第三章 核酸扩增技术课件
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生物化学第三章核酸PPT课件
DNA与RNA结构差异
五碳糖不同
DNA中的五碳糖是脱氧核糖，而 RNA中的五碳糖是核糖。
碱基不同
DNA中的碱基包括腺嘌呤（A） 、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T） 和胞嘧啶（C），而RNA中的碱 基包括腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（ G）、尿嘧啶（U）和胞嘧啶（C
）。
空间结构不同
DNA通常是双链结构，而RNA 通常是单链结构。
核酸药物设计思路及前景展望
核酸药物设计思路
核酸药物是一类以核酸为靶点的药物，通过 特异性地与核酸结合，调节基因表达或抑制 病原体复制，从而达到治疗疾病的目的。设 计核酸药物时需要考虑靶点选择、药物稳定 性、特异性、安全性等因素。
前景展望
随着基因组学和生物信息学的发展，越来越 多的疾病相关基因和靶点被发现，为核酸药 物的研发提供了广阔的空间。未来，核酸药 物有望在肿瘤、遗传性疾病、病毒感染等领 域发挥重要作用，成为一类重要的治疗药物 。同时，随着技术的不断进步和成本的降低 ，核酸药物的研发和应用将更加普及和便捷
DNA拓扑异构酶的作用
拓扑异构酶能够改变DNA的超螺旋状态，从而调节DNA的拓扑结构和功能。拓扑异构酶 在DNA复制、转录、修复和重组等过程中发挥重要作用。
RNA结构与性质
03
tRNA三叶草结构特点
01
02
03
三叶草二级结构
由DHU环、反密码环、 TΨC环、额外环和可接受 茎组成，形似三叶草。
反密码环
人类基因组计划与意义
1 2 3
人类基因组计划的目标
破译人类全部遗传信息，解读人类基因组所蕴含 的生命奥秘。
研究成果及应用
揭示了人类基因组的组成、结构和功能，为医学 、生物技术和制药等领域提供了重要的科学基础 。
第三章核酸扩增技术课件
现在位置 P179
(四)多重PCR技术
多重PCR必须满足得两个条件:
PCR反应条件适合所有被扩增得DNA片段 同一反应内各扩增片段得大小应不同,以便检测
时能通过电泳将各片段充分分离
现在位置 P179
(四)多重PCR技术
现在位置 P179
(四)多重PCR技术
现在位置 P179
(五)PCR诱导定点突变
引物就是化学合成得已知序列得寡核苷酸
(oligonucleotide)分子。
引物决定PCR扩增产物得特异性和长度。
现在位置 P170
引物设计时必须遵循得原则(6条)
1. 用于PCR反应得引物需要二条,分别设在
被扩增目标片段得二端,并分别与模板正 负链序列互补。
2. 引物得长度一般以18～25个核苷酸为宜
① 引物过长容易产生寡核苷酸得链内互补,形成发夹状 结构,
② 引物过短则会降低扩增得特异性;
现在位置 P171
引物设计时必须遵循得原则
3. 二条引物之间(尤其在3’端)得序列不
可有互补,以免形成引物二聚体;
4. 引物得碱基组成应平衡,避免出现嘌呤、
嘧啶碱基堆积。
① C＋G得比例一般为45~55%。
融解温度(Tm) 定义:
在DNA热变 性时,其A260得 升高达最大值 一半时得温度。
基础知识
DNA复性
定义:变性得单链核酸分子在一定条件下按 碱基互补原则重新结合为双链核酸得过程, 称复性或杂交。
热变性得DNA经缓慢冷却后即可复性,此 过程称为退火(annealing)。
基பைடு நூலகம்知识
基础知识
dNTP
第三章核酸扩增技术课件
二、教学内容
第一节 聚合酶链式反应 第二节 以PCR为基础得相关技术 第三节 PCR产物得检测 第X节 实时荧光定量PCR
(四)多重PCR技术
多重PCR必须满足得两个条件:
PCR反应条件适合所有被扩增得DNA片段 同一反应内各扩增片段得大小应不同,以便检测
时能通过电泳将各片段充分分离
现在位置 P179
(四)多重PCR技术
现在位置 P179
(四)多重PCR技术
现在位置 P179
(五)PCR诱导定点突变
引物就是化学合成得已知序列得寡核苷酸
(oligonucleotide)分子。
引物决定PCR扩增产物得特异性和长度。
现在位置 P170
引物设计时必须遵循得原则(6条)
1. 用于PCR反应得引物需要二条,分别设在
被扩增目标片段得二端,并分别与模板正 负链序列互补。
2. 引物得长度一般以18～25个核苷酸为宜
① 引物过长容易产生寡核苷酸得链内互补,形成发夹状 结构,
② 引物过短则会降低扩增得特异性;
现在位置 P171
引物设计时必须遵循得原则
3. 二条引物之间(尤其在3’端)得序列不
可有互补,以免形成引物二聚体;
4. 引物得碱基组成应平衡,避免出现嘌呤、
嘧啶碱基堆积。
① C＋G得比例一般为45~55%。
融解温度(Tm) 定义:
在DNA热变 性时,其A260得 升高达最大值 一半时得温度。
基础知识
DNA复性
定义:变性得单链核酸分子在一定条件下按 碱基互补原则重新结合为双链核酸得过程, 称复性或杂交。
热变性得DNA经缓慢冷却后即可复性,此 过程称为退火(annealing)。
基பைடு நூலகம்知识
基础知识
dNTP
第三章核酸扩增技术课件
二、教学内容
第一节 聚合酶链式反应 第二节 以PCR为基础得相关技术 第三节 PCR产物得检测 第X节 实时荧光定量PCR
生物化学第三章核酸PPT课件
James Dewey Watson
Maurice Hugh Frederick Wilkins
DNA碱基组成的定量分析 20世纪40年代chargaff规则
① DNA碱基组成有种的特异性，但没有组织、器官特异性。 ② A=T；G=C；A+G=T+C
Watson-Crick model of double-helical DNA. One polynucleotide chain is shown in blue and the other in red. The purine and pyrimidine bases are shown in lighter colors than the sugar-phosphate backbone. (A) Axial view. The structure repeats along the helical axis (vertical) at intervals of 3.4 nm which corresponds to 10 nucleotides on each chain. (B) Radial view, looking down the helix axis.
