抗体筛选理论及方法(杨君青)
抗体筛选技巧
抗体筛选技巧抗体筛选技巧1. 引言在现代生命科学研究中，抗体在许多实验和应用中发挥着重要的作用。
抗体的选择和筛选是获得高质量抗体的关键步骤。
本文将介绍几种常用的抗体筛选技巧，帮助研究人员更有效地选择适用的抗体。
2. 背景知识在开始抗体筛选之前，我们需要了解一些基本概念。
抗体是一种由免疫系统产生的蛋白质分子，可以识别和结合目标分子，如细菌、病毒、蛋白质等。
抗体筛选旨在从大量候选抗体中鉴定和选择具有高亲和力和特异性的抗体。
3. 抗体筛选技巧3.1 免疫吸附法免疫吸附法是一种常见的抗体筛选方法。
该方法利用已知抗原固定在固相载体上，然后与抗体混合反应，通过洗脱非特异性结合抗体，最终获得特异性的抗体。
这种方法适用于具有高亲和力和特异性的抗体的筛选，可以用于活体和死体标本。
3.2 免疫组化技术免疫组化技术结合了免疫学和组织学的原理，用于检测细胞和组织中特定分子的存在和分布。
该技术可以帮助研究人员验证抗体的特异性和亲和力，并确定其在特定细胞或组织中的表达情况。
在抗体筛选中，免疫组化技术可以用于确认候选抗体的特异性。
3.3 流式细胞术流式细胞术是一种高通量的细胞分析技术，可以同时检测和筛选大量细胞。
在抗体筛选中，流式细胞术可以用于确定抗体的亲和力、特异性和适用范围。
通过标记目标分子和抗体，可以利用流式细胞术定量地分析抗体与细胞及其表面分子的相互作用。
3.4 直接酶标记法直接酶标记法是一种高灵敏度的抗体筛选技术，可以快速鉴定和筛选高亲和力的抗体。
该技术利用酶标记的抗体与抗原结合后，通过酶活性产生的化学反应或发色反应来检测抗体-抗原复合物的存在。
该方法操作简单，灵敏度高，适用于大规模抗体筛选。
4. 讨论与总结抗体筛选技巧的选择应基于研究目的、样本类型和实验条件。
免疫吸附法和免疫组化技术适用于确定抗体的特异性和亲和力，可以对候选抗体进行初步的筛选。
流式细胞术可以进一步评估抗体在细胞水平上的特异性和亲和力，而直接酶标记法可用于快速大规模的抗体筛选。
从大容量噬菌体抗体库中筛选抗体
将所分析得到的抗原性高的基因序列进行 ＢＬＡＳＴ比 对。选取抗原性高且与其他蛋白没有同源性的蛋白片 段进行表达。 １．２．２ 细胞培养 ＨｅＬａ细胞以 １×１０５接种于含 １０％ 胎牛血清的 ＤＭＥＭ 培养液中，５％ＣＯ２／９５％空气，３７℃ 孵育培养。 １．２．３ 总 ＲＮＡ提取及 ＲＴ?ＰＣＲ 收集指数生长期细 胞，Ｔｒｉｚｏｌ提取总 ＲＮＡ。定量后，Ｍ?ＭＬＶ逆转录酶合成 ｃＤＮＡ第一链。以反转录获得的 ｃＤＮＡ为模板，分别用 两对引物 Ｐ１，Ｐ２和 Ｐ３，Ｐ４对目的基因片段进行 ＰＣＲ扩 增。扩增反应的条件均为：９５℃预变性 １０ｍｉｎ，９４℃变 性 ４５ｓ，５５℃退火 ３０ｓ，７２℃延伸 １ｍｉｎ，扩增 ３０个循环。 ＰＣＲ扩增产物经 １％琼脂糖凝胶电泳回收纯化。 １．２．４ 重组克隆载体 ｐＧＥＭ?ＴＤＰＫ３和 ｐＧＥＭ?ＴＤＰＫ４ 的构建与鉴定 将纯化的两段 ＰＣＲ产物分别连入载体 ｐＧＥＭ?ＴＥａｓｙ，构建重组质粒 ｐＧＥＭ?ＴＤＰＫ３和 ｐＧＥＭ?Ｔ ＤＰＫ４，转化感受态 Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α后 挑 取 阳 性 克 隆，用 ＮｄｅⅠ ／ＸｈｏⅠ 双 酶 切 质 粒 ｐＧＥＭ?ＴＤＰＫ３和 ｐＧＥＭ?Ｔ ＤＰＫ４，将两段目的基因片段分别回收纯化。 １．２．５ 重组表达载体 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ３和 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ４ 的构建与诱导表达 将纯化的两段目的基因与经 Ｎｄｅ Ⅰ ／ＸｈｏⅠ双酶切的载体 ｐＥＴ?