实验八、巨噬细胞酸性磷酸酶显示资料讲解
酸性磷酸酶的检测实验报告
酸性磷酸酶的检测实验报告一．实验目的1.以Gomori铅法为例学习细胞化学方法检测水解酶的原理和方法。
2.掌握小鼠等实验动物腹腔巨噬细胞采集和制片的方法。
3.观察巨噬细胞内酸性磷酸酶的分布进一步了解溶酶体的结构和功能。
二．实验原理1.向小鼠腹腔内注射无菌淀粉肉汤，排异反应使小鼠产生大量巨噬细胞，且巨噬细胞吞噬淀粉肉汤后不会对细胞造成伤害，反而被“喂养”。
连续多天注射使小鼠腹腔内聚集大量巨噬细胞。
2.由于无法直接观察酸性磷酸酶的分布，可以通过检测酸性磷酸酶代谢产物的方法间接观察。
酸性磷酸酶催化反应。
再通过福尔马林-钙固定，再通过显色与染色过程。
在光镜油镜下可观察到黑色颗粒，也就是硫化铅沉淀，从而观测酸性磷酸酶在巨噬细胞中的分布。
三．实验材料及设备1.实验材料：a)连续三天向腹腔中注射1mL6%淀粉肉汤的小鼠一只b)酸性磷酸酶工作液，c)福尔马林-钙固定液d)2%硫化铵溶液e)0.1%沙黄染液2.实验设备：a)普通光学显微镜b)载玻片若干c)4摄氏度冷藏柜d)染色皿若干、吸水纸、滴管、剪刀、白瓷板等四．实验方法及步骤（一）实验组：1.巨噬细胞采集与附着a)配置6%淀粉肉汤，连续三天向小鼠腹腔内注射，注意不要伤害小鼠器官。
b)用脊髓脱臼法快速处死小鼠。
在白瓷板上用剪刀打开小鼠腹腔，用适量生理盐水冲洗小鼠内脏。
c)用胶头滴管吸取生理盐水冲洗液，滴于洁净的载玻片上，注意不要涂抹，每个载玻片各滴两滴，注意做好编号与正反标记。
d)将载玻片置于有U形玻璃支架的大型培养皿中。
培养皿在4摄氏度的冷藏柜中放置30min。
用吸水纸吸去多余生理盐水，注意不要让细胞完全干燥。
2.酶的反应将玻片置于37摄氏度的酸性磷酸酶工作液中，温浴30min。
生理盐水小心冲洗，吸去多余水分。
3.细胞的固定将玻片置于福尔马林-钙固定液的染缸中，固定5min。
蒸馏水冲洗，吸去多余水分。
4.显色a)2%硫化铵溶液中处理3~5min，取出载玻片，用蒸馏水漂洗。
巨噬细胞功能检测讲解学习
巨噬细胞功能检测讲解学习巨噬细胞功能检测单核－巨噬细胞吞噬功能测定单核－巨噬细胞在机体免疫反应中起着重要作用，因此，检测单核－巨噬细胞功能对于了解机体的免疫功能状态具有重要意义。
小鼠巨噬细胞吞噬功能试验（体外法）1、原理巨噬细胞具有吞噬异物的功能，将巨噬细胞与被吞噬物(鸡红细胞、白色念珠菌、白色葡萄球菌等)共同温育，染色，在油镜下计数吞噬异物的巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数，以此判断巨噬细胞的吞噬功能，从而评价机体的免疫状态。
2、方法(1)．小鼠巨噬细胞制备实验前三天每只小鼠腹腔注射1％可溶性淀粉1 ml。
实验时眼球放血、断椎处死小鼠，碘酒、洒精消毒皮肤，剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪开一小口(注意避开血管)用生理盐水(或1640)灌注腹腔，收集腹腔液于试管中(约4 ml)，1500 r/min，离心10 min，去上清，沉积细胞用生理盐水(或1640)洗二次，离心转速、时间同上。
最后沉积细胞用含10％小牛血清1640配成适当浓度备用(1~2×106／ml)。
(2)被吞噬物的制备1）．鸡红细胞制备从鸡翼下抽取静脉血，加入5倍量Alsever液(2.05 g葡萄糖，0.42 g NaCl，0.8 g枸橼酸钠5H2O、0.55 g枸椽酸，加双蒸水到100 ml，加热溶解后过滤分装，8磅高压灭菌，4℃保存)，置4℃可以保存1个月。
用前取适量鸡红细胞悬液，用PBS洗涤二次后配成1％的浓度备用。
2）．白色念珠菌制备将白色念珠菌接种于沙氏平皿培养基中，培养48小时，收集菌，用适量生理盐水配成悬液，100℃，煮沸30 min 灭活，离心去掉上清，再用1％美兰染色30 min，用生理盐水洗涤二次，用生理盐水配成1×108／ml菌悬液，4℃冰箱保存备用。
3、操作取巨噬细胞0.5 ml加1％鸡红细胞或l×l08／ml白色念珠菌悬液0.5ml，置37℃温育30min。
取2滴混合液置玻片上加盖玻片，在高倍镜下观察计数，或离心1000r／min,10min，取细胞沉淀混悬液制成涂片，甲醇固定，姬姆萨染色、油镜观察计数。
实验八巨噬细胞吞噬现象的观察
实验八巨噬细胞吞噬现象的观察
一、实验原理
巨噬细胞由骨髓干细胞分化生成, 然后进入血液到达各组织内, 并进一步分化为各种巨噬细胞, 当病原微生物或其它异物侵入机体时, 能招引巨噬细胞, 而巨噬细胞又有趋化性, 能响应招引因子的招引, 产生活跃的变形运动, 主动向病原体和异物移行, 在接触到病原体和异物时, 即伸出伪足, 将之包围并内吞入胞质, 形成吞噬体, 继而细胞质中的初级溶酶体与吞噬泡发生融合, 形成吞噬性溶酶体, 通过其中水解酶等作用下, 将病原体杀死, 消化分解, 最后将不能消化的残渣排了出细胞外。