Paintings of DNA models on a 'Millennium Collection' stamp, designed by Mark Curtis (1999–2000), from the UK Royal
Mail&tion
Spirals Time — Time Spirals by Charles Jencks
(2000) at Cold Spring Harbor Laboratory
A-DNA：
实验三PCR扩增制备目的基因PPT课件
生物信息学分析
利用生物信息学软件对PCR产 物进行序列比对、基因注释、
结构预测等分析。
结果解读与讨论
目的基因扩增成功与否
杂带和引物二聚体的处理
根据电泳结果判断目的基因是否成功扩增 ，如果没有扩增出目的基因或扩增效果不 佳，需要检查实验条件和引物设计。
如果电泳结果显示有杂带或引物二聚体， 需要优化PCR条件或重新设计引物，以确保 获得更纯净的目的基因产物。
10×PCR Buffer
04 提供PCR反应所需的离子环境
。
DNA模板
05 含有目的基因的DNA片段。
去Hale Waihona Puke 子水稀释PCR反应体系。06
设计引物
01
02
03
04
引物设计原则
选择合适的引物，确保引物与 目的基因的特异性结合，避免
非特异性扩增。
引物长度
通常为15-30个碱基。
引物序列
根据目的基因序列，利用引物 设计软件进行设计。
pcr 技术的应用领域
01
02
03
遗传疾病的诊断
通过PCR技术可以检测出 人类基因突变，从而对遗 传疾病进行诊断。
病原微生物检测
PCR技术可以快速、准确 地检测出细菌、病毒等病 原体，为疾病预防和控制 提供有力支持。
基因克隆和表达
通过PCR技术可以克隆出 目的基因，并在体外进行 表达和纯化，为基因工程 研究和应用提供基础。
05
pcr 扩增实验结果分析
结果分析方法
琼脂糖凝胶电泳
通过观察电泳结果，判断PCR 产物的大小是否与预期一致， 并判断是否有杂带或引物二聚
体。
测序验证
将PCR产物进行测序，与预期 的基因序列进行比对，验证 PCR产物的准确性。
利用生物信息学软件对PCR产 物进行序列比对、基因注释、
结构预测等分析。
结果解读与讨论
目的基因扩增成功与否
杂带和引物二聚体的处理
根据电泳结果判断目的基因是否成功扩增 ，如果没有扩增出目的基因或扩增效果不 佳，需要检查实验条件和引物设计。
如果电泳结果显示有杂带或引物二聚体， 需要优化PCR条件或重新设计引物，以确保 获得更纯净的目的基因产物。
10×PCR Buffer
04 提供PCR反应所需的离子环境
。
DNA模板
05 含有目的基因的DNA片段。
去Hale Waihona Puke 子水稀释PCR反应体系。06
设计引物
01
02
03
04
引物设计原则
选择合适的引物，确保引物与 目的基因的特异性结合，避免
非特异性扩增。
引物长度
通常为15-30个碱基。
引物序列
根据目的基因序列，利用引物 设计软件进行设计。
pcr 技术的应用领域
01
02
03
遗传疾病的诊断
通过PCR技术可以检测出 人类基因突变，从而对遗 传疾病进行诊断。
病原微生物检测
PCR技术可以快速、准确 地检测出细菌、病毒等病 原体，为疾病预防和控制 提供有力支持。
基因克隆和表达
通过PCR技术可以克隆出 目的基因，并在体外进行 表达和纯化，为基因工程 研究和应用提供基础。
05
pcr 扩增实验结果分析
结果分析方法
琼脂糖凝胶电泳
通过观察电泳结果，判断PCR 产物的大小是否与预期一致， 并判断是否有杂带或引物二聚
体。
测序验证
将PCR产物进行测序，与预期 的基因序列进行比对，验证 PCR产物的准确性。
核酸扩增技术 ppt课件
• 举例：如果一对引物的Tm值为60℃，可设置退火温度从63℃降
低到48℃，每次降低1℃，每个退火温度循环两个周期，最后在 48℃退火温度下做15个循环。
热启动PCR（hot start PCR）
• PCR反应体系中先不加Taq DNA聚合酶，等PCR扩增仪的温度上
升到80℃以后再加Taq DNA聚合酶。
PCR技术发展简史
• Korana于1971年最早提出核酸
体外扩增的设想。
• 1985年Mullis等发明了具有划
时代意义的聚合酶链反应，使 用的DNA聚合酶是Klenow片段。
(1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR。 • 1988年Saiki 发现Taq DNA聚合酶，从此PCR技术得以
模板（template ）
• DNA
基因组DNA
• RNA：总R质N粒AD、NAmRNA、tRNA、
rRNA、 病毒RNA
引物（primers)
• 引物是人工合成的两段
寡核苷酸序列，一个引 物与感兴趣区域一端的 一条DNA模板链互补， 另一个引物与感兴趣区 域另一端的另一条DNA 模板链互补。
→ Sense primer
• 变性温度与时间 • 复性温度与时间 • 延伸温度与时间 • 循环数和扩增效率 • 降落PCR (Touchdown PCR) • 热启动PCR（hot start PCR）
