁力搅拌器、电子天平、滴定管等。
2. 试剂：0.02mol/L底物液、pH10碳酸缓冲液、蒸馏水、酶液、碱性溶液、4-氨基安替比林、铁氰化钾、磷酸苯二钠等。
四、实验步骤1. 准备实验试剂，配制底物溶液、缓冲液、酶液等。
2. 设置实验组：分别取不同浓度的底物溶液（0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00mmol/L）和酶液，在恒温水浴箱中保温至实验温度。
3. 每个实验组分别取3支试管，编号为1、2、3。
4. 在1号试管中加入底物溶液、缓冲液和酶液，混合均匀后立即加入碱性溶液，启动反应。
5. 在2号和3号试管中分别加入底物溶液、缓冲液和酶液，混合均匀后立即加入4-氨基安替比林和铁氰化钾，启动反应。
6. 将1、2、3号试管分别置于分光光度计中，于特定波长下测定吸光度。
7. 根据吸光度计算酶活性，绘制酶活性-底物浓度曲线。
8. 根据曲线计算米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。
五、实验结果与分析1. 酶活性-底物浓度曲线呈典型的米氏曲线，说明实验成功。
2. 根据曲线计算得到Km值为X mmol/L，Vmax为Y mmol/L·min。
3. 分析Km值和Vmax值，了解酶的催化特性。
实验十讲义五：酸性磷酸酶的显示
• β-甘油磷酸钠 甘油+PO3-
• PO4 +Pb（NO3)2
Pb2（PO4)2
• Pb2（PO4)4 +（NH4)2S PbS
• 【实验用品】
• 1．器材：注射器、解剖用具、恒温水浴锅、载玻 片、盖玻片
• 2．试剂：3%淀粉溶液；ACP作用液；2%硫化铵
• Gomori硝酸铅作用液
• 0.05mol／L醋酸缓冲液（pH5)
谢途径和细胞增殖周期；（3）利用免疫学原理的染色方法：大 分子物质具有免疫原性可制备特异抗体。用各种标记物如荧光素 、辣根过氧化物酶和胶体金等标记该抗体，利用免疫学抗原抗体
反应原理，用标记抗体显示相应抗原。
• 5．酸性磷酸酶的显示方法：酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）主要存在于巨噬细胞，定 位于溶酶体内。在溶酶体膜稳定完整时，底物不 易渗入，ACP活力微弱或无活性，经固定，在合 适pH条件下，膜本身变为不稳定，逐渐改变其渗 透性，底物可以渗入，酶活力被显示。ACP在酸 性条件下（pH4.7）可使作用液中的底物β-甘油磷 酸钠的磷酸根解离出来，进而与溶液中硝酸铅结 合形成磷酸铅沉淀，因其是难溶解的无色沉淀物 ，需要与黄色的硫化铵作用，生成棕黑色PbS沉 淀而被显示出来。
lOOml
• 0.6醋酸加蒸馏水200ml、取其
42ml
• 醋酸钠1.36g加蒸馏水200ml，取其158ml共
200ml
• B-甘油磷酸钠
2g
• 醋酸铅
2g
• 5％氯化镁
5ml
• 以上作用液在临用时配制，最终在pH5～5.2，过 滤使用。
• 3．材料：小鼠腹腔液涂片
• 【方法步骤】 • 1．免疫动物：实验前4～6天用无菌注射器取已
实验5巨噬细胞酸性磷酸酶的显示
实验5 巨噬细胞酸性磷酸酶的显示姓名：李思露学号：131140040一、实验目的以小鼠腹腔巨噬细胞为材料，通过显示其溶酶体代表酶—酸性磷酸酶，学习酶细胞化学的一般原理及方法。
二、实验原理酸性磷酸酶是动物吞噬细胞溶酶体的标志性酶。
其能分解磷酸脂（常用β-甘油磷酸钠）而释放出磷酸基。
在pH5.0的环境中，磷酸基能与铅盐（硝酸铅，捕捉剂）反应形成无色的磷酸铅（微细沉淀，可在电镜下观察），再经过与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀（可在光镜下观察），以此显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。
三、实验材料、试剂及用品（一）材料小白鼠：6~8周龄小白鼠。
处理1：小鼠实验前2天，腹腔注射4%淀粉肉汤1 mL诱导及活化巨噬细胞；处理2：小鼠实验前2天，腹腔注射生理盐水1 mL。
（二）试剂（1）4％淀粉肉汤：牛肉膏0.3g,蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，可溶性淀粉4g，蒸馏水100mL，高压蒸汽灭菌20min，保存于4℃冰箱。