台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂, 台盼蓝染料进入细胞, 细胞变蓝, 即为坏死。
如果细胞膜完整, 细胞不为台盼蓝染色, 则为正常细胞或凋亡细胞。
此方法对反映细胞膜的完整性, 区别坏死细胞有一定的帮助。
二、实验步骤
1. 在小鼠腹腔注射6%淀粉肉汤（含台盼蓝）1ml。
2．24h后注射1%鸡红细胞悬液1ml, 轻按腹部使分散。
3. 20分钟后脱颈骨处死小鼠。
4. 开腹取腹腔液（慎防小鼠血污染）。
5．腹腔液滴于载玻片上, 盖上盖玻片。
6. 显微镜观察吞噬现象。
三、实验结果
四. 结果讨论。
巨噬细胞功能检测讲解学习
巨噬细胞功能检测单核－巨噬细胞吞噬功能测定单核－巨噬细胞在机体免疫反应中起着重要作用，因此，检测单核－巨噬细胞功能对于了解机体的免疫功能状态具有重要意义。
小鼠巨噬细胞吞噬功能试验（体外法）1、原理巨噬细胞具有吞噬异物的功能，将巨噬细胞与被吞噬物(鸡红细胞、白色念珠菌、白色葡萄球菌等)共同温育，染色，在油镜下计数吞噬异物的巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数，以此判断巨噬细胞的吞噬功能，从而评价机体的免疫状态。
2、方法(1)．小鼠巨噬细胞制备实验前三天每只小鼠腹腔注射1％可溶性淀粉1 ml。
实验时眼球放血、断椎处死小鼠，碘酒、洒精消毒皮肤，剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪开一小口(注意避开血管)用生理盐水(或1640)灌注腹腔，收集腹腔液于试管中(约4 ml)，1500 r/min，离心10 min，去上清，沉积细胞用生理盐水(或1640)洗二次，离心转速、时间同上。
最后沉积细胞用含10％小牛血清1640配成适当浓度备用(1~2×106／ml)。
(2)被吞噬物的制备1）．鸡红细胞制备从鸡翼下抽取静脉血，加入5倍量Alsever液(2.05 g葡萄糖，0.42 g NaCl，0.8 g枸橼酸钠5H2O、0.55 g枸椽酸，加双蒸水到100 ml，加热溶解后过滤分装，8磅高压灭菌，4℃保存)，置4℃可以保存1个月。
用前取适量鸡红细胞悬液，用PBS洗涤二次后配成1％的浓度备用。
2）．白色念珠菌制备将白色念珠菌接种于沙氏平皿培养基中，培养48小时，收集菌，用适量生理盐水配成悬液，100℃，煮沸30 min灭活，离心去掉上清，再用1％美兰染色30 min，用生理盐水洗涤二次，用生理盐水配成1×108／ml菌悬液，4℃冰箱保存备用。
3、操作取巨噬细胞0.5 ml加1％鸡红细胞或l×l08／ml白色念珠菌悬液0.5ml，置37℃温育30min。
取2滴混合液置玻片上加盖玻片，在高倍镜下观察计数，或离心1000r／min,10min，取细胞沉淀混悬液制成涂片，甲醇固定，姬姆萨染色、油镜观察计数。
实验三、 细胞中酸性磷酸酶的定位
A液（0.2mol/L乙酸液）：冰醋酸1.2ml加蒸馏水100ml 。 B液（0.2mol/L乙酸钠液）：NaAc.3H2O 2.72g加蒸馏 水至１00毫升。 取A液３０毫升＋B液70毫升＋蒸馏水300毫升。 6)6%淀粉肉汤:牛肉膏0.3g ,蛋白胨1.0g,NaCl 0.5g,可溶性 淀粉６.0g，蒸馏水１00ml，煮沸灭菌，４℃保存，使 用时热水浴融化。 3.仪器、 用具：注射器、恒温水箱、显微镜、擦镜纸、 解剖盘、解剖剪、盖玻片、吸水纸。
七、实验报告及思考题
简图表示所观察到的酸性磷酸酶显示结果 和分布。 思考题 在制片的过程中为什么要采用冷冻涂片？ 简述巨噬细胞（MΦ）发育及MΦ分布？
在高等动物中存在大小两类吞噬细胞（巨噬细胞和嗜中性粒细 胞），专司吞噬作用，在细胞的非特异免疫功能中发挥重要作 用。 1.单核细胞 单核细胞来自骨髓的前单核细胞，发育成熟后释放到血液中。 血液中单核细胞已向全身各组织并进一步分化成各种组织的巨噬 细胞。血液中单核细胞为圆形或椭圆形，直径14-20微米，在形态 上很难和其他独核细胞相区分。胞质中含有嗜天青颗粒，它是一 种溶酶体，其中含有过氧化物酶，酸性磷酸酶，非特异性酯酶和 溶菌酶等，这些酶与单核细胞的杀伤和消化功能有关。单核吞噬 细胞在血液中约占白细胞的1%-3%，其在血液中的半衰期约为810个小时，一旦进入组织分化为巨噬细胞后，其生命周期可长达 数月至数年。
实验三、 细胞中酸性磷酸酶的定位
一、实验目的
1.了解并掌握酸性磷酸酶定位的原理及操作 步骤。 2.观察酸性磷酸酶在细胞中的分布。
二、实验原理
酸性磷酸酶（ACP）是溶酶体的特征性酶，主要 存在于巨噬细胞,定位于溶酶体内。正常条件下,巨 噬细胞处于休止状态,酶活性很低。但在合适的pH 条件下，经过活化，其形态、代谢和功能上表现 出一系列显著的变化， 如膜活性增高和酸性磷酸 酶活性增强，从而改变其渗透性底物可以渗入,酶 活力被显示。