降落 PCR(Touchdown PCR)
• 根据引物Tm值，选定一个退火温度范围（跨越10-20℃的温度范
围，引物Tm值在这个范围之内）。在设置循环参数时，让退火 温度从选定范围的最高温度开始，逐步降低退火温度（每次降低 1-5℃），最后结束在选定范围的最低温度。在每一个退火温度 上循环2-5次。
低到48℃，每次降低1℃，每个退火温度循环两个周期，最后在 48℃退火温度下做15个循环。
热启动PCR（hot start PCR）
• PCR反应体系中先不加Taq DNA聚合酶，等PCR扩增仪的温度上
升到80℃以后再加Taq DNA聚合酶。
PCR技术发展简史
• Korana于1971年最早提出核酸
体外扩增的设想。
• 1985年Mullis等发明了具有划
时代意义的聚合酶链反应，使 用的DNA聚合酶是Klenow片段。
(1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR。 • 1988年Saiki 发现Taq DNA聚合酶，从此PCR技术得以
模板（template ）
• DNA
基因组DNA
• RNA：总R质N粒AD、NAmRNA、tRNA、
rRNA、 病毒RNA
引物（primers)
• 引物是人工合成的两段
寡核苷酸序列，一个引 物与感兴趣区域一端的 一条DNA模板链互补， 另一个引物与感兴趣区 域另一端的另一条DNA 模板链互补。
→ Sense primer
• 变性温度与时间 • 复性温度与时间 • 延伸温度与时间 • 循环数和扩增效率 • 降落PCR (Touchdown PCR) • 热启动PCR（hot start PCR）
降落 PCR(Touchdown PCR)
• 根据引物Tm值，选定一个退火温度范围（跨越10-20℃的温度范
围，引物Tm值在这个范围之内）。在设置循环参数时，让退火 温度从选定范围的最高温度开始，逐步降低退火温度（每次降低 1-5℃），最后结束在选定范围的最低温度。在每一个退火温度 上循环2-5次。
《基因扩增技术》 PPT课件
采用探究法与演示法进行讲授，激发学生兴趣，使 抽象的理论形象化，突破重点与难点。
探究法揭示PCR反应本质，激发学生对PCR反应的兴趣
salts (ions) Template DNA dNTPs
DNA Polymer
ase
Primers
演示法使抽象的PCR反应 过程形象化
过程
变性
引物退火
1st cycle
四、说教学过程
2.新 课 讲 解
3）PCR临床应用
本部分内容临床实用性强，通过设置职业情景，充分 调动医学检验专业学生的学习热情，极大的激发学生的主 观能动性。
2nd cycle
3rd cycle
DNA 复制
四、说教学过程
2.新 课 讲 解
2）PCR操作过程
本部分内容琐碎，步骤多，为临床实践的基础，采 用原理分析结合演示法进行讲授，让实验过程更加形象、 立体，使复杂问题简单化。
以PCR检验细菌为例，采用演示法结合步骤原理分析 使复杂的实验过程“看得见”。
教学难度大
学生情 况分析
心理状态
部分学生自制 力较差，独立 学习能力弱。
学生特点
课堂纪律好，学 习积极性高，学
习氛围好
二、说学情
本节内容抽象，知识点多，结合对学情的分 析，在本节教学中我会注意将抽象内容变直观 ，多与学生互动，并将知识点进行归纳总结， 使学生在兴趣中“学会、会用”。
三、说教法与学法
Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面 开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， ……
四、说教学过程
2.新 课 讲 解
1）PCR基本原理
2）PCR操作过程 3）PCR临床应用
探究法揭示PCR反应本质，激发学生对PCR反应的兴趣
salts (ions) Template DNA dNTPs
DNA Polymer
ase
Primers
演示法使抽象的PCR反应 过程形象化
过程
变性
引物退火
1st cycle
四、说教学过程
2.新 课 讲 解
3）PCR临床应用
本部分内容临床实用性强，通过设置职业情景，充分 调动医学检验专业学生的学习热情，极大的激发学生的主 观能动性。
2nd cycle
3rd cycle
DNA 复制
四、说教学过程
2.新 课 讲 解
2）PCR操作过程
本部分内容琐碎，步骤多，为临床实践的基础，采 用原理分析结合演示法进行讲授，让实验过程更加形象、 立体，使复杂问题简单化。
以PCR检验细菌为例，采用演示法结合步骤原理分析 使复杂的实验过程“看得见”。
教学难度大
学生情 况分析
心理状态
部分学生自制 力较差，独立 学习能力弱。
学生特点
课堂纪律好，学 习积极性高，学
习氛围好
二、说学情
本节内容抽象，知识点多，结合对学情的分 析，在本节教学中我会注意将抽象内容变直观 ，多与学生互动，并将知识点进行归纳总结， 使学生在兴趣中“学会、会用”。
三、说教法与学法
Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面 开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， ……
四、说教学过程
2.新 课 讲 解
1）PCR基本原理
2）PCR操作过程 3）PCR临床应用
核酸扩增技术教学课件ppt
RT-PCR技术
总结词
转录、反转录、灵敏度高。
详细描述
RT-PCR技术是一种将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的方法，具有高 灵敏度、高特异性、简单易行等特点，常用于检测细胞中基因表达水平。
qPCR技术
总结词
定量、高灵敏度、实时监测。
详细描述
qPCR技术即实时荧光定量PCR技术，是一种对特定DNA片段进行实时定量检测 的方法，具有高灵敏度、高特异性、可实时监测等特点，已广泛应用于基因表达 分析、病原体检测等领域。
详细介绍qPCR反应所需的各个组分及其作用，如 模板DNA、引物、dNTPs、DNA聚合酶、荧光染 料或探针等。
qPCR数据分析
介绍qPCR实验数据应该如何进行分析，包括扩增 曲线和熔解曲线的绘制和分析，以及Ct值的计算 和应用。
04
核酸扩增技术的数据分析与解读
数据分析方法与技巧
描述性统计分析
对实验数据进行描述性统计，如均 值、标准差等，以了解数据的集中 趋势和离散程度。
通过检测特定基因的扩增或缺失，对疾病进 行诊断和预测。
生物制药
进化研究
利用核酸扩增技术生产重组蛋白、抗体等生 物药物，用于治疗和预防疾病。
研究物种间的基因序列差异，揭示物种进化 的历史和机制。
误差分析与质量控制
01
误差来源
分析核酸扩增技术的误差来源，如试剂质量、操作流程、仪器设备等
。
02
质量控制
制定质量控制标准，如重复实验、阳性对照等，以确保实验结果的准
2023
《核酸扩增技术教学课件 ppt》
目 录
Байду номын сангаас
• 核酸扩增技术概述 • 核酸扩增技术的种类与特点 • 核酸扩增技术实验方案与步骤 • 核酸扩增技术的数据分析与解读 • 核酸扩增技术的优化与改进建议 • 核酸扩增技术的未来发展趋势与展望
核酸扩增技术
核酸扩增技术
• 核酸扩增技术概述 • 主要核酸扩增技术 • 核酸扩增技术的优缺点 • 核酸扩增技术的实验操作流程 • 核酸扩增技术的应用案例
01
核酸扩增技术概述
定义与原理
定义
核酸扩增技术是一种分子生物学 技术，通过特定的酶促反应，将 核酸片段在体外进行指数级扩增 ，以便进行后续的检测和分析。
原理
潜在的交叉污染风险
在实验过程中，如果操作不慎或仪器清洁不到位，可能导致交叉污染， 影响实验结果。
成本较高
虽然核酸扩增技术所需仪器设备和试剂已经逐渐标准化，但仍相对较 高，对于一些资源有限的地区和实验室来说可能存在经济压力。
04
核酸扩增技术的实验操作流程
样本处理
01
02
03
样本收集
采集具有代表性的样本， 确保样本质量。
qPCR技术
总结词
实时荧光定量聚合酶链式反应是一种在PCR反应过程中加入荧光标记，通过荧光信号的 积累实时监测PCR进程的技术。
详细描述
qPCR技术通过在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号的积累实时 监测PCR进程，最后通过标准曲线法对未知模板进行定量分析。该技术具有高灵敏度、 高特异性和可定量等优点，广泛应用于基因表达分析、突变检测和病毒载量测定等领域。
2000年代以后
随着测序技术的发展，新一代核酸 扩增技术如高通量测序、数字PCR 等逐渐崭露头角，广泛应用于生命 科学、医学等领域。
应用领域
01
02
03
04
基础研究
用于基因克隆、基因组测序、 基因表达分析等基础研究领域
。
临床诊断
用于检测和诊断遗传性疾病、 感染性疾病、肿瘤等疾病，如 HPV检测、HCV基因分型等
• 核酸扩增技术概述 • 主要核酸扩增技术 • 核酸扩增技术的优缺点 • 核酸扩增技术的实验操作流程 • 核酸扩增技术的应用案例
01
核酸扩增技术概述
定义与原理
定义
核酸扩增技术是一种分子生物学 技术，通过特定的酶促反应，将 核酸片段在体外进行指数级扩增 ，以便进行后续的检测和分析。
原理
潜在的交叉污染风险
在实验过程中，如果操作不慎或仪器清洁不到位，可能导致交叉污染， 影响实验结果。
成本较高
虽然核酸扩增技术所需仪器设备和试剂已经逐渐标准化，但仍相对较 高，对于一些资源有限的地区和实验室来说可能存在经济压力。
04
核酸扩增技术的实验操作流程
样本处理
01
02
03
样本收集
采集具有代表性的样本， 确保样本质量。
qPCR技术
总结词
实时荧光定量聚合酶链式反应是一种在PCR反应过程中加入荧光标记，通过荧光信号的 积累实时监测PCR进程的技术。
详细描述
qPCR技术通过在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号的积累实时 监测PCR进程，最后通过标准曲线法对未知模板进行定量分析。该技术具有高灵敏度、 高特异性和可定量等优点，广泛应用于基因表达分析、突变检测和病毒载量测定等领域。
