实验六酸性磷酸酶的显示剖析

实验用品
1. 器材：注射器、解剖用具、恒温水浴锅、 载玻片、盖玻片
2. 试剂：10%中性福尔马林；姬姆萨染液； 6% 淀 粉 溶 液 ； ACP 作 用 液 ； 2% 硫 化 铵溶液
3. 材料：小鼠腹腔液涂片
实验步骤
免疫动物：实验 前4～6天用无菌 注射器取已灭菌 的6%淀粉溶液 1ml注射于小鼠 腹腔内，每天一 次。
实验作业
绘图表示酸性磷酸酶在细胞中的分布情况； 说明阴性对照在实验中的作用。
实验目的：
1. 熟悉酸性磷酸酶显示方法的原理及 操作步骤。
2. 观察酸性磷酸酶在细胞中的分布。
实验原理：
酸性磷酸酶能分解磷酸脂而释放出磷酸基。 在pH5.0的环境中，磷酸基能与铅盐反应形成 磷酸铅。但因其是无色的，所以再经过与硫化 铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀，由此就能 显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。
实验原理：
酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP） 主要存在于巨噬细胞，定位于溶酶体内。在 溶酶体膜稳定完整时，底物不易渗入，ACP 活力微弱或无活性，经固定，在合适pH条件 下，膜本身变为不稳定，逐渐改变其渗透性， 底物可以渗入，酶活力被显示。
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实验原理：
ACP在酸性条件下（pH4.7）可使作用 液中的底物β-甘油磷酸钠的磷酸根解离 出来，进而与溶液中硝酸铅结合形成磷酸 铅沉淀，因其是难溶解的无色沉淀物，需 要与黄色的硫化铵作用，生成棕黑色PbS 沉淀而被显示出来。
实验步骤
颈椎脱臼处死小鼠。
实验步骤
吸取少量腹腔液，在玻片上涂层一薄层， 室温晾干。
实验步骤
将涂片滴置于 冰盒中，滴加 适量ACP作用 液，37℃作用 30分钟。取出 后，蒸馏水漂 洗。用10%甲 醛钙溶液后固 定5min。
实验步骤
玻片入2%硫化 胺溶液作用2～ 3min，进行显色。 取出后蒸馏水漂 洗，镜检。
对照实验
对照组的作用液中不加β-甘油磷酸钠， 而以蒸馏水代替；或入作用液前先用高温 （50℃）处理30min，使酶失去活性，作 好标记，然后同时进行上述实验 。
实验结果
巨噬细胞的细胞质 中，出现许多棕色或 棕黑色的颗粒和斑块。 部分细胞内，酸性磷 酸酶极为丰富。整个 细胞质区域都有黑色 沉淀。中性粒细胞呈 现阴性反应。