实验三 酸性磷酸酶的显示方法2007.9.10
1
实验三 酸性磷酸酶的显示方法
一、实验原理
酸性磷酸酶分解磷酸脂而释放出磷酸基。
在PH5.0的环境中，磷酸基与铅盐反应形成磷酸铅。
但磷酸铅是无色的，所以再与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀，由此就能显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。
二、实验步骤
1.取洋葱内表皮（1cm ×0.6cm 每瓶放3片）沉于10%中性富尔马林液中，4℃下
固定30分钟，（置冰箱贮藏室），对照实验置50℃烘箱中。
（加液至青霉素瓶1/3体积）
2.去福尔马林液，自来水漂洗5分钟。
（青霉素瓶水加满，换3次）
3.去水，加酸性磷酶作用液，室温下置30分钟。
（加液至青霉素瓶1/3体积）
4.去作用液，自来水漂洗10分钟。
（青霉素瓶水加满，换3次）
5.去水，加1%硫化铵处理3-5分钟。
（加液至青霉素瓶1/3体积）
6.去硫化铵，加水漂洗。
（青霉素瓶水加满，换1次）
7.置载玻片上，加盖玻片。
8.显微镜观察（注意液泡中标黑色的小颗粒，表示有酸性磷酸酶的活力）。
三、实验结果（画酸性磷酸酶在细胞中的分布图）
四、结果讨论。
实验八酸性磷酸酯酶活力的测定
实验八-酸性磷酸酯酶活力的测定实验目的通过对酶促反应速度的测定，计算出酶的活力，掌握可见分光光度计的使用。
实验原理酸性磷酸酯酶（Acid Phosphatase，E．C．3．1．3．2．）存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一水解磷酸单酯键。
本实验选用绿豆芽的酸性磷酸酯酶为材料，磷酸苯二钠为底物。
磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解后生成酚和无机磷，其反应式如下：：由上式可见，当有足量的底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越高，所生成的产物酚和无机磷也越多。
根据酶活力单位的定义，在酶促反应的最适条件下每min生成1微摩尔（μmol）产物所需要的酶量为一个活力单位，因此可用Folin-酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的活力。
本实验所采用的是Folin-酚法。
实验操作检查试管内是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。
1.标准曲线的制作取试管6支，按0到5的顺序逐管编号，空白为0号。
按照表8-3-1，向各试管中依次加入0.4mmol/L酚标准应用液、0.2mol/L的pH5.6的乙酸盐缓冲液、1mol/L碳酸钠溶液和Folin-酚试剂，注意加样顺序不得搞错，否则显不了色。
摇匀，在35℃保温10min以上（先用烧杯盛35℃的水，置于水浴锅中，再将试管放入烧杯中保温，以防试管滑落入水中），参见实验八（2）的图8-2-4。
以0号试管为空白，在可见光分光光度计上680nm波长处读取各管的吸光度A680，以A680为横坐标、酚标准应用液的mL数为纵坐标作一条标准曲线，它应该是一条直线。
保留该数据，以便实验八（4）直接引用。
以上操作总结为表8-3-1。
表8-3-1标准曲线的制作试管123450.4mmol/L酚标准应用液（mL）0.10.20.30.40.50.2mol/L的pH5.6的乙酸盐缓冲液（mL）0.90.80.70.60.511mol/L碳酸钠溶液（mL）5Folin-酚试剂（mL）0.5摇匀，在35℃保温显色10min以上A680图8-3-7酶促反应加热操作2.酶活力的测定取2支试管，编号1＇、0＇，将0＇号试管作为空白。
实验5巨噬细胞酸性磷酸酶的显示
实验5 巨噬细胞酸性磷酸酶的显示姓名：李思露学号：131140040一、实验目的以小鼠腹腔巨噬细胞为材料，通过显示其溶酶体代表酶—酸性磷酸酶，学习酶细胞化学的一般原理及方法。
二、实验原理酸性磷酸酶是动物吞噬细胞溶酶体的标志性酶。
其能分解磷酸脂（常用β-甘油磷酸钠）而释放出磷酸基。
在pH5.0的环境中，磷酸基能与铅盐（硝酸铅，捕捉剂）反应形成无色的磷酸铅（微细沉淀，可在电镜下观察），再经过与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀（可在光镜下观察），以此显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。
三、实验材料、试剂及用品（一）材料小白鼠：6~8周龄小白鼠。
处理1：小鼠实验前2天，腹腔注射4%淀粉肉汤1 mL诱导及活化巨噬细胞；处理2：小鼠实验前2天，腹腔注射生理盐水1 mL。