2000年代以后
随着测序技术的发展，新一代核酸 扩增技术如高通量测序、数字PCR 等逐渐崭露头角，广泛应用于生命 科学、医学等领域。
应用领域
01
02
03
04
基础研究
用于基因克隆、基因组测序、 基因表达分析等基础研究领域
。
临床诊断
用于检测和诊断遗传性疾病、 感染性疾病、肿瘤等疾病，如 HPV检测、HCV基因分型等
《PCR扩增技术》课件
新技术与新方法
4
定性。
随着科学的进步，PCR技术将与其他技术 相结合，产生更多的创新和突破。
PCR扩增技术的优势和局限
1 优势
PCR技术快速、灵敏，可以扩增微量DNA，对样本要求低，适用于各种类型的DNA。
2 局限
PCR技术受到DNA质量、引物设计和反应条件等因素的影响，可能引入偏倚和错误。
参考文献
1. Mullis, K. B. (1990). The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American, 262(4), 56-65.
2. Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A., & Arnheim, N. (1985). Enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230(4732), 1350-1354.
《PCR扩增技术》PPT课 件
欢迎来到《PCR扩增技术》PPT课件，本课程将带你深入了解聚合酶链式反应 (PCR)的原理、应用和前景。快速、精确、高效、灵敏的PCR技术正引领着分 子生物学研究的潮流。
什么是PCR扩增技术
PCR：聚合酶链式反应，通过体外复制DNA片段，为现代生命科学研究和应用提供了强大的工具。快速、高效 的PCR技术在基因诊断、基因重组、基因测序、基因治疗等领域取得了巨大的突破。
核酸扩增技术
核酸扩增技术
目录
CONTENTS
• 核酸扩增技术概述 • 常用核酸扩增技术 • 核酸扩增技术的应用 • 核酸扩增技术的优缺点 • 核酸扩增技术实验操作流程
01 核酸扩增技术概述
定义与原理
定义
核酸扩增技术是一种通过特定的生物 化学反应，将目标核酸片段在体外进 行快速、特异的复制的技术。
原理
基于DNA或RNA的复制机制，通过使 用引物和特定的酶，将目标核酸片段 进行指数级扩增，从而实现核酸的快 速扩增。
临床意义评估
结合临床样本情况和患者病情，对扩增结果进行解读 ，为临床诊断和治疗提供依据。
感谢您的观看
THANKS
历史与发展
01
02
03
1980年代初期
最早的核酸扩增技术问世 ，基于PCR技术。
1990年代
随着技术的不断改进，出 现了多种核酸扩增技术， 如LAMP、TMA等。
21世纪
随着测序技术的发展，新 一代核酸扩增技术如数字 PCR、单分子测序等逐渐 兴起。
技术分类
基于PCR的方法
包括常规PCR、实时荧光定量PCR、数字 PCR等。
可定量
通过扩增过程中的荧光标记或电泳技术，可以确定核酸的相对或绝对 含量，有助于了解病情严重程度和治疗效果。
应用广泛
核酸扩增技术可以应用于各种不同的生物和医学领域，如病毒检测、 细菌鉴定、基因表达分析等。
缺点
易污染
扩增过程中可能出现假阳性结果，主 要原因是扩增产物污染或交叉污染。
高成本
核酸扩增技术需要昂贵的仪器、试剂 和探针，导致检测成本较高。
要点二
肿瘤诊断
通过扩增肿瘤相关基因的表达产物，可以辅助肿瘤的诊断 和预后评估，为肿瘤个体化治疗提供依据。
目录
CONTENTS
• 核酸扩增技术概述 • 常用核酸扩增技术 • 核酸扩增技术的应用 • 核酸扩增技术的优缺点 • 核酸扩增技术实验操作流程
01 核酸扩增技术概述
定义与原理
定义
核酸扩增技术是一种通过特定的生物 化学反应，将目标核酸片段在体外进 行快速、特异的复制的技术。
原理
基于DNA或RNA的复制机制，通过使 用引物和特定的酶，将目标核酸片段 进行指数级扩增，从而实现核酸的快 速扩增。
临床意义评估
结合临床样本情况和患者病情，对扩增结果进行解读 ，为临床诊断和治疗提供依据。
感谢您的观看
THANKS
历史与发展
01
02
03
1980年代初期
最早的核酸扩增技术问世 ，基于PCR技术。
1990年代
随着技术的不断改进，出 现了多种核酸扩增技术， 如LAMP、TMA等。
21世纪
随着测序技术的发展，新 一代核酸扩增技术如数字 PCR、单分子测序等逐渐 兴起。
技术分类
基于PCR的方法
包括常规PCR、实时荧光定量PCR、数字 PCR等。
可定量
通过扩增过程中的荧光标记或电泳技术，可以确定核酸的相对或绝对 含量，有助于了解病情严重程度和治疗效果。
应用广泛
核酸扩增技术可以应用于各种不同的生物和医学领域，如病毒检测、 细菌鉴定、基因表达分析等。
缺点
易污染
扩增过程中可能出现假阳性结果，主 要原因是扩增产物污染或交叉污染。
高成本
核酸扩增技术需要昂贵的仪器、试剂 和探针，导致检测成本较高。
要点二
肿瘤诊断
通过扩增肿瘤相关基因的表达产物，可以辅助肿瘤的诊断 和预后评估，为肿瘤个体化治疗提供依据。
第三章 核酸扩增技术 ppt课件
5 目录
基础知识
+
2020/10/28
6 目录
基础知识
2020/10/28
7 目录
一、核酸分子杂交的基本原理
基础知识
DNA加热变性
DNA冷却复性
2020/10/28
8 目录
基础知识
DNA变性(denaturation) 定义：在某些理化因素作用下，DNA分 子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有 序的双螺旋结构变为不规则无序的单链 线团样结构的过程。
二、PCR体系基本组成成分
1. 模板DNA 2. 特异性引物 3. 耐热DNA聚合酶 4. dNTPs 5. 缓冲液
现在位置 P170 2020/10/28