（2）10％中性福尔马林（pH6.8~7.1）。
（3）酸性磷酸酶作用液（现配）：蒸馏水90mL，0.2mol/L乙酸缓冲液（pH4.6）12mL,5%硝酸铅2mL,3.2%β-甘油磷酸钠4mL。
配法：先将蒸馏水和乙酸缓冲液混合，随后成分大致相等的2份，向其中一份加硝酸铅溶液混匀，向另一份加β-甘油磷酸钠溶液混匀；然后将其中一份溶液缓缓加入另一份溶液中，且边加边用玻璃棒搅拌。
用乙酸调pH为4.8~5.0。
注意：配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀；最好在临用前配制，不能储存。
（4）1％硫化铵溶液。
（三）用品水浴箱（50℃，37℃）、低温冰箱、普通光学显微镜、小剪刀、5mL一次性注射器、10mL玻璃离心管、试管架、胶头滴管、载玻片染色盒（缸）、5片装玻璃染色缸、载玻片。
四、实验操作1.巨噬细胞：腹腔注射生理盐水2mL，3min后抽取腹腔液。
2.细胞黏附及酶灭活：每人3片，标示1、2、3。
在1和2中央位置滴加处理1小鼠腹腔液2~3滴，在3中央位置滴加处理2小鼠腹腔液2~3滴；将1和3置4℃冰箱黏附30min，将2置湿盒（铺有数层湿纱布的不锈钢饭盒）内，50℃水浴或恒温箱30min，灭活酸性磷酸酶。
酸性磷酸酯酶的提取实验报告
酸性磷酸酯酶的提取实验报告酸性磷酸酯酶基础实验实验一酶促反应与时间的关系——初速度时间范围测定[原理]酸性磷酸酯酶（Acid phosphatase E.C.3.1.3.2）广泛分布于动物和植物中，植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺中。
它对生物体核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢，骨的生成与磷酸的利用，都起着重要的作用。
酸性磷酸酯酶是酶动力学研究的好材料。
它能专一性水解磷酸单酯键。
本实验选用绿豆芽作材料，从中提取酸性磷酸酯酶。
以人工合成的对-硝基苯磷酸酯(NPP)作底物，水解产生对-硝基酚和磷酸。
在碱性溶液中，对-硝基酚盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。
利用产物的这种特性，可以定量地测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。
即测定单位时间内405nm处光吸收值的变化，来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。
可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围。
本实验进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。
从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。
随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。
要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。
求出酶反应初速度的时间范围是酶动力学性质的一系列研究中的组成部分和必要前提。
图酶反应进程曲线[试剂和器材]1、试剂：（1）酸性磷酸酯酶原酶液取萌发好的绿豆芽，剪去根的头部，称取豆芽茎20g，用蒸馏水洗干净，用研钵研碎，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置冰箱6小时以上。
将上述绿豆芽浸液倒入纱布内压榨，榨出液3 000r/min 离心15min，上清液置透析袋对蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。
实验六酸性磷酸酶的显示
学习酸性磷酸酶的显示方法
酸性磷酸酶的显示方法有多种，包括 化学染色法、荧光染色法、同位素示 踪法等。
其中，化学染色法是最常用的一种方 法，通过特定的化学反应将酸性磷酸 酶催化生成的磷酸酯与特定的指示剂 结合，从而显示出酶的活性。
掌握实验操作流程
实验操作流程包括组织或细胞的处理、酶反应、结果观察等 步骤。
的转移和代谢。
在骨组织中，酸性磷酸酶参与骨质的矿化和骨细胞的凋亡过程。
03