（二）试剂（1）4％淀粉肉汤：牛肉膏0.3g,蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，可溶性淀粉4g，蒸馏水100mL，高压蒸汽灭菌20min，保存于4℃冰箱。
（2）10％中性福尔马林（pH6.8~7.1）。
（3）酸性磷酸酶作用液（现配）：蒸馏水90mL，0.2mol/L乙酸缓冲液（pH4.6）12mL,5%硝酸铅2mL,3.2%β-甘油磷酸钠4mL。
配法：先将蒸馏水和乙酸缓冲液混合，随后成分大致相等的2份，向其中一份加硝酸铅溶液混匀，向另一份加β-甘油磷酸钠溶液混匀；然后将其中一份溶液缓缓加入另一份溶液中，且边加边用玻璃棒搅拌。
用乙酸调pH为4.8~5.0。
注意：配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀；最好在临用前配制，不能储存。
（4）1％硫化铵溶液。
（三）用品水浴箱（50℃，37℃）、低温冰箱、普通光学显微镜、小剪刀、5mL一次性注射器、10mL玻璃离心管、试管架、胶头滴管、载玻片染色盒（缸）、5片装玻璃染色缸、载玻片。
四、实验操作1.巨噬细胞：腹腔注射生理盐水2mL，3min后抽取腹腔液。
2.细胞黏附及酶灭活：每人3片，标示1、2、3。
在1和2中央位置滴加处理1小鼠腹腔液2~3滴，在3中央位置滴加处理2小鼠腹腔液2~3滴；将1和3置4℃冰箱黏附30min，将2置湿盒（铺有数层湿纱布的不锈钢饭盒）内，50℃水浴或恒温箱30min，灭活酸性磷酸酶。
实验八-5酸性磷酸酯酶分子量的测定--SDS-PAGE电泳法
（6）凝胶孔径可调节，根据被分离物的相对分子质量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；
（7）分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。
凝胶浓度的选择与被分离物质的相对分子质量密切相关，本实验采用垂直平板形式以不连续系统的SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，凝胶浓度为10%。
用100μL微量注射器取15μL处理过的蛋白质溶液，点到点样孔中。marker标准蛋白质溶液点在正中央的点样孔中，待测蛋白质溶液分别点到左、右两边的点样孔中，注意要有间隔，每人记住自己的点样位置，
5.电泳
向电泳槽的内槽加入电极缓冲液使其溢出而流到外槽，使外槽中的电极缓冲液液面高度约为5厘米左右。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成，浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.8的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.8 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
实验结果
用数码相机拍摄电泳图谱，并打印出来贴在实验报告上，参见图8-5-15。再由图8-5-16给出的标准marker蛋白的电泳图谱及其对应相对分子质量，参照酸性磷酸酯酶的相对分子质量55000±5000，在样品电泳图谱中判断样品中是否含有酸性磷酸酯酶，是否含有杂蛋白，并由区带色泽深浅推测酸性磷酸酯酶和杂蛋白的相对量。请直接在电泳图谱上标明上述结论，包括组分名称（如酸性磷酸酯酶和杂蛋白）和相对分子质量范围。注意，样品实际电泳图谱中标准marker蛋白最上面的区带是相对分子质量为116.0KDa的β-半乳糖苷酶。
细胞生物学实验手册：酸性磷酸酶的显示
实验十五酸性磷酸酶的显示
【实验目的】
了解Gomori硝酸铅改良法显示细胞内酸性磷酸酶的方法和原理
【实验用品】
一、材料 427细胞
一、器材温箱、冰箱、显微镜、乳头吸管
三、试剂冷丙酮或95％乙醇，Gomori硝酸铅作用液，2％甲基绿、1％硫化铵
【实验内容】
一、原理
酸性磷酸酶广泛存在于各种动物组织细胞，以前列腺、肝及脾含量最丰富。
酸性磷酸酶在组织的退变过程中活性增强。
在大部分组织中，它主要存在于溶酶体内，在溶酶体膜稳定完整时底物不易渗入溶酶体中，溶酶体内的酸性磷酸酶活力微弱或无活性。
细胞经固定后，在合适的pH条件下，膜变得不稳定而改变其透性，底物渗透入溶酶体中，酶显现活力。
故在研究溶酶体异常时有意义。
Gomori硝酸铅改良法是根据：以磷酸酯为底物，其被磷酸酶水解后释放出磷酸基，在pH5左右和铅盐结合成磷酸铅盐，但磷酸铅无色，须经硫化铵作用使其变成棕黄色至棕黑色的硫化铅沉淀。
二、方法
1．将培养的427细胞在冷丙酮或95％乙醇中固定15～30分钟。
2．待片干燥。
3．移入已预热(37℃)的作用液中孵育2小时。