２２ｂ（ ＋ ）相连接，分别 构建重组表达载体 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ３和 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ４，转 化感受态 Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α后挑取阳性克隆，用 ＮｄｅⅠ ／Ｘｈｏ Ⅰ双酶切鉴定。经测序分析正确的重组质粒 ｐＥＴ２２ｂ? ＤＰＫ３和 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ４ 转 化 感 受 态 Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１ （ＤＥ３），挑取阳性克隆，接种于 １０ｍｌＬＢ／Ａｍｐ＋培养基 中，于 ３７℃培 养 过 夜。按 １％ 比 例 将 工 程 菌 转 接 于 ５００ｍｌ新鲜的 ＬＢ／Ａｍｐ＋培养基中，３７℃培养至 ＯＤ６００约 ０．５时，加 入 终 浓 度 为 ０．８ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱 导 表，于 ３７℃培养 ３ｈ。表达产物用 ＳＤＳ?ＰＡＧＥ检测。取 ５０ｍｌ 经诱导表达 的 工 程 菌 超 声 裂 解 后，分 别 取 上 清 组 分 及 沉淀组分 ＳＤＳ?ＰＡＧＥ分析。 １．２．６ 融合蛋白 ＤＰＫ３和 ＤＰＫ４的纯化 收获的工程 菌经超声破菌后，将沉淀物用 １％ ＴｒｉｔｏｎＸ?１００漂洗后 用缓冲液 Ａ（２ｍｏｌ／Ｌ尿素，２０ｍｍｏｌ／ＬＰＢＳ，ｐＨ７．５）于 ４℃洗涤 ２ｈ，离心收集沉淀。经粗提的包涵体溶解于 缓 冲 液 Ｂ（８ｍｏｌ／Ｌ 尿 素，２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ ｐＨ８．０， ０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，２０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑），４℃搅拌 ２ｈ，使其充 分溶解。离心后取上清以 １ｍｌ／ｍｉｎ的流速上样于经缓 冲液 Ｂ平衡后的 ＨｉｓＴｒａｐＨＰ亲和柱，上样后以缓冲液 Ｂ洗 柱；而 后 通 过 梯 度 混 合 器 形 成 从 缓 冲 液 Ｂ到 Ｃ
抗体的研制及其在生物医学中的应用11208120杨文清
抗体的研制及其在生物医学中的应用11208120 杨文清抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定靶点定向制备等优点，在各种疾病治疗，特别是肿瘤治疗领域的应用前景备受关注。
当前，抗体药物的研究与开发已成为生物技术药物领域研究的热点，居近年来所有医药生物技术产品之首。
一、背景历史：1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素,建立了血清疗法,开创了抗体制药。
1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为白蛋白、α、β、γ球蛋白，并证明抗体活性主要存在于γ球蛋白组分。
20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。
病人血清中出现同抗体结构类似的球蛋白，统称为免疫球蛋白。
1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体。
单克隆抗体的研究一直是生物医药领域的重要研究内容。
白20世纪90年代中期以来，单克隆抗体和多克隆抗体的基础研究论文产出有所下降，而人源化抗体的研究则不断得到重视(参见图1)。