显示酸性磷酸酶的化学反应原理
01
02
03
在酸性条件下，酸性磷 酸酶能够催化磷酸单酯 水解，释放出无机磷酸
。
无机磷酸与染色剂（如 茜素红、甲苯胺蓝等） 反应，生成有色产物， 从而显示出酸性磷酸酶
的存在。
染色剂的颜色变化与无 机磷酸的浓度呈正比关 系，因此可以通过观察 颜色变化来判断酸性磷
02 了解其活性调节的分子机制，为药物设计和疾病治疗
提供理论支持。
发展新型酸性磷酸酶显示技术
03
针对现有技术的不足，开发更加灵敏、特异和便捷的
显示方法。
感谢您的观看
THANKS
实验技能提升
通过本次实验，我掌握了酸性磷酸酶的显示方法，提高了实验操作 技能和实验数据分析能力。
理论知识应用
实验过程中，我深刻体会到了理论知识与实际应用的结合，加深了 对相关酶学反应的理解。
团队合作意识
实验需要多人协作完成，锻炼了我的团队协作意识和沟通能力。
实验不足与改进建议
实验操作细节需优化
在实验过程中，我发现有些操作步骤不够严谨，影响了实验结果的可重复性。未来应更 加注重操作的规范性和细节处理。
在实验操作过程中，需要注意实验条件、试剂浓度、反应时 间等因素对实验结果的影响，确保实验结果的准确性和可靠 性。
酸性磷酸酶的检测实验报告
酸性磷酸酶的检测实验报告一．实验目的1.以Gomori铅法为例学习细胞化学方法检测水解酶的原理和方法。
2.掌握小鼠等实验动物腹腔巨噬细胞采集和制片的方法。
3.观察巨噬细胞内酸性磷酸酶的分布进一步了解溶酶体的结构和功能。
二．实验原理1.向小鼠腹腔内注射无菌淀粉肉汤，排异反应使小鼠产生大量巨噬细胞，且巨噬细胞吞噬淀粉肉汤后不会对细胞造成伤害，反而被“喂养”。
连续多天注射使小鼠腹腔内聚集大量巨噬细胞。
2.由于无法直接观察酸性磷酸酶的分布，可以通过检测酸性磷酸酶代谢产物的方法间接观察。
酸性磷酸酶催化反应。
再通过福尔马林-钙固定，再通过显色与染色过程。
在光镜油镜下可观察到黑色颗粒，也就是硫化铅沉淀，从而观测酸性磷酸酶在巨噬细胞中的分布。
三．实验材料及设备1.实验材料：a)连续三天向腹腔中注射1mL6%淀粉肉汤的小鼠一只b)酸性磷酸酶工作液，c)福尔马林-钙固定液d)2%硫化铵溶液e)0.1%沙黄染液2.实验设备：a)普通光学显微镜b)载玻片若干c)4摄氏度冷藏柜d)染色皿若干、吸水纸、滴管、剪刀、白瓷板等四．实验方法及步骤（一）实验组：1.巨噬细胞采集与附着a)配置6%淀粉肉汤，连续三天向小鼠腹腔内注射，注意不要伤害小鼠器官。
b)用脊髓脱臼法快速处死小鼠。
在白瓷板上用剪刀打开小鼠腹腔，用适量生理盐水冲洗小鼠内脏。
c)用胶头滴管吸取生理盐水冲洗液，滴于洁净的载玻片上，注意不要涂抹，每个载玻片各滴两滴，注意做好编号与正反标记。
d)将载玻片置于有U形玻璃支架的大型培养皿中。
培养皿在4摄氏度的冷藏柜中放置30min。
用吸水纸吸去多余生理盐水，注意不要让细胞完全干燥。
2.酶的反应将玻片置于37摄氏度的酸性磷酸酶工作液中，温浴30min。
生理盐水小心冲洗，吸去多余水分。
3.细胞的固定将玻片置于福尔马林-钙固定液的染缸中，固定5min。
蒸馏水冲洗，吸去多余水分。
4.显色a)2%硫化铵溶液中处理3~5min，取出载玻片，用蒸馏水漂洗。
巨噬细胞酸性磷酸酶的显示
巨噬细胞酸性磷酸酶的显示一、实验目的以小鼠腹腔巨噬细胞为材料，通过显示其溶酶体代表酶—酸性磷酸酶，学习酶细胞化学的一般原理及方法。
二、实验原理酸性磷酸酶能分解磷酸脂（常用β-甘油磷酸钠）而释放出磷酸基。
在pH5.0的环境中，磷酸基能与铅盐（硝酸铅，捕捉剂）反应形成无色的磷酸铅（微细沉淀，可在电镜下观察），再经过与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀（可在光镜下观察），以此显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。
三、实验仪器及试剂a)小白鼠：实验前2天，一部分腹腔注射4%淀粉肉汤1 mL诱导及活化巨噬细胞，另一部分不作处理。
b)试剂：4％淀粉肉汤，10％中性福尔马林（pH6.8~7.1），酸性磷酸酶作用液（现配），1％硫化铵溶液。
c)水浴箱（50℃，37℃）、低温冰箱、普通光学显微镜，小剪刀、5mL一次性注射器、10mL玻璃离心管、试管架、塑料滴管、载玻片染色盒（缸）、自制湿盒、塑料培养皿、盖玻片、载玻片。