23 目 录
模板(template)
模板就是将要被复制的核酸片段， 包括基因组DNA、RNA、质粒DNA和线 粒体DNA等。
在用 RNA作为模板时，须先将 RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为 PCR反应的模板进行扩增反应。
现在位置 P169 2020/10/28
15 目 录
一、PCR的原理和反应过程
PCR反应重复进行DNA复制的过程，使DNA得 以扩增，每一次复制包括3个步骤：
变性（denaturation） 退火（annealing） 延伸（extension）
现在位置 P125 2020/10/28
16 目 录
热变性的DN)。
2020/10/28
12 目 录
基础知识
2020/10/28
13 目 录
基础知识
dNTP
dATP dCTP dGTP dTTP
dNTP
2020/10/28
14 目 录
第一节 聚合酶链式反应
核酸扩增技术
核酸扩增技术，特别是聚合酶链反应（PCR）技术，是分子生物学领域的重要工具。PCR技术通过特定的反应体系和条件，能够在体外快速扩增DNA片段。反应体系包括模板DNA、引物、DNA聚合酶和dNTP等关键组分。反应过程中，模板DNA经历变性、退火、延伸和循环等步骤，实现DNA片段的指数级扩增。优化PCR反应涉及调整反应体系的组分浓度和反应条件，以提高扩增效率和特异性。其中，引物设计是PCR技术的关键环节。引物需和灵敏性。引物长度、碱基分布的均衡性、Tm值以及3’端和5’端的设计都是引物设计中的重要考虑因素。通过合理的引物设计，PCR技术能够高效、准确地扩增目标DNA片段，为后续的分子生物学研究提供有力支持。
核酸等温扩增ppt课件
• LAMP 的反应结果只有两种即扩增与不扩增，故 在产生非特异性扩增时是难以进行后续鉴定的；
• 产物相当复杂，无法进行后续的回收、鉴定、克 隆等基因工程操作。
17
18
19
20
21
22
NASBA的优缺点
NASBA 是种 RNA 扩增法，因此其主要应用 是对 RNA 病毒的检测。
整个反应能在 42℃条件下进行，经过两个 小时的扩增可将模板 RNA放大至 109~1010 倍。
近年来，各国学者陆续利用RPA技术，对于DNA病毒、细菌等 进行核酸检测。
37
RPA的原理
38
四氢呋喃非碱基位点类似物
tetrahydrofuran abasic–site mimic (THF)
39
40
结果观察：
Basic RPA
lateral-flow strip
exo RPA
41
引物、探针设计
10
LAMP的操作过程
11
检测方法
12
LAMP技术在病原体检测中的应 用
13
14
LAMP技术小结
15
LAMP技术的优点
16
存在缺陷
• 所识别的靶位序列长度不得过大，一般在300 bp 以内。因此，无法进行长片段 DNA 的扩增；
• LAMP 技术具备高灵敏度，对操作要求严格分区， 否则极易受到污染而产生假阳性结果；
26
SAT技术的原理
SAT技术（Simultaneous Amplification and Testing）是基于TMA （Transcription mediated amplification）恒温扩增技术发展起来的一项最新 核酸检测技术，是国内企业自主研发的专利技术
• 产物相当复杂，无法进行后续的回收、鉴定、克 隆等基因工程操作。
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NASBA的优缺点
NASBA 是种 RNA 扩增法，因此其主要应用 是对 RNA 病毒的检测。
整个反应能在 42℃条件下进行，经过两个 小时的扩增可将模板 RNA放大至 109~1010 倍。
近年来，各国学者陆续利用RPA技术，对于DNA病毒、细菌等 进行核酸检测。
37
RPA的原理
38
四氢呋喃非碱基位点类似物
tetrahydrofuran abasic–site mimic (THF)
39
40
结果观察：
Basic RPA
lateral-flow strip
exo RPA
41
引物、探针设计
10
LAMP的操作过程
11
检测方法
12
LAMP技术在病原体检测中的应 用
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14
LAMP技术小结
15
LAMP技术的优点
16
存在缺陷
• 所识别的靶位序列长度不得过大，一般在300 bp 以内。因此，无法进行长片段 DNA 的扩增；
• LAMP 技术具备高灵敏度，对操作要求严格分区， 否则极易受到污染而产生假阳性结果；
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SAT技术的原理
SAT技术（Simultaneous Amplification and Testing）是基于TMA （Transcription mediated amplification）恒温扩增技术发展起来的一项最新 核酸检测技术，是国内企业自主研发的专利技术
核酸扩增技术
核酸扩增技术是分子生物学领域的重要技术，其中聚合酶链反应（PCR）技术最为常用。PCR技术自1985年发明以来，经历了不断的发展与完善。其基本原理是利用DNA聚合酶在体外对特定片段进行循环扩增，以达到快速、大量制备DNA的目的。PCR反应体系包括模板、引物、DNA聚合酶、dNTP和PCR缓冲液等关键组分。反应条件则包括变性、退火、延伸三个基本步骤，并通过循环进行多次扩增。引物设计是PCR技术的关键环节，要求引物与模板序列紧密互补，避免形成稳定的二聚体或发夹结构，以确保PCR的特异性和灵敏性。引物长度、碱基分布均衡性、Tm值等参数是影响PCR效果的重要因素，需要在设计时予以充分考虑。通过优化PCR反应体系和条件，以及合理设计引物，可以实现高效、特异的核酸扩增，为后续的分子生物学研究提供有力支持。
