第三章 核酸扩增技术课件

如加入酶切位点，用生物素、荧光素、地 高辛等标记，引入突变位点，引入启动子 序列，引入蛋白质结合DNA序列等。 现在位置 P171
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三、 反应条件
1、温度 ①变性温度：一般把变性温度定在95～97℃之 间，以使模板DNA和产物双链完全打开。 ②退火温度：退火温度决定PCR反应的特异性， 退火温度的设定取决于引物的Tm，通常PCR 的退火温度应低于引物Tm 5℃左右。 ③延伸温度：一般为72℃，在这个温度下 TaqDNA聚合酶具有较高的酶促活性，有利于 DNA的复制。
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基础知识
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基础知识
dNTP

dATP dCTP dGTP dTTP
dNTP
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第一节 聚合酶链式反应
PCR概念：在体外特异地复制一段已知 序列的DNA片段的过程。
现在位置 P169
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一、PCR的原理和反应过程
PCR反应重复进行DNA复制的过程，使DNA得 以扩增，每一次复制包括3个步骤：
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引物设计时必须遵循的原则
3. 二条引物之间（尤其在3’端）的序列
不可有互补，以免形成引物二聚体；
4. 引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤、
嘧啶碱基堆积。
①
C＋G的比例一般为45~55%。
现在位置 P171
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引物设计时必须遵循的原则
5. PCR扩增中的退火温度是根据引物的Tm
值而决定的，二条引物的Tm值不能差别 太大。 6. 根据需要，合成引物时在其5’端可以 加修饰成分
现在位置 P125
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PCR的基本反应过程
变性
95˚C
延伸 72˚C
现在位置 P170
退火
（40-70 ˚C） Tm-5˚C
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PCR的扩增效率
每一次循环后，一 分子模板被扩增为两 个分子 每个循环所产生的 DNA片段，即为下一 个循环的模板 PCR产物量以指数 形式增长 循环次数：0 产物数量：2 0
变性（denaturation）
退火（annealing） 延伸（extension）
现在位置 P125
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变性（denaturation）
将待复制的双链 DNA经加热至94℃～ 95 ℃）左右一定时间后，DNA双螺旋的
氢键断裂，使之成为单链分子，作为反
应的模板（template) ，以便它与引物
现在位置 P174
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（一）、逆转录PCR
逆转录PCR（reverse transcription PCR, RT-PCR）是
以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术。
由于耐热的DNA聚合酶不能以RNA或mRNA作为模板，因此
首先必须将总RNA或mRNA作逆转录，以生成与之互补的 cDNA，然后再以cDNA作为模板进行PCR扩增，得到所需的 目的基因片段。
RT-PCR主要用于克隆cDNA、合成cDNA探针、检测RNA病毒
和分析基因表达等。
现在位置 174
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（二）、巢式PCR
巢式PCR（nested PCR）是对靶基因进行二次扩
增。
二次扩增所用的引物不能相同，第二次扩增所用
的引物必须位于第一次扩增所用引物的内侧
先用第一对引物扩增出一个较大的片段，再用第
时间过长会降低扩增的特异性。
现在位置 P173
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3、循环次数
循环次数一般为20～45次。 PCR扩增效率呈S型曲线，有平台效应 平台效应的原因：

初始模板量 引物二聚体和反应产物抑制扩增 反应体系的组份被消耗 引物与模板DNA间竞争
现在位置 173
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四、PCR技术的质量控制
硬件方面

实验室规范化设置
软件方面

样本采集 核酸提取 扩增


产物分析
测定结果的报送
现在位置 P173
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（一）实验室的规范化设置
临床基因扩增检验实验室必须包括四个工作区域：

①试剂贮存和准备区；
②标本制备区； ③扩增反应区；
④产物分析区。
这四个区域必须互相独立，并严格按照上述顺序设置。 每一区域都必须配置专用仪器，所用物品、试剂和耗材不
第二步：