4．蒸馏水洗。
5．移入2％醋酸酸化1分钟，蒸馏水快速漂洗。
6．移入l％硫化铵1分钟，自来水漂洗数次。
7．必要时用甲基绿复染。
三、结果观察
酸性磷酸酶活性结构呈棕黄色至棕黑色。
实验内容提要巨噬细胞的原代培养与活性鉴定(8 学时)
教案课程名称细胞生物学实验授课题目（章、节）实验七：巨噬细胞的原代培养与活性鉴定授课老师刘庆平授课对象2002级生物工程授课时间第十一、二周教学方法实验教学选用教具实验实验内容提要：巨噬细胞的原代培养与活性鉴定（8学时）第一节第一节实验介绍20分钟（一）、实验原理；（二）、实验目的；（三）、实验用品；（四）、实验方法和过程；（五）、实验结果分析；（六）、显微摄影；第二节．实验操作160分钟教学重点、难点及基本要求：重点及难点：巨噬细胞培养获得成功的基本要素。
基本要求：体外巨噬细胞株的培养的目的是使学生了解组织培养技术包括组织培养基本概念和发展简史、组织培养细胞生物学、培养细胞生存环境、条件和代谢以及体外培养细胞成功率的分析等基本的理论知识，学习和掌握细胞培养的基本技术包括培养用液的配制及其酸碱度的调节、清洗与消毒、细胞消化、计数及组织培养技术的基本操作和培养技术。
教研室主任意见：单元教学小结（经验效果、问题、改进措施、信息反馈等）本教案以讲授一个单元（2-4学时）一次实验（实习）为单位填写。
填写要用钢笔。
字迹要清晰、工整。
按表项目逐一填写。
实验二巨噬细胞的原代培养与活性鉴定（综合性实验8学时）一、原代培养：实验目的：细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断的生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育等过程的观察。
因而细胞培养是探索和显示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离了生物机体后的一些变化。
细胞培养技术目前已广泛的被应用于生物学的各个领域，如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等。
实验六酸性磷酸酶的显示
学习酸性磷酸酶的显示方法
酸性磷酸酶的显示方法有多种，包括 化学染色法、荧光染色法、同位素示 踪法等。
其中，化学染色法是最常用的一种方 法，通过特定的化学反应将酸性磷酸 酶催化生成的磷酸酯与特定的指示剂 结合，从而显示出酶的活性。
掌握实验操作流程
实验操作流程包括组织或细胞的处理、酶反应、结果观察等 步骤。
的转移和代谢。
在骨组织中，酸性磷酸酶参与骨质的矿化和骨细胞的凋亡过程。
03
显示酸性磷酸酶的化学反应原理
01
02
03
在酸性条件下，酸性磷 酸酶能够催化磷酸单酯 水解，释放出无机磷酸
。
无机磷酸与染色剂（如 茜素红、甲苯胺蓝等） 反应，生成有色产物， 从而显示出酸性磷酸酶
的存在。
染色剂的颜色变化与无 机磷酸的浓度呈正比关 系，因此可以通过观察 颜色变化来判断酸性磷
02 了解其活性调节的分子机制，为药物设计和疾病治疗
提供理论支持。
发展新型酸性磷酸酶显示技术
03
针对现有技术的不足，开发更加灵敏、特异和便捷的
显示方法。
感谢您的观看
THANKS
实验技能提升
通过本次实验，我掌握了酸性磷酸酶的显示方法，提高了实验操作 技能和实验数据分析能力。
理论知识应用
实验过程中，我深刻体会到了理论知识与实际应用的结合，加深了 对相关酶学反应的理解。
团队合作意识
实验需要多人协作完成，锻炼了我的团队协作意识和沟通能力。
实验不足与改进建议
实验操作细节需优化
在实验过程中，我发现有些操作步骤不够严谨，影响了实验结果的可重复性。未来应更 加注重操作的规范性和细节处理。
在实验操作过程中，需要注意实验条件、试剂浓度、反应时 间等因素对实验结果的影响，确保实验结果的准确性和可靠 性。
酸性磷酸酶显示方法的研究
酸性磷酸酶显⽰⽅法的研究鸡肝酸性磷酸酶显⽰⽅法的研究酸性磷酸酶(acid phosphatase ACP)是指⼀组⾮特异性磷酸酯酶，在酸性条件下能⽔解各种磷酸脂。
ACP分布⼴泛，它能够催化磷酸单酯键的⽔解并释放⽆机磷酸，是⽣物磷代谢的重要酶类，ACP活性的⾼低与⼈和动物的病理状态密切相关。
酸性磷酸酶是溶酶体的标志酶。
溶酶体作为细胞内起消化功能的细胞器，含有⼤量酸性⽔解酶，在细胞内外物质代谢过程中起着⼗分重要的作⽤。
ACP的活性变化直接体现溶酶体的功能状态[1]。
在⼤部分组织中，它主要定位于溶酶体内。
在溶酶体膜完整时，底物不易渗⼊，ACP活⼒微弱或⽆活性。
经固定后，在合适的pH条件下，膜本⾝变得不稳定，逐渐改变其渗透性，底物可以渗⼊，酶活⼒被显⽰。
此酶在pH5.0的环境中发⽣作⽤，分解磷酸脂⽽释放出磷酸基，磷酸基能与铅盐反应形成磷酸铅。