第3章 核酸扩增技术(上) V1.5
18
PCR的基本原理
Taq酶
PCR反应条件 72℃ 55℃ PCR过程 PCR的特点
引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
2014-2-28
Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force
19
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
子链延长
3’
2014-2-28
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force
PCR技术简史
DNA 解旋解链
DNA的半保留复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 变性 TAGCGCTATCGCATCGACGCT GGAUCG 3’ 5‘
11
PCR技术简史
DNA的半保留复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明
• 1971年，Khorana提出：在体外，经 过 DNA 变性，与合适引物杂交，用 DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该 过程便可克隆扩增基因。
• 但由于当时体外引物合成的困难， 以及 70 年代基因工程技术的发明使 体内克隆基因成为可能，所以， Khorana的设想被人们遗忘了……
27
三、PCR扩增反应体系
标准的PCR反应体系
总体积10ul-50ul • 模板DNA • 引物 • Taq DNA聚合酶 • 4种dNTP混合物 • 含Mg2+缓冲液 0.1～1ug 各0.1～0.2umol/L 2.5u 各200umol/L 1.5 ～ 2mmol/L
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2 2
2
3 …n 2 3… 2 n
现在位置 P170
目录
二、PCR体系基本组成成分
1. 2. 3. 4. 5.
模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
现在位置 P170
目录
二、PCR体系基本组成成分
1. 2. 3. 4. 5.
模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs 缓冲液
第三章
核酸扩增技术
Polymerase Chain Reaction techniques
目录
大纲要求：
掌握PCR的原理和反应过程 掌握PCR反应体系 掌握PCR产物的检测 熟悉实时荧光定量PCR的原理和方法 了解以PCR为基础的相关技术
Special
目录
二、教学内容
第一节 聚合酶链式反应 第二节 以PCR为基础的相关技术 第三节 PCR产物的检测 第X节 实时荧光定量PCR
目录
（五）PCR诱导定点突变
DNA重组技术使我们能够首先用各种方 法对克隆的DNA片段进行突变，在对产生 的突变作DNA序列分析以后，再对突变体 的特殊功能作进一步研究。
现在位置 P180
目录
（六）原位PCR技术（in situ PCR）
组织固定处理细胞内的DNA或RNA，并以其作为靶 序列进行PCR反应的过程称为原位PCR。
现在位置 P169
目录
基础知识
遗传中心法则
RNA 复制 复制
DNA
转录 逆转录
RNA
翻译
蛋白质
现在位置 P169
目录
基础知识
+
目录
基础知识
目录
一、核酸分子杂交的基本原理
基础知识
DNA加热变性
DNA冷却复性
目录
基础知识
DNA变性(denaturation)
定义：在某些理化因素作用下，DNA分 子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有 序的双螺旋结构变为不规则无序的单链 线团样结构的过程。
RT-PCR主要用于克隆cDNA、合成cDNA探针、检测RNA病毒
和分析基因表达等。
现在位置 174
目录
（二）、巢式PCR
巢式PCR（nested PCR）是对靶基因进行二次扩
增。
二次扩增所用的引物不能相同，第二次扩增所用
的引物必须位于第一次扩增所用引物的内侧
先用第一对引物扩增出一个较大的片段，再用第
目录
基础知识
目录
基础知识
melting temperature，
融解温度（Tm） 定义： 在DNA热变 性时，其A260 的升高达最大 值一半时的温 度。
目录
基础知识
DNA复性
定义：变性的单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过 程，称复性或杂交。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性， 此过程称为退火(annealing)。
因素，因为镁离子对于反应系统本身、稳定核
苷酸和提高Taq DNA聚合酶的活性有直接的影
响。
Mg2+浓度过低使酶活力降低 Mg2+浓度过高又会使酶催化非特异性扩增。 一般为1.5mmol/L
现在位置 P172
目录
引物(Primer)
引物是化学合成的已知序列的寡核苷酸
(oligonucleotide)分子。
（Thermus aquaticus）中提取的，有很高的耐
热稳定性。TaqDNA聚合酶的作用是催化DNA合成， 即在模板指导下，以dNTP为原料，在引物的3’OH端,加上dNTP,在二者间生成3’ ，5’-磷酸二 酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸。 现在位置 P170