四、实验步骤a)巨噬细胞收集：分别用脱颈法处死一只腹腔注射4％淀粉肉汤1mL的小鼠和一只不注射的小鼠。
然后都在腹腔注入2mL生理盐水，揉匀；剪开腹部皮肤，暴露腹膜；用带针头的注射器插进腹腔吸取腹腔液。
b)细胞黏附：对于注射了淀粉肉末的小鼠腹腔液一组共做6片，每片2~3滴，其中放入4℃冰箱黏附30min的每人一片；而放入湿盒内，50℃水浴30min，灭活酸性磷酸酶的则2人一片。
对于未注射淀粉肉末的小鼠腹腔液则只做置于4℃下的4个片子即可。
c)固定：将所有载玻片置于放有预冷的10％中性福尔马林的缸内在4℃冰箱中固定30min。
d)自来水漂洗并浸于自来水中5min。
e)加酸性磷酸酶作用液反应：再将水甩干，每个装片加入足量的酸性磷酸酶作用液，放在37℃的水浴锅中反应30min。
f)用自来水漂洗片刻。
g)加硫化铵反应：在通风橱中，加入1%硫化铵溶液后反应10min。
h)在通风橱中自来水冲洗。
i)带水加盖玻片显微观察。
酸性磷酸酶的.pptx
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3.各上清液中ACP比活性分析
ACP活性单位定义：每分钟每毫升酶液产生 1nmol酚即nmol/min·ml为1个活性单位；
比活性=
酶活性 U/ml 蛋白质含量mg/ml
目的要 求
1. 巩固诊断酶学有关的理论与实验知识； 2. 掌握酶的分离纯化方法； 3. 掌握酸性磷酸酶（aicd phosphatase ACP）活性测定的原理、方法和影响因
素； 4. 熟悉酶活性测定的条件选择和方法建立。
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试剂与器材
一、ACP的分离纯化试剂：见实验 教材P31； 二、ACP动力学分析试剂：见实验 教材P35；
线 5.抑制剂-速度（[I]-V）曲线
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一、 ACP的分离纯化
1.概况： ACP分布广泛 分子量100kD 最适pH5.0 热稳定性较好 溶解度较高 临床应用广
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2. ACP的分离纯化方法 ♥ 根据ACP的理化性质，可以用层析、电
泳、透析等多种方法分离纯化。
♥本实验采用分级离心+分段盐析法：
感谢您的观看！
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心
缓慢搅拌
上清液 I
1mol/L MnCl2
4000rpm，10min离心
2ml/100ml上清液 I
（激活并稳定ACP， 沉淀杂蛋白）
上清液 II
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上清液 II
饱和硫酸铵 54ml /100ml上清液 II
4000rpm，8min离心
（溶解ACP， 沉淀杂 蛋白）
实验三、 细胞中酸性磷酸酶的定位
在高等动物中存在大小两类吞噬细胞（巨噬细胞和嗜中性粒细 胞），专司吞噬作用，在细胞的非特异免疫功能中发挥重要作 用。 1.单核细胞 单核细胞来自骨髓的前单核细胞，发育成熟后释放到血液中。 血液中单核细胞已向全身各组织并进一步分化成各种组织的巨噬 细胞。血液中单核细胞为圆形或椭圆形，直径14-20微米，在形态 上很难和其他独核细胞相区分。胞质中含有嗜天青颗粒，它是一 种溶酶体，其中含有过氧化物酶，酸性磷酸酶，非特异性酯酶和 溶菌酶等，这些酶与单核细胞的杀伤和消化功能有关。单核吞噬 细胞在血液中约占白细胞的1%-3%，其在血液中的半衰期约为810个小时，一旦进入组织分化为巨噬细胞后，其生命周期可长达 数月至数年。
通常酸性磷酸酶在pH5.0左右发生作用，能分解磷 酸酯而释放出磷酸基，磷酸基能与铅盐反应形成磷 酸铅沉淀物。但因其是无色的，需再经过与硫化铵 作用，形成棕黄到棕黑色的硫化铅沉淀，由此能显 示酸性磷酸酶在细胞中的存在与分布。
反应如下：
β-甘油磷酸钠---β- 甘油 +PO4 3PO43-+Pb(NO3)2 -----Pb3(PO4)2（沉淀） Pb3(PO4)2 +(NH4)2S----PbS (棕黑色)
2.巨噬细胞的特性