但因其是⽆⾊的，所以再经过与硫化铵作⽤，形成棕⿊⾊的硫化铅沉淀，由此就能显⽰酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布[2]。
国内外也发布不少有关酸性磷酸酶在细胞中的定位研究的报道，例如：⽯长应等[3]已经利⽤电镜酶细胞化学⽅法，对⼤尾柱⾍(Urostyln grandis)、冠突伪尾柱⾍(Pseudorostyld cristata)、魏⽒拟尾柱(Paraurostyla weissei)三种纤⽑⾍细胞内的酸性磷酸酶进⾏了定位观察。
发现在它们体内ACPase的阳性反应颗粒除分布在消化腔隙内独⽴的泡状结构上和被消化的⾷物组织中外，在细胞质中的⼩圆泡内也有分布。
近年来研究⼈员应⽤超微结构酶细胞化学技术研究了家蚕幼⾍中肠ACPase活性的亚细胞分布[4]，结果表明ACPase主要分布在圆筒形细胞的细胞核内，核周围的内质⽹及溶酶体中，杯形细胞的细胞核，细胞底部的内褶膜上也有少量的酶活性存在。
采⽤酶组织化学⽅法，孙建梅等[5]⾸次报道了ACP在⽂昌鱼组织中分布。
ACP在⽂昌鱼组织中分布⼴泛，在表⽪、消化道及⽣殖腺中均有分布。
巨噬细胞酸性磷酸酶的显示
巨噬细胞酸性磷酸酶的显示一、实验目的以小鼠腹腔巨噬细胞为材料，通过显示其溶酶体代表酶—酸性磷酸酶，学习酶细胞化学的一般原理及方法。
二、实验原理酸性磷酸酶能分解磷酸脂（常用β-甘油磷酸钠）而释放出磷酸基。
在pH5.0的环境中，磷酸基能与铅盐（硝酸铅，捕捉剂）反应形成无色的磷酸铅（微细沉淀，可在电镜下观察），再经过与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀（可在光镜下观察），以此显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。
三、实验仪器及试剂a)小白鼠：实验前2天，一部分腹腔注射4%淀粉肉汤1 mL诱导及活化巨噬细胞，另一部分不作处理。
b)试剂：4％淀粉肉汤，10％中性福尔马林（pH6.8~7.1），酸性磷酸酶作用液（现配），1％硫化铵溶液。
c)水浴箱（50℃，37℃）、低温冰箱、普通光学显微镜，小剪刀、5mL一次性注射器、10mL玻璃离心管、试管架、塑料滴管、载玻片染色盒（缸）、自制湿盒、塑料培养皿、盖玻片、载玻片。
四、实验步骤a)巨噬细胞收集：分别用脱颈法处死一只腹腔注射4％淀粉肉汤1mL的小鼠和一只不注射的小鼠。
然后都在腹腔注入2mL生理盐水，揉匀；剪开腹部皮肤，暴露腹膜；用带针头的注射器插进腹腔吸取腹腔液。
b)细胞黏附：对于注射了淀粉肉末的小鼠腹腔液一组共做6片，每片2~3滴，其中放入4℃冰箱黏附30min的每人一片；而放入湿盒内，50℃水浴30min，灭活酸性磷酸酶的则2人一片。
对于未注射淀粉肉末的小鼠腹腔液则只做置于4℃下的4个片子即可。
c)固定：将所有载玻片置于放有预冷的10％中性福尔马林的缸内在4℃冰箱中固定30min。
d)自来水漂洗并浸于自来水中5min。
e)加酸性磷酸酶作用液反应：再将水甩干，每个装片加入足量的酸性磷酸酶作用液，放在37℃的水浴锅中反应30min。
f)用自来水漂洗片刻。
g)加硫化铵反应：在通风橱中，加入1%硫化铵溶液后反应10min。
h)在通风橱中自来水冲洗。
i)带水加盖玻片显微观察。
实验八酸性磷酸酯酶活力的测定
实验八-酸性磷酸酯酶活力的测定实验目的通过对酶促反应速度的测定，计算出酶的活力，掌握可见分光光度计的使用。
实验原理酸性磷酸酯酶（Acid Phosphatase，E．C．3．1．3．2．）存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一水解磷酸单酯键。
本实验选用绿豆芽的酸性磷酸酯酶为材料，磷酸苯二钠为底物。
磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解后生成酚和无机磷，其反应式如下：：由上式可见，当有足量的底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越高，所生成的产物酚和无机磷也越多。
根据酶活力单位的定义，在酶促反应的最适条件下每min生成1微摩尔（μmol）产物所需要的酶量为一个活力单位，因此可用Folin-酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的活力。
本实验所采用的是Folin-酚法。
实验操作检查试管内是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。
1.标准曲线的制作取试管6支，按0到5的顺序逐管编号，空白为0号。
按照表8-3-1，向各试管中依次加入0.4mmol/L酚标准应用液、0.2mol/L的pH5.6的乙酸盐缓冲液、1mol/L碳酸钠溶液和Folin-酚试剂，注意加样顺序不得搞错，否则显不了色。