C－DNA->PCR
现在位置 P134
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（X）免疫PCR（immunoPCR,IPCR）
反应体系中4种核苷酸的浓度必须一致
四种核苷酸间浓度的不平衡会增加反应时DNA聚合酶错配 的机率。
浓度过高会加快反应速度，但导致非特异性扩增
降低在dNTP浓度会提高反应的特异性 一般为20~200umol/L
现在位置 P170
源自文库
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镁离子浓度
镁离子浓度在扩增反应中是一个至关重要的
原位PCR与普通PCR的主要区别在于模板的制备。
经脱蜡处理的组织切片或滴加在载玻片上的细胞悬
液都可作为扩增样品，所有步骤均在载玻片上进行。
现在位置 P134
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（六）原位PCR技术（in situ PCR）
进行PCR时，加入地高辛标记的的dUTP， 使扩增产物带有地高辛。PCR结束，加入酶标 抗地高辛抗体，再加入底物显色。
第三章
核酸扩增技术
Polymerase Chain Reaction techniques
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大纲要求：
掌握PCR的原理和反应过程 掌握PCR反应体系 掌握PCR产物的检测 熟悉实时荧光定量PCR的原理和方法 了解以PCR为基础的相关技术
Special
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二、教学内容
第一节 聚合酶链式反应 第二节 以PCR为基础的相关技术 第三节 PCR产物的检测 第X节 实时荧光定量PCR
结合，为下轮反应作准备；
现在位置 P170
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退火（annealing）
温度降低至寡核苷酸（oligonucleotide） 引物的融点温度以下（40～70℃），使引
物能与模板互补结合，形成杂交链；
现在位置 P125
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延伸（extension）
将温度升至72℃左右，使反应体系中的 DNA聚合酶按照模板链的序列以互补的方 式依次把dNTP加至引物的3’端，使杂交 双链不断延伸，以至形成新的DNA 双链。
1 21
2 2
2
3 …n 2 3… 2 n
现在位置 P170
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二、PCR体系基本组成成分
1. 2. 3. 4. 5.
模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
现在位置 P170
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二、PCR体系基本组成成分
1. 2. 3. 4. 5.
模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs 缓冲液
（Thermus aquaticus）中提取的，有很高的耐
热稳定性。TaqDNA聚合酶的作用是催化DNA合成， 即在模板指导下，以dNTP为原料，在引物的3’OH端,加上dNTP,在二者间生成3’ ，5’-磷酸二 酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸。 现在位置 P170
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dNTPs
即dATP、dCTP、dGTP和dTTP四种脱氧核苷三磷 酸的混合物。
现在位置 P172
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2、时间
PCR循环中每个步骤所需的时间取决于所扩增片段的长
度。
以长度为200～1000bp的扩增片段为例，循环中变性、
退火和延伸三个步骤的持续时间一般均为30秒～1分钟。
在模板（尤其是基因组DNA）进行第1次变性时应给予足
够长的时间（5～7分钟，根据变性温度高低而异）以使 模板彻底变性，然后再进入循环。
因素，因为镁离子对于反应系统本身、稳定核
苷酸和提高Taq DNA聚合酶的活性有直接的影
响。

Mg2+浓度过低使酶活力降低 Mg2+浓度过高又会使酶催化非特异性扩增。 一般为1.5mmol/L
现在位置 P172
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引物(Primer)
引物是化学合成的已知序列的寡核苷酸
(oligonucleotide)分子。
现在位置 P170
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模板(template)
模板就是将要被复制的核酸片段，
包括基因组DNA、RNA、质粒DNA和线
粒体DNA等。 在用 RNA作为模板时，须先将 RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为 PCR反应的模板进行扩增反应。
现在位置 P125
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耐热DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）是从一 种生活在热泉（80～90℃）中的水栖噬热菌
现在位置 P134
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（六）原位杂交PCR
原位杂交PCR与原位PCR的唯一区别：