这说明，单克隆抗体相关生物医学理论的基础研究已经相对成熟，单克隆抗体应用研究则不断发展。
在这一研究发展历程中，人源化抗体和重组多克隆抗体技术的发展促进了抗体药物研究的深入(参见图2)。
其中，人源化抗体是在鼠源单抗应糖体展示技术、酵母展示技术、转基因鼠技术等的发展，使人源性基因工程抗体的获得不再是难题．这又激发了单抗药物的研究热情。
1994年．美国批准第二个抗体药物上市。
之后，抗体药物不断上市。
2006年利用能够产生人类抗体的转基因小鼠XenoMouse技术首个完全人源化单克隆抗体药物Panitumumab上市，标志着人源化抗体技术的发展达到了新的水平。
近年来，随着Symphoge公司的Symplex 和Sympress 等技术的发展．以及由此而生产、用于治疗原发性血小板减少性紫癜(ITP)和新生儿溶血症(HDN)的多克隆抗体药物Sym001(anti—RhD)进入II期临床试验重组多克隆抗体药物研究也呈现出良好的发展态势。
抗体筛选和鉴定操作规程
抗体筛选和鉴定操作规程(一) 抗体筛选1. 抗体筛选的目的血型抗体是体内免疫系统所产生的针对血型抗原发生特异性反应的一类免疫球蛋白类物质。
人体血清内存在的抗体有5种类型：IgG.、 IgM、IgA.、IgD和IgE，其中IgG 和IgM是最重要的2种抗体。
红细胞血型抗体可以分为：①完全抗体：这些抗体能够在盐水介质中凝集相应的红细胞，所以又称为盐水抗体，它们主要是分子量较大的IgM；②不完全抗体：这类抗体主要是分子量较小的IgG，虽然能够结合红细胞上的抗原，但在盐水介质中不能使红细胞凝集。
有临床意义的血型抗体会导致溶血性输血反应，破坏输入的不配合的红细胞或缩短其寿命，产生溶血性输血反应，轻则影响治疗效果，重则危及患者生命；此外，对孕妇而言，抗体会引起新生儿溶血病，影响新生儿脏器的发育，并使其智力发育受到伤害，严重者则会危及新生儿的生命安全。
因此，抗体筛检是很必要而且必需的。
抗体筛检试验(antibody screening tests)主要筛查与红细胞反应的血型同种抗体。
对受血者的血清和血浆应进行常规的抗体筛选试验，以发现有临床意义的不规则的血型同种抗体。
所谓不规则抗体是指抗A和抗B以外的血型抗体。
抗体筛选试验的原则是让受检者的血清与筛选红细胞反应，以发现在37℃有活性的抗体。
患者接受输血、妇女妊娠都会刺激机体产生抗体。
抗体筛检试验能有效保证临床输血安全，避免新生儿溶血症的发生。
2. 抗体筛选的方法抗体筛选试验可在交叉配血试验之前进行或一起进行，这样有利于对患者抗体的早期确认及鉴定临床上有意义的抗体，避免一些可能的异常情况而造成病情的延误。
抗体筛选和鉴定使用的方法有盐水法、白蛋白介质法、低离子强度介质法(Liss)、聚凝胺法(polybrene)、凝胶法、酶技术、抗球蛋白试验等，可按抗体的血清学行为和试验的具体条件选择，但必须进行抗球蛋白试验。
抗体筛选试验不一定能检出所有有临床意义的抗体，一些抗低频率抗原的抗体或有剂量效应的抗体可能被漏检，这时需安排抗原更完全和特异性更强的筛选细胞进行试验，或用敏感度更高的技术进行检查。
抗体库筛选技术介绍
抗体库筛选技术介绍
1.抗体库构建：首先，需要构建一个包含大量不同抗体的抗体库。
常见的方法包括免疫化学方法、获得单个免疫球蛋白B细胞并进行单细胞PCR扩增、切割免疫球蛋白链并进行克隆等。
2.抗原或目标蛋白筛选：抗体库中的抗体会与抗原或目标蛋白发生特异性结合。
通常使用抗原或目标蛋白对抗体库进行筛选。
抗原或目标蛋白可以是合成的多肽、重组蛋白、整个细胞或其组分等。
3.高亲和力筛选：在已经进行了初步筛选的抗体库中，利用高亲和力进行筛选。
这可以通过几个方法实现，如亲和柱层析、溶液竞争结合、表面等的相互作用等。
目的是筛选出具有高亲和力的抗体。
4.特异性筛选：特异性是指抗体只与特定抗原结合，并且不与其他物质发生结合。
特异性筛选通常可以通过ELISA、胶体金或荧光标记等方法来进行。
