实验三细菌的革兰氏染色(Gram stain)

大肠杆菌革兰氏染色
炭疽芽胞杆菌
五、实验报告
1．结果 ． 列表比较大肠杆菌、 列表比较大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和未知菌 的染色反应，并判断它们分别是G 的染色反应，并判断它们分别是 -或G+. 2．思考题 ． （1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？ ）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？ 其染色成败的关键一步是什么？ 其染色成败的关键一步是什么？ （2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时， ）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时， 怎样能确证你的染色技术操作正确， 怎样能确证你的染色技术操作正确，结果 可靠？ 可靠？
（5）干燥和镜检：干燥后，置油镜观察。革 ）干燥和镜检：干燥后，置油镜观察。 兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。 兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。 以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准， 以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准， 过于密集的细菌，常常呈假阳性。 过于密集的细菌，常常呈假阳性。 （6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽 ） 孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。 孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。
实验三 细菌的革兰氏染色 （Gram stain） stain）
一、目的要求 • 了解革兰氏染色的原理； 了解革兰氏染色的原理； • 学习并掌握革兰氏染色的方法。 学习并掌握革兰氏染色的方法。
二、基本原理
• 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。 • 它是 它是1884年由丹麦医师 年由丹麦医师Gram创立的。 创立的。 年由丹麦医师 创立的 • 革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌 革兰氏染色法（ ） 的形态而且还可将所有细菌区分为两大类： 的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色 反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌， 表示； 反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示； 表示 染色反应呈红色（复染颜色） 染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性 细菌， 表示。 细菌，用G-表示。 表示 • 细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细 细菌对于革兰氏染色的不同反应， 胞壁的成分和结构不同而造成的。 胞壁的成分和结构不同而造成的。
三、实验器材
• 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌、未知菌； 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌、未知菌； • 草酸铵结晶紫，番水水溶液，碘液， 草酸铵结晶紫，番水水溶液，碘液， 95%乙醇，载玻片，显微镜等。 乙醇， 乙醇 载玻片，
四、实验步骤
1．涂片：将培养24小时的大肠杆菌和 ．涂片：将培养 小时的大肠杆菌和 未知菌，培养12-18小时的枯草芽孢杆 未知菌，培养 小时的枯草芽孢杆 球菌、分别作涂片（ 球菌、分别作涂片（注意涂片切不可 过于浓厚），干燥、固定。 ），干燥 过于浓厚），干燥、固定。固定时通 过火焰1～ 次即可 不可过热， 次即可， 过火焰 ～2次即可，不可过热，以载 玻片不烫手为宜。 玻片不烫手为宜。
2．染色
（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟， ）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟， 水洗。 水洗。 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一 ）媒染：滴加碘液冲去残水， 分钟，水洗。 分钟，水洗。 （3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以 ）脱色：将载玻片上面的水甩净， 白背景， 白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚 ％ 不出现紫色时为止， 秒钟， 不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即 ～ 秒钟 用水冲净酒精。 用水冲净酒精。 分钟， （4）复染：用番红液染 ～2分钟，水洗。 ）复染：用番红液染1～ 分钟 水洗。
革兰阳性菌细胞壁特殊组分
膜磷壁酸 壁磷壁酸
革兰阴性菌细胞壁特殊组分
革兰阳性菌与阴性菌细胞壁结构比较
细胞壁 强度 厚度 肽聚糖层数 肽聚糖含量 磷壁酸 外膜 脂蛋白 脂多糖 革兰阳性菌 较坚韧 20-80nm 可多达50层 可多达 层 占细胞壁干重50%-80% 占细胞壁干重 + — — — 革兰阴性菌 较疏松 10-15nm 1-2层 层 占细胞壁干重5%-20% 占细胞壁干重 — + + +
肽聚糖(peptidoglycan) 肽聚糖
革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链、 革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥
N-乙酰葡糖胺 N-乙酰胞壁酸
溶菌酶作用点
青霉素作用点
肽聚糖(peptidoglycan) 肽聚糖
革兰阴性菌肽聚糖—聚糖骨架、 革兰阴性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链
• 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度， 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度， 如脱色过度，则阳性Leabharlann Baidu可被误染为阴性菌； 如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱 色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌 色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外， 龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长， 龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或 已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
• 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料 革兰氏染色需用四种不同的溶液： （basic dye）初染液；媒染剂 ）初染液； ）；脱色剂 （mordant）；脱色剂（decolorising ）；脱色剂（ agent）和复染液（counterstain）。 ）和复染液（ ）。 • 碱性染料初染液 碱性染料初染液——结晶紫（crystal 结晶紫（ 结晶紫 violet） ） • 媒染剂 媒染剂——碘（iodine） 碘 ） • 脱色剂——95％的酒精（ethanol） 脱色剂 ％的酒精（ ） • 复染液 复染液——番红 番红