扩增结束后，用寡核苷酸探针与扩增产物作原位 杂交。
现在位置 P134
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（七）差异显示PCR （defferential display PCR,DD-PCR）
一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达 差异的技术。 DD-PCR主要用于肿瘤和多种疾病的分子 遗传学研究，是目前筛选基因表达差异 最有效的方法。
现在位置 P169
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基础知识
遗传中心法则
RNA 复制 复制
DNA
转录 逆转录
RNA
翻译
蛋白质
现在位置 P169
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基础知识
+
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基础知识
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一、核酸分子杂交的基本原理
基础知识
DNA加热变性
DNA冷却复性
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基础知识
DNA变性(denaturation)
定义：在某些理化因素作用下，DNA分 子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有 序的双螺旋结构变为不规则无序的单链 线团样结构的过程。
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四、PCR的主要用途
（一）目的基因的克隆
（二）基因的体外突变
（三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析
现在位置 P
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第二节
以PCR为基础的相关技术
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以PCR为基础的相关技术
（一）逆转录PCR技术 （二）巢式 （三）定量PCR技术（＊＊＊＊＊） （四）多重PCR技术 （五）PCR诱导定点突变 （六）原位PCR技术 （七）差异显示PCR技术 （X）免疫PCR技术
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基础知识
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基础知识
melting temperature，
融解温度（Tm） 定义： 在DNA热变 性时，其A260 的升高达最大 值一半时的温 度。
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基础知识
DNA复性
定义：变性的单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过 程，称复性或杂交。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性， 此过程称为退火(annealing)。
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（五）PCR诱导定点突变
DNA重组技术使我们能够首先用各种方 法对克隆的DNA片段进行突变，在对产生 的突变作DNA序列分析以后，再对突变体 的特殊功能作进一步研究。
现在位置 P180
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（六）原位PCR技术（in situ PCR）
组织固定处理细胞内的DNA或RNA，并以其作为靶 序列进行PCR反应的过程称为原位PCR。
引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。
现在位置 P170
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引物设计时必须遵循的原则（6条）
1. 用于PCR反应的引物需要二条，分别设在 被扩增目标片段的二端，并分别与模板 正负链序列互补。 2. 引物的长度一般以18～25个核苷酸为宜
① 引物过长容易产生寡核苷酸的链内互补，形成发夹 状结构，
② 引物过短则会降低扩增的特异性； 现在位置 P171
得从某一个区域移至另一个区域使用。
现在位置 P174
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（二）PCR技术的质量保证
PCR技术用于临床检验的质量保证主要 涉及基因扩增检验全过程的质量保证、 室内质量控制和室间质量评价。
现在位置 P129
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（二）PCR技术的质量保证

样本采集 核酸提取 扩增


产物分析
测定结果的报送
现在位置 P129
现在位置 P182
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（X）免疫PCR（immunoPCR,IPCR）
结合PCR技术和抗原抗体反应 用于检测抗原（蛋白质） 固相载体上包被有抗体1
抗体2上标记有DNA，作为PCR的模板
现在位置 P134
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（X）免疫PCR（ImmunoPCR,IPCR）
第一步：

载体－抗体1->抗原<-抗体2－DNA（C－DNA）
二对引物进行第二次扩增
第二次扩增的模板是第一次扩增的产物
现在位置 174
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（二）、巢式PCR
要扩增的目标 基因
引物1 引物2 nest
现在位置 174
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（三）、定量PCR
相对定量PCR 定量PCR（实时荧光PCR）
现在位置 175
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（四）多重PCR技术
多重PCR（multiplex PCR）即在同一反应 体系中加入多对引物，以同时扩增一份DNA 样品中多个不同序列的靶片段。
现在位置 P179
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（四）多重PCR技术
多重PCR必须满足的两个条件：

PCR反应条件适合所有被扩增的DNA片段 同一反应内各扩增片段的大小应不同，以便检 测时能通过电泳将各片段充分分离
现在位置 P179
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（四）多重PCR技术
现在位置 P179
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（四）多重PCR技术
现在位置 P179