通过多次筛选，以获取高特异性的抗体。
5.功能性和应用评估：在筛选过程结束后，需要对获得的抗体进行进一步的功能性和应用评估。
常见的评估方法包括免疫组织化学、流式细胞术、免疫印迹、细胞免疫活化等。
总之，抗体库筛选技术是一种快速有效的抗体筛选方法，可以获得高质量的抗体，为研究和医学进展提供了重要的工具。
抗体筛查常用的方法
抗体筛查常用的方法抗体筛查是一种常见的实验方法，用于检测生物样本中特定抗体的存在。
通过筛查抗体，我们能够了解人体免疫系统的状态，并发现某些疾病的迹象。
本文将介绍几种常用的抗体筛查方法。
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验是一种常用的抗体筛查方法。
该方法利用抗体与待检测抗原结合后形成复合物，再使用辣根过氧化物酶等酶标记物来标记复合物。
随后，通过加入染色底物，酶标记物能够催化染色底物的反应，形成可见的色素产物。
根据产生的色素强度，我们可以判断待检测抗原的存在与否。
二、免疫印迹法（Western Blotting）免疫印迹法也是一种常用的抗体筛查方法。
该方法主要用于检测某种特定蛋白质的抗体。
首先，从待测样本中分离出蛋白质并进行电泳分离。
然后，将分离后的蛋白质转移到膜上进行固定。
接下来，使用特异性抗体与待测蛋白质结合，再使用荧光素等物质进行信号增强。
最后，通过暗室暗片法观察或使用射线暴露来探测标记物，从而确定待测蛋白质的存在与否。
三、流式细胞术（Flow Cytometry）流式细胞术是一种广泛应用的抗体筛查方法，主要用于检测细胞表面的抗原或细胞内的特异性细胞蛋白。
该方法利用荧光素等标记物标记抗体，将待测细胞的悬浮液通过流式细胞仪进行检测。
仪器能够依次通过细胞，使用多色激光同时激发标记物，并通过检测信号来确定待测细胞中特定抗原的存在与否。
通过流式细胞术，我们可以同时检测多个抗体和抗原，获得更全面的信息。
四、免疫组织化学染色（Immunohistochemistry）免疫组织化学染色是一种应用广泛的抗体筛查方法，主要用于检测组织样本中特定抗原的分布和定位。
该方法通过使用特异性抗体与待测抗原结合，再标记荧光素或酶标记物，从而在光学显微镜下观察组织样本中的抗原分布情况。
这种方法可以帮助病理学家识别异常细胞或组织，对临床诊断提供有力的支持。
以上所述的四种抗体筛查方法是目前研究和临床应用较为常见的方法，它们在疾病诊断和基础科研中发挥着重要作用。
抗体筛选试验PPT课件
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配血中出现问题的解决方法
• 1、调查患者的年龄、性别、种族、疾病诊断、用药史、家族史、输血史、输血 反应史、妊娠史、生育史等（非常重要，对于后续的配血给血方案有很重要的意 义）。
谱细胞 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 自身
IS
- -- - - - -- - - -
I AT
2+ - 2+ 3+S 2+ - - - - 1+S -
• 结果判断：IgG型抗-E抗体
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四、交叉配血的作用
• 1、确认受血者和供血者ABO血型的相合性。 • 2、可检测出受血者血清中不规则抗体，此抗体可能在抗体筛选试验中，由于筛
抗体筛选试验 （试管法）
• 抗体筛选试验患者两滴血清+筛选细胞（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）、三洗的自身细胞各一滴 立即离心看结果。
• 结果分析： • 阳性：IgM型抗体、冷抗体、蛋白凝集、自身抗体等情况。 • 阴性：需要进一步鉴定
