植物实验

10g
酵母粉（YEAST）
5g
NaCl pH7.2 固体LB
10g 15g/L琼脂
感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态的制备 CaCl2法
1. 挑取大肠杆菌pH5.2，或JM109单菌落，接种+5mlLB液体培养基 上，37℃，180rpm过夜。
2. 取1ml菌液按1：100或1：10比例加入100ml或10mlLB培养基中 37℃，200rpm震荡培养基至OP600=0.5-0.6（约2.5-3h）
3. 将菌液100ml分装到离心管中，冰上放置10min 4. 4℃＜3000rpm，离心5min 5. 弃上清液加入1/3体积预冷0.1mCaCl2重悬沉淀（冰上操作），
按一个方向旋转，然后冰上放置1h 6. 4℃，3000rpm离心5min 7. 弃上清液，加入1/3体积预冷0.1m CaCl2重悬沉淀（冰上放置
摇大肠杆菌的最佳状态：大肠杆菌浊在4号字体上知道有字但不确定是 什么字为最佳。如果摇的是质粒应该再多摇1h。
培养基大全
诱导培养基（600ml量）调pH加KOH和HCl
N6
A
B
10×
100×
N6
＋ 30g/L 蔗糖
2.8g/L L-谷氨酸
0．3g/L 酪蛋白水合物
2mg/L 2，4-D
PH5.8
琼脂10g/L(变量)
D
E
F
50×
100× 100×
100× 100×
200×
30g/L蔗糖（未调之前pH4.3左右）
琼脂8.Hale Waihona Puke Baidug/L
调完后pH5.9
YEB培养基（酵母培养基）
总量
500ml
牛肉膏
2.5g
TRYPTONE
2.5g
YEAST
0.5g
蔗糖
2.5g
MgSO4
0.246g
Agar
0.75g/50ml（固体）
pH5.2
实验一：PCR
PCR体系:
15ul
10×Buffer：
1.5ul
dNTP:
1.2 ul
Mg2+:
0.3 ul
Sp(下):
0.3 ul
Asp（上）：
0.3 ul
模板：
0.6 ul（看浓度）
Rtaq（酶）:
0.12 ul
DdH2O:
10.7 ul
质粒跑出三条带的原因：高聚体——直链——开环结构不同，速度不
C 100×
D 100×
共培养基 诱导培养基 ＋ 20mg/L 乙酰丁香酮
筛选培养基 诱导培养基 ＋ 15mg/L 固沙草
100mg/L 除菌剂（阿莫西林）
（预（黑暗处理1w））分化培养基 （预）第一次正常除菌剂，第二
次减半
Ms
2mg/L
30g/L 蔗糖
Naa
0.02mg/L
生根培养基
Ms A
B
C
5) wash buffer，清洗所得物。
实验三：农杆菌的转化
功能分析
载体的构建 外质体准备
分子检测 移栽 驯化 生根 分化 预分化 筛选 除菌
共培养3-5 侵染
载体的构建： 1）载体的选择 2）筛选标记基因 3）药品除去未转细胞（不同的标记基因对应不同的药
品） 将多重位点切开再把自己的连上，cDNA无内含子。 侵染：人为的将菌和愈伤混合 共培养：3-5d质粒就可以转化到植物中。实际上是T-DNA区转化到植物 中。 除菌：在蔗糖条件或者是培养基条件下（维持一定的渗透压） 筛选：筛选有抗性的植株一般使用固沙草（即除草剂），阿莫西林 100mg/L（即除菌剂）
1h） 8. 4℃，3000rpm离心5min，弃上清用1/25体积预冷0.1m CaCl2重
悬沉淀 9. 分装小管，每EP管中放50ul 10. 每管加等体积30%甘油，混匀，-70℃备用，保存 准备：枪头，EP管，30%甘油灭菌放入冰箱，CB培养基，0.1m CaCl2
大肠杆菌转化
1. 100ul感受态+目的DNA，水浴30min(动作要轻)
甲烷=1:1吹打几次）动作要快否则会出现浑浊。取上清，加入三氯甲烷
（于除剩余的酚）400ul（1倍）在12000rpm下离心5-10min（中间的一
层要保留）。取上清，加入冰乙醇400-1000ul（2倍）4℃下20min，在
12000rpm离心10min。弃上清液，加入75%的冰乙醇（洗盐）500ul将质
同。
用于PCR反应的每条引物的长度通常为20-30个核苷酸。
实验二：质粒的提取（少量制备）
P1 100ul P2 200ul 现用现配/ml
H2O 750ul（轻）
5%SDS 200ul
4N 50ul
P3 150ul
静置5min，在12000rpm下离心10min动作要轻，然后取上清液加入3-饱
和酚400ul静置3-5min，再12000rpm下离心5min（或者加饱和酚：三氯
2. 42℃水浴90s
水浴30s
42℃水浴30s
3. 500ulLB 不需要加入抗生素，混匀 动物 SDS
4. 37℃ 100-120/h
植物 液N2
5. 涂板+抗生素
细菌 不用
6. 37℃过夜，倒置
农杆菌感受态的制备及冻融法转化 1. 感受态制备
1) 接种农杆菌单菌落+YEB5ml，28℃ 160-250rpm过夜 2) 取菌液20ul+50mlYEB至OD600=0.4 3) 水浴30min，分装1.5ml离心管，5000rpm，5min弃上清液， 100ul，0.02mol/L CaCl2重悬（或者接加2ml重悬） 4) 4℃，48h内用或-20℃保存备用。
配时pH5.5
蒸馏水
30g/L
注：高压消毒pH会降低0.3-0.5
1) 母液：多少倍，时间
2) 按序摆好，加完后，串格，定容
3) 调pH
注意
1L 5g
5g 1g 5g 0.493g
4) 加琼脂
顺序
5) 需加抗生素，先整体灭菌
不需加抗生素
灭菌后两天使用
LB培养基（大肠杆菌培养基）
总量
1L
蛋白胨(TRYPTONE)
筛选标记基因 5）28℃1-2d
植物实验的大致方法基本相似，原理也都较为相近。很多的步骤都是重 复多次，重要的是掌握知识的重点，以及严格的遵守实验章程。重在有 新的创想，联系各方面的生物知识，将有用的创新点应用于植物实验从 中收获更多。一定要拓宽视野，不要仅仅局限于植物这一方面。
粒或DNA弹起，12000rpm下离心5min。弃上清，甩干，加入RNase水溶液
（pH7.0）20ul，再37℃下保存即可。（用TE再做PCR时，多加Mg2+）。
一种配方 1) 先加A1，使菌液悬浮 2) B1,使细胞裂解（检查出现粘稠才可用，否则有杂菌不可用） 3) N1，使蛋白质析出 4) KB溶解蛋白（消化），滤出蛋白（过滤柱子对准中心悬空慢）
2. 冻融法转化 1) 2ulDNA+200ul感受态（或1ul+100ul）混匀，水浴5min+液N2， 8min（膜通透性发生改
变） 2）37℃，水浴融化 3）800ulYEB，28℃，250rpm，4-5h 4）涂板（固定YEB+50mg/L，利福平，50mg/L（链霉素 +100mg/L,Km）），3500rpm，4min菌的