摇匀，在35℃保温10min以上（先用烧杯盛35℃的水，置于水浴锅中，再将试管放入烧杯中保温，以防试管滑落入水中），参见实验八（2）的图8-2-4。
以0号试管为空白，在可见光分光光度计上680nm波长处读取各管的吸光度A680，以A680为横坐标、酚标准应用液的mL数为纵坐标作一条标准曲线，它应该是一条直线。
保留该数据，以便实验八（4）直接引用。
以上操作总结为表8-3-1。
表8-3-1标准曲线的制作试管123450.4mmol/L酚标准应用液（mL）0.10.20.30.40.50.2mol/L的pH5.6的乙酸盐缓冲液（mL）0.90.80.70.60.511mol/L碳酸钠溶液（mL）5Folin-酚试剂（mL）0.5摇匀，在35℃保温显色10min以上A680图8-3-7酶促反应加热操作2.酶活力的测定取2支试管，编号1＇、0＇，将0＇号试管作为空白。
实验三、 细胞中酸性磷酸酶的定位
在高等动物中存在大小两类吞噬细胞（巨噬细胞和嗜中性粒细 胞），专司吞噬作用，在细胞的非特异免疫功能中发挥重要作 用。 1.单核细胞 单核细胞来自骨髓的前单核细胞，发育成熟后释放到血液中。 血液中单核细胞已向全身各组织并进一步分化成各种组织的巨噬 细胞。血液中单核细胞为圆形或椭圆形，直径14-20微米，在形态 上很难和其他独核细胞相区分。胞质中含有嗜天青颗粒，它是一 种溶酶体，其中含有过氧化物酶，酸性磷酸酶，非特异性酯酶和 溶菌酶等，这些酶与单核细胞的杀伤和消化功能有关。单核吞噬 细胞在血液中约占白细胞的1%-3%，其在血液中的半衰期约为810个小时，一旦进入组织分化为巨噬细胞后，其生命周期可长达 数月至数年。
通常酸性磷酸酶在pH5.0左右发生作用，能分解磷 酸酯而释放出磷酸基，磷酸基能与铅盐反应形成磷 酸铅沉淀物。但因其是无色的，需再经过与硫化铵 作用，形成棕黄到棕黑色的硫化铅沉淀，由此能显 示酸性磷酸酶在细胞中的存在与分布。
反应如下：
β-甘油磷酸钠---β- 甘油 +PO4 3PO43-+Pb(NO3)2 -----Pb3(PO4)2（沉淀） Pb3(PO4)2 +(NH4)2S----PbS (棕黑色)
2.巨噬细胞的特性
组织中的巨噬细胞则呈显著的多形性，在培养条件下对塑料或 玻璃表面具有极强的粘附性，一次可利用这一特性分离巨噬细 胞并与非粘附性细胞分开，但其作用机制不详。巨噬细胞在体 内可借其表面粘附分子与其它细胞或细胞外基质黏附在一起。 巨噬细胞的另一特性是对异物通过不同机制具有吞噬作用 （phagocytosis）,吞饮（endocytosis）或胞饮作用 （pinocytosis）。可将异物吞入胞内，并借其胞浆内的大量液 泡及颗粒中的内含物和代谢产物将吞入的异物降解，消化和清 除。
巨噬细胞酸性磷酸酶的显示
巨噬细胞酸性磷酸酶的显示一、实验目的以小鼠腹腔巨噬细胞为材料，通过显示其溶酶体代表酶—酸性磷酸酶，学习酶细胞化学的一般原理及方法。
二、实验原理酸性磷酸酶能分解磷酸脂（常用β-甘油磷酸钠）而释放出磷酸基。
在pH5.0的环境中，磷酸基能与铅盐（硝酸铅，捕捉剂）反应形成无色的磷酸铅（微细沉淀，可在电镜下观察），再经过与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀（可在光镜下观察），以此显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。
三、实验仪器及试剂a)小白鼠：实验前2天，一部分腹腔注射4%淀粉肉汤1 mL诱导及活化巨噬细胞，另一部分不作处理。
b)试剂：4％淀粉肉汤，10％中性福尔马林（pH6.8~7.1），酸性磷酸酶作用液（现配），1％硫化铵溶液。
c)水浴箱（50℃，37℃）、低温冰箱、普通光学显微镜，小剪刀、5mL一次性注射器、10mL玻璃离心管、试管架、塑料滴管、载玻片染色盒（缸）、自制湿盒、塑料培养皿、盖玻片、载玻片。
四、实验步骤a)巨噬细胞收集：分别用脱颈法处死一只腹腔注射4％淀粉肉汤1mL的小鼠和一只不注射的小鼠。
然后都在腹腔注入2mL生理盐水，揉匀；剪开腹部皮肤，暴露腹膜；用带针头的注射器插进腹腔吸取腹腔液。
b)细胞黏附：对于注射了淀粉肉末的小鼠腹腔液一组共做6片，每片2~3滴，其中放入4℃冰箱黏附30min的每人一片；而放入湿盒内，50℃水浴30min，灭活酸性磷酸酶的则2人一片。
对于未注射淀粉肉末的小鼠腹腔液则只做置于4℃下的4个片子即可。
c)固定：将所有载玻片置于放有预冷的10％中性福尔马林的缸内在4℃冰箱中固定30min。
d)自来水漂洗并浸于自来水中5min。
e)加酸性磷酸酶作用液反应：再将水甩干，每个装片加入足量的酸性磷酸酶作用液，放在37℃的水浴锅中反应30min。
f)用自来水漂洗片刻。
g)加硫化铵反应：在通风橱中，加入1%硫化铵溶液后反应10min。
h)在通风橱中自来水冲洗。
i)带水加盖玻片显微观察。