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盐水介质中阳性如何处理
1、IgM型抗体：患者血清+谱细胞进行特异性 检查，一般以抗-M、抗-Lea、抗-Leb、抗-P1、 早期形成的抗-D、E等抗体。
选试剂红细胞缺乏相应的抗原而漏检。
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• 交叉配血试验是保障临床输血安全、及时、有效的重要手段，其方法主要有盐水 法、凝聚胺法或抗人球蛋白法等，使用安全、有效的方法进行交叉配血试验，分 析确定交叉配血不合的原因，并采取相应的处理方法对预防输血反应发生和解决 临床疑难输血有重要意义。交叉配血试验，也称为配合性试验。要使患者与献血 员血液间没有相对应的抗原、抗体存在 。
抗体筛选技术
抗体筛选技术
抗体筛选技术是一种用于寻找具有特定结合能力的抗体分子的方法。
这些技术可以用于从一个大的抗体库中鉴定出与目标分子高亲和力结合的抗体，并在药物研发、疾病诊断和治疗等领域发挥重要作用。
常用的抗体筛选技术包括：
1. 杂交瘤筛选：将免疫细胞与肿瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，然后通过筛选方法选择出具有特定结合能力的杂交瘤细胞。
2. 单细胞技术：利用单细胞分离和扩增方法，将单个B细胞
分离并扩增，然后进行筛选。
3. 羊抗人技术：将目标抗原注射给动物，然后提取动物的抗体，通过与人类抗体结合的方式筛选出具有特异性的抗体。
4. 购买与筛选：从商业抗体库中购买抗体，然后通过实验验证筛选出具有特定结合能力的抗体分子。
5. Phage display技术：利用噬菌体表面展示抗体库，通过与目
标分子结合筛选出具有高亲和力的抗体。
6. 重组抗体技术：通过基因工程技术构建出具有特定结合能力的重组抗体，然后进行筛选。
这些筛选技术的发展使得科学家能够更高效地寻找和筛选出具有特定结合能力的抗体分子，推动了抗体研究和应用的发展。
抗体药物的一般筛选方法
抗体药物的一般筛选方法
抗体药物的一般筛选方法包括以下步骤：
1. 目标选择：确定需要治疗的疾病目标，并确定合适的生物标志物。
2. 抗原鉴定：鉴定目标蛋白质的结构和特性，确定其在疾病中的作用机制。
3. 抗体生成：使用多种方法生成抗体，包括免疫动物、酶联免疫吸附实验（ELISA）和细胞克隆等。
4. 抗体筛选：使用不同的筛选方法，如亲和力纯化、胶体金免疫层析、蛋白质芯片技术等，筛选具有高亲和力和特异性的抗体。
5. 抗体表征：对筛选出的抗体进行表征，包括亲和力测定、特异性检测、结构分析等。
6. 功能鉴定：评估抗体的生物学功能和治疗效果，包括细胞活性、体内活性、生物分布等。
7. 优化和优选：根据筛选和鉴定结果，对抗体进行优化，包括亲和力改进、免疫原降解、药代动力学优化等。
8. 临床前研究：进行动物模型实验，评估抗体的安全性、有效性和副作用等。
9. 临床试验：进行多个临床试验阶段，评估抗体的安全性和疗效。
10. 注册和上市：提交注册申请，获得批准后上市销售。
抗体检测常用筛选方法
抗体检测常用筛选方法抗体检测是一种关键的方法，可用于检测人体内的抗体水平，以判断是否感染了某种病原体或接种了某种疫苗。
通过抗体检测，医生可以评估病人的免疫状态，并进行相应的治疗和预防。
在抗体检测中，常用的筛选方法包括酶联免疫吸附检测（ELISA）、免疫荧光检测、免疫印迹和流式细胞术等。
首先，酶联免疫吸附检测（ELISA）是一种常用的抗体检测方法。
ELISA利用抗原与抗体的特异性结合来检测抗体的存在。
该方法通常涉及将目标抗原吸附到固定表面上，然后与待测样品中的抗体相互作用。
通过添加特定的酶标记抗体和底物，可以观察到酶的催化反应，从而确定抗体的存在和数量。
其次，免疫荧光检测是一种基于荧光标记的抗体检测方法。
该方法使用荧光染料标记的抗体与待测样品中的抗原相互作用。