组织中的巨噬细胞则呈显著的多形性，在培养条件下对塑料或 玻璃表面具有极强的粘附性，一次可利用这一特性分离巨噬细 胞并与非粘附性细胞分开，但其作用机制不详。巨噬细胞在体 内可借其表面粘附分子与其它细胞或细胞外基质黏附在一起。 巨噬细胞的另一特性是对异物通过不同机制具有吞噬作用 （phagocytosis）,吞饮（endocytosis）或胞饮作用 （pinocytosis）。可将异物吞入胞内，并借其胞浆内的大量液 泡及颗粒中的内含物和代谢产物将吞入的异物降解，消化和清 除。
实验三 酸性磷酸酶的显示方法2007.9.10
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实验三 酸性磷酸酶的显示方法
一、实验原理
酸性磷酸酶分解磷酸脂而释放出磷酸基。
在PH5.0的环境中，磷酸基与铅盐反应形成磷酸铅。
但磷酸铅是无色的，所以再与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀，由此就能显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。
二、实验步骤
1.取洋葱内表皮（1cm ×0.6cm 每瓶放3片）沉于10%中性富尔马林液中，4℃下
固定30分钟，（置冰箱贮藏室），对照实验置50℃烘箱中。
（加液至青霉素瓶1/3体积）
2.去福尔马林液，自来水漂洗5分钟。
（青霉素瓶水加满，换3次）
3.去水，加酸性磷酶作用液，室温下置30分钟。
（加液至青霉素瓶1/3体积）
4.去作用液，自来水漂洗10分钟。
（青霉素瓶水加满，换3次）
5.去水，加1%硫化铵处理3-5分钟。
（加液至青霉素瓶1/3体积）
6.去硫化铵，加水漂洗。
（青霉素瓶水加满，换1次）
7.置载玻片上，加盖玻片。
8.显微镜观察（注意液泡中标黑色的小颗粒，表示有酸性磷酸酶的活力）。
三、实验结果（画酸性磷酸酶在细胞中的分布图）
四、结果讨论。
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1. 熟悉酸性磷酸酶显示方法的原理及 操作步骤。
2. 观察酸性磷酸酶在细胞中的分布。
实验原理：
酸性磷酸酶能分解磷酸脂而释放出磷酸基。 在pH5.0的环境中，磷酸基能与铅盐反应形成 磷酸铅。但因其是无色的，所以再经过与硫化 铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀，由此就能 显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。
实验步骤
颈椎脱臼处死小鼠。
实验步骤
吸取少量腹腔液，在玻片上涂片滴置于 冰盒中，滴加 适量ACP作用 液，37℃作用 30分钟。取出 后，蒸馏水漂 洗。用10%甲 醛钙溶液后固 定5min。
实验步骤
玻片入2%硫化 胺溶液作用2～ 3min，进行显色。 取出后蒸馏水漂 洗，镜检。
实验作业
绘图表示酸性磷酸酶在细胞中的分布情况； 说明阴性对照在实验中的作用。
对照实验
对照组的作用液中不加β-甘油磷酸钠， 而以蒸馏水代替；或入作用液前先用高温 （50℃）处理30min，使酶失去活性，作 好标记，然后同时进行上述实验 。
实验结果
巨噬细胞的细胞质 中，出现许多棕色或 棕黑色的颗粒和斑块。 部分细胞内，酸性磷 酸酶极为丰富。整个 细胞质区域都有黑色 沉淀。中性粒细胞呈 现阴性反应。
实验用品
1. 器材：注射器、解剖用具、恒温水浴锅、 载玻片、盖玻片
2. 试剂：10%中性福尔马林；姬姆萨染液； 6% 淀 粉 溶 液 ； ACP 作 用 液 ； 2% 硫 化 铵溶液
3. 材料：小鼠腹腔液涂片
实验步骤
免疫动物：实验 前4～6天用无菌 注射器取已灭菌 的6%淀粉溶液 1ml注射于小鼠 腹腔内，每天一 次。
实验原理：
酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP） 主要存在于巨噬细胞，定位于溶酶体内。在 溶酶体膜稳定完整时，底物不易渗入，ACP 活力微弱或无活性，经固定，在合适pH条件 下，膜本身变为不稳定，逐渐改变其渗透性， 底物可以渗入，酶活力被显示。
实验原理：
ACP在酸性条件下（pH4.7）可使作用 液中的底物β-甘油磷酸钠的磷酸根解离 出来，进而与溶液中硝酸铅结合形成磷酸 铅沉淀，因其是难溶解的无色沉淀物，需 要与黄色的硫化铵作用，生成棕黑色PbS 沉淀而被显示出来。