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作业
1、比较对照标本与正常处理标本结果的不同 2、比较吞噬活性强的大体积巨噬细胞和吞噬活
性弱的小体积巨噬细胞酸性磷酸酶的分布与活 性
蒸馏水
0．2mol／L醋酸缓冲液(pH4．6)
5％硝酸铅 3.2％β—甘油磷酸钠
90ml
12ml
2ml 4ml
配法：先将蒸馏水和醋酸缓冲液混合，随后分成大致相等的两份， 一份中加硝酸铅溶液，另一份加甘油磷酸钠溶液，然后再将两者 缓缓混合，边混边搅匀。 若pH不到5．0，可加少量醋酸的调整。 注意：配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀； 最好在临用 前配制，不能贮存。
附：0．2mol／L醋酸缓冲液（pH4．6）配制方法
0.2mol/l醋酸（ml） 25.5
0.2mol/l醋酸钠（ml）24.5
4、1％硫化铵溶液 硫化胺 1ml 蒸馏水 9ml
5、姬姆萨染液（1：30）
姬姆萨原液
3滴
磷酸盐缓冲液（pH6．8） 5ml
实验方法
1、巨噬细胞诱导：实验前2天开始，每日向小鼠腹腔注射6 ％淀粉肉汤1ml，连续注射3天。
酶的显示法是通过显示酶的活性来表明酶的存 在，而不是酶的本身。
将具有酶活性的组织放人含有一定底物的溶液 中孵育，底物经酶的作用形成初级反应产物， 它再与某种捕捉剂相反应，形成显微镜下可视 性沉淀，即最终反应产物。
4．核酸显示法
显示DNA的传统方法为Feulgen反应。
切片DNA经弱酸(1mol/LHcl)水解, 其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的 键打开,使脱氧核糖的一端形成游 离的醛基,这些醛基在原位与 Schiff试剂(无色品红亚硫酸钠溶 液)反应,形成紫红色的化合物,使 细胞内含有DNA的部位呈紫红色 阳性反应.紫红色的产生,是由于反 应产物的分子内含有醌基,醌基是 发色团,因此具有颜色.
实验八、巨噬细胞酸性磷 酸酶显示
组织化学（histochemistry）和细胞化 学（cytochemistry）
是在组织切片上或被检材料上，加一定试剂， 使它与组织或细胞中待检物质发生化学反应成 为有色沉淀物，以用光镜观察，若为重金属沉 淀，可以用电镜观察，称电镜组织化学 （electron microscope histochemistry)。这种 方法可用于检测细胞内的酶类、糖类、脂类、 核酸与某些金属元素等。如进一步应用显微分 光光度计等测定标本中沉淀物的强度，则能较 精确地进行定量研究。
5、自来水漂洗5min，将水甩干。
6、加足量酸性磷酸酶作用液覆盖样品，放37℃ 水浴箱中反应30min。
7、自来水漂洗片刻。
9、在通风橱中加硫化铵反应10min。
10、自来水冲洗，甩干。
11、直接加PBS封片（或用1∶30的Giemsa染液 染色15min再封片）。
12、镜检
阳性标本细胞质中，出现许多棕色或棕黑色的 颗粒和斑块。
如用甲基绿-派若宁反应，可同时显 示细胞内的DNA和RNA。
甲基绿与细胞核中的DNA结合呈蓝绿 色，派若宁与核仁及胞质内的RNA结 合呈红色。
酸性磷酸酶显示实验原理
酸性磷酸酶能分解磷酸脂（常用β-甘油磷酸钠） 而释放出磷酸基。在pH5．0的环境中，磷酸 基能与铅盐（硝酸铅，捕捉剂）反应形成无色 的磷酸铅（微细沉淀，可在电镜下观察），再 经过与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀 （可在光镜下观察），以此显示酸性磷酸酶在 细胞内的存在与分布。
2、收集巨噬细胞： 在第三天注射后3～4h，再向腹腔注射 生理盐水1ml，过3min后抽取腹腔液。
3、粘附：将腹腔液滴在预冷的载玻片上，每人2片，每片 2～3滴，将玻片水平放到冰箱内（4℃），让细胞自行铺 展、粘附30min。 将其中1片样品置湿盒内放50℃温箱中30min，使酶失活
4、固定：将玻片插入盛有10％中性福尔马林（已预冷）的 染色缸内，冰箱内4℃固定30min。
实验材料：
小鼠腹腔液涂片（重点观察巨噬细胞）。
实验试剂及用品
1、6％淀粉肉汤
牛肉膏
0．3g
蛋白胨
1.0g
氯化钠
0．5g
可溶性ห้องสมุดไป่ตู้粉 6g
蒸馏水 100ml 高压灭菌9．9×104pa(15磅)20min 2、10％中性福尔马林(pH6．8～7．1)
甲醛 10ml
蒸馏水 90ml
醋酸钠 2g
3、酸性磷酸酶作用液 配方：
1. 糖类显示法
最常用的显示方法是过碘酸雪夫反应（periodic acid Schiff，PAS反应)。 基本原理是：糖被强氧化剂 过碘酸（HIO4)氧化后，形 成2-醛基；后者与Schiff试剂 中的无色品红亚硫酸复合物 结合，形成紫红色反应产 物,PAS反应阳性部位即表示 多糖的存在。
2. 酶类显示