当光束照射待测样品时，荧光染料会发射出特定的荧光信号。
通过观察样品中的荧光信号的强度和分布，可以确定抗体的存在和分布情况。
另外，免疫印迹是一种常用的蛋白质检测方法，也可以用于抗体的筛选。
该方法涉及通过将待测样品中的蛋白质分离和定位。
首先，样品中的蛋白质会通过凝胶电泳分离，然后转移到固定于膜上的蛋白质上。
接下来，待测样品中的蛋白质与特定抗体相互作用，这些抗体通常以酶标记。
最后，通过加入底物，可以观察到酶的催化反应，并确定抗体的存在和数量。
最后，流式细胞术是一种用于细胞表面抗原检测的方法。
该方法涉及将待测细胞与荧光标记的抗体相互作用。
通过在流式细胞术仪器中将细胞悬浮在液体中，并通过激光束照射，可以测量荧光标记的抗体所产生的荧光信号的强度和分布。
通过观察细胞表面抗原的荧光信号，可以确定抗体的存在和数量。
抗体检测是一种重要的实验室技术，具有许多临床应用。
它可以用于诊断疾病，评估疫苗的有效性，监测患者治疗过程中的免疫反应等。
通过选择适当的抗体检测方法，可以提高检测的灵敏性和准确性，为医生提供更多的有关患者免疫状态的信息。
然而，抗体检测也存在一些局限性。
09抗体筛选试验 (凝聚胺法)
抽取受血者静脉血3-4ml（操作中小心防止红细胞破损），放入一已贴标签干燥洁净的试管中为血清管。待标本凝固后离心分离血清使用。
以上标本有效期为三天；若受血者抽取标本后，输用过血液或血液制品，且输用时间超过12小时的，必须重新采集标本。
[操作步骤]
1．取出2支干燥洁净小试管分别标记测试（1）及（2）：
东莞常平医院
血库
文件编号：
DGCPH-BK-SOP-09
抗体筛选试验（凝聚胺法）
版序：2005-1
页码：第1页，共2页
[原理]
凝聚胺试验是利用低离子溶液促进红细胞抗原与血清（浆）中的抗体反应，再利用凝聚胺引起红细胞间非免疫性的凝集，让已有抗体（IgG）反应的红细胞间的距离缩短。距离缩短后更能引起已反应的抗体和别的红细胞产生反应形成免疫性的凝集。而由凝聚胺所引起的非免疫性红细胞凝集反应可被后来加入的复悬液所中和而散开，如有免疫反应，凝集就不会散开，为阳性反应。如没有免疫反应，凝集就会散开，为阴性反应。抗体筛选试验是检测患者血清（浆）中是否含有具临床意义的红细胞异体抗体。
3．再滴入2滴*2凝聚胺溶液，轻轻混匀，于室温下静置15秒。
4．3400rpm离心1分钟，然后把上清液倒掉，管底保留大约0.1ml的液体。
5．目测红细胞有无变成凝块，然没有凝集现象出现，可能试剂失效。
6．各滴入2滴*3复悬液，并轻轻混匀，观察结果。若为凝聚胺引起的非免疫性凝集，应该在1分钟内散开抗体筛选结果为阴性；若是异体抗体所引起的免疫性凝集，则不会散开，抗体筛选结果为阳性，应进一步做抗体鉴定。
7．抗体筛检应严格控制温度与时间，因部分抗原、抗体集反应凝块比较脆弱，观察反应结果时，应轻轻侧动试管，不可用力振摇。
[结果判断]
免疫抗体包被筛选法
免疫抗体包被筛选法
免疫抗体包被筛选法是一种利用抗体与抗原之间的特异性结合来筛选特定抗体的方法。
这种方法的步骤通常如下：
1.选择要用于包被的抗原：这种抗原应是目标抗体的特异性抗原，或者与目
标抗体有交叉反应的抗原。
2.将抗原包被在固相载体上：通常使用的是酶标板或免疫试管等固相介质，
可以通过物理吸附或共价结合的方式将抗原固定在固相载体上。
3.洗涤以去除未结合的抗原：通过洗涤步骤，可以去除未结合的抗原和其他
杂质，以提高特异性结合的效率。
4.加样和孵育：将含有目标抗体的样品加入已经包被了抗原的固相载体中，
并进行孵育。
孵育时间根据具体的实验条件而定，目的是让抗体与抗原充分结合。
5.洗涤和检测：洗涤以去除未结合的抗体，然后通过酶标显色或荧光检测等
方法检测特异性结合的抗体。
抗体库筛选技术介绍
抗体库筛选技术介绍导读自从噬菌体展示技术于1985年创立以来,细胞生物学、免疫学、蛋白质工程以及医药行业等领域深受影响。