目录
dNTPs
即dATP、dCTP、dGTP和dTTP四种脱氧核苷三磷 酸的混合物。
二对引物进行第二次扩增
第二次扩增的模板是第一次扩增的产物
现在位置 174
目录
（二）、巢式PCR
要扩增的目标 基因
引物1 引物2 nest
现在位置 174
目录
（三）、定量PCR
相对定量PCR 定量PCR（实时荧光PCR）
现在位置 175
目录
（四）多重PCR技术
多重PCR（multiplex PCR）即在同一反应 体系中加入多对引物，以同时扩增一份DNA 样品中多个不同序列的靶片段。
目录
基础知识
目录
基础知识
dNTP
dATP dCTP dGTP dTTP
dNTP
目录
第一节 聚合酶链式反应
PCR概念：在体外特异地复制一段已知 序列的DNA片段的过程。
现在位置 P169
目录
一、PCR的原理和反应过程
PCR反应重复进行DNA复制的过程，使DNA得 以扩增，每一次复制包括3个步骤：
变性（denaturation）
退火（annealing） 延伸（extension）
现在位置 P125
目录
变性（denaturation）
将待复制的双链 DNA经加热至94℃～ 95 ℃）左右一定时间后，DNA双螺旋的
氢键断裂，使之成为单链分子，作为反
应的模板（template) ，以便它与引物
如加入酶切位点，用生物素、荧光素、地 高辛等标记，引入突变位点，引入启动子 序列，引入蛋白质结合DNA序列等。 现在位置 P171
目录
三、 反应条件
1、温度 ①变性温度：一般把变性温度定在95～97℃之 间，以使模板DNA和产物双链完全打开。 ②退火温度：退火温度决定PCR反应的特异性， 退火温度的设定取决于引物的Tm，通常PCR 的退火温度应低于引物Tm 5℃左右。 ③延伸温度：一般为72℃，在这个温度下 TaqDNA聚合酶具有较高的酶促活性，有利于 DNA的复制。
现在位置 P172
目录
2、时间
PCR循环中每个步骤所需的时间取决于所扩增片段的长
度。
以长度为200～1000bp的扩增片段为例，循环中变性、
退火和延伸三个步骤的持续时间一般均为30秒～1分钟。
在模板（尤其是基因组DNA）进行第1次变性时应给予足
够长的时间（5～7分钟，根据变性温度高低而异）以使 模板彻底变性，然后再进入循环。
现在位置 P170
目录
模板(template)
模板就是将要被复制的核酸片段，
包括基因组DNA、RNA、质粒DNA和线
粒体DNA等。 在用 RNA作为模板时，须先将 RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为 PCR反应的模板进行扩增反应。
现在位置 P125
目录
耐热DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）是从一 种生活在热泉（80～90℃）中的水栖噬热CR
原位杂交PCR与原位PCR的唯一区别：
扩增结束后，用寡核苷酸探针与扩增产物作原位 杂交。
现在位置 P134
目录
（七）差异显示PCR （defferential display PCR,DD-PCR）
一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达 差异的技术。 DD-PCR主要用于肿瘤和多种疾病的分子 遗传学研究，是目前筛选基因表达差异 最有效的方法。
引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。
现在位置 P170
目录
引物设计时必须遵循的原则（6条）
1. 用于PCR反应的引物需要二条，分别设在 被扩增目标片段的二端，并分别与模板 正负链序列互补。 2. 引物的长度一般以18～25个核苷酸为宜
① 引物过长容易产生寡核苷酸的链内互补，形成发夹 状结构，
② 引物过短则会降低扩增的特异性； 现在位置 P171
目录
引物设计时必须遵循的原则
3. 二条引物之间（尤其在3’端）的序列
不可有互补，以免形成引物二聚体；
4. 引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤、
嘧啶碱基堆积。
①
C＋G的比例一般为45~55%。
现在位置 P171
目录
引物设计时必须遵循的原则
5. PCR扩增中的退火温度是根据引物的Tm
值而决定的，二条引物的Tm值不能差别 太大。 6. 根据需要，合成引物时在其5’端可以 加修饰成分
结合，为下轮反应作准备；
现在位置 P170
目录
退火（annealing）
温度降低至寡核苷酸（oligonucleotide） 引物的融点温度以下（40～70℃），使引
物能与模板互补结合，形成杂交链；
现在位置 P125
目录
延伸（extension）
将温度升至72℃左右，使反应体系中的 DNA聚合酶按照模板链的序列以互补的方 式依次把dNTP加至引物的3’端，使杂交 双链不断延伸，以至形成新的DNA 双链。
第二步：
C－DNA->PCR
现在位置 P134
目录
目录
（X）免疫PCR（immunoPCR,IPCR）
原位PCR与普通PCR的主要区别在于模板的制备。
经脱蜡处理的组织切片或滴加在载玻片上的细胞悬
液都可作为扩增样品，所有步骤均在载玻片上进行。
现在位置 P134
目录
（六）原位PCR技术（in situ PCR）
进行PCR时，加入地高辛标记的的dUTP， 使扩增产物带有地高辛。PCR结束，加入酶标 抗地高辛抗体，再加入底物显色。
现在位置 P182
目录
目录
（X）免疫PCR（immunoPCR,IPCR）
结合PCR技术和抗原抗体反应 用于检测抗原（蛋白质） 固相载体上包被有抗体1
抗体2上标记有DNA，作为PCR的模板
现在位置 P134
目录