它从根本上了改变了传统的单抗制备流程(杂交瘤技间接术)，宣告在体外改良抗体的特异性以及进行亲和力成熟。
随着该技术的不断发展,继而出现了核糖体展示、mRNA展示、细菌展示和酵母展示等多种展示技术.这篇文章主要以噬菌体展示抗体库为例，来介绍抗体库的筛选技术。
抗体库的筛选是指从抗体库中筛选出针对某一抗原的特异性抗体，是获得高亲和力抗体过程中的关键环节。
那什么是抗体库呢？通过PCR和DNA重组技术克隆人类或者动物体内全套抗体可变区基因（关于抗体的具体结构详见抗体的基本结构），并通过展示技术进行表达，得到的全套抗体基因表达文库即为抗体库.图1、抗体库克隆的抗体基因片段（SCFV）图2、噬菌体展示抗体库构建流程由于单抗性质的千差万别，抗体库的筛选需要根据不同的单抗制定严格的筛选条件，优化筛选方法，因此抗体库的筛选技术一直处于发展和改进的状态,根据出现时间的先后,主要分为经典筛选法和新型筛选法。
1、经典筛选法经典筛选法主要包括固相筛选法和液相筛选法，适合针对性质明确并且可纯化的抗原进行抗体筛选。
固相筛选法是通过包被在酶标板或者免疫试管等固相介质上的抗原富集高亲和性的噬菌体；液相筛选法是将生物素化的抗原包被在与亲和素偶联的磁珠或琼脂糖上，通过磁珠富集能与抗原特异性结合的噬菌体抗体，再通过洗涤、洗脱、回收等步骤。
如此反复筛选数次,可得到高亲和性的噬菌体.这两种方法可通过添加脱脂牛奶或者BSA来减少非特异性结合.2、新型筛选法对于抗原无法提纯或者性质不明确的情况（如癌细胞表面受体），或者经典筛选过程可能造成抗原失活的情况,需要开发新的筛选方法。
目前的新型筛选法主要有细胞筛选法、组织切片或体内筛选法、选择感染筛选法和蛋白质芯片筛选法等。
细胞筛选法:细胞筛选能维持抗原和抗体的天然构象，因此在对肿瘤细胞筛选方面应用较多，该技术还适合于细胞表面受体筛选和抗原鉴定等。
抗体筛选新方法
抗体筛选新方法肿瘤、炎症、自身免疫性疾病（如:红斑狼疮、类风关、克隆氏病、多发性硬化)、神经退行性疾病、传染疾病等多种疾病中，患者体内都会产生和累积大量的自身抗体,有些自身抗体在特定疾病的早期,甚至是疾病的可视化症状出现之前就已经出现（图1），这为疾病的早期诊断提供了可靠地生物标志物；而有些自身抗体则是机体抵抗疾病侵袭的自身保护性抗体,这则为疾病的治疗提供了新的思路，正如全球知名的制药巨头提供的数据显示,大型制药公司利润的60％已经来自属于抗体的药物（图2）。
图1. 自身抗体往往出现在疾病的可视化症状之前图2. 大型制药公司60％的利润已经来自抗体类药物那么，如何发现这些潜在的自身抗体呢？。
目前，最适合筛选自身抗体的方法为蛋白质芯片法,一张蛋白芯片往往有成千上万种蛋白质点,可以一次性筛选一个样本中可以与这些蛋白质相互作用的自身抗体,再通过标有荧光标志物的抗Human IgG的二抗进行孵育以及荧光检测，就可以发现这些自身抗体(图3)。
图3。
蛋白芯片筛选自身抗体过程示意图原理很简单,但是却很难做好,为什么呢？这就不得不说一下抗体与抗原的结合过程了.简而言之就是对应抗体识别抗原上特异的抗原表位，然后结合上去.而抗原表位分为两种，线性表位（Linear epitope）以及非连续性表位（discontinuous epitope）。
线性表位由一段连续的氨基酸序列组成，识别线性表位的抗体识别这段氨基酸序列并产生抗原抗体的结合反应；而非连续性抗原表位则由不连续的氨基酸组成,通过抗原蛋白质的正确折叠之后，靠近在一起，被相应抗体识别,产生抗原抗体结合反应（图4）.图4. 线性表位与非连续性表位被对应抗体识别并结合示意图在生物体内，大多数的自身抗体是识别抗原的非连续性表位的，正确识别筛选出这些自身抗体，就需要蛋白质芯片上的蛋白质是全长、正确折叠并且有生物功能的。
可是，传统的蛋白质芯片只能保证芯片上合成的蛋白质是全长的（有些还不能保证）,无法保证蛋白质正确折叠，更无法保证相应蛋白质具有正常的生物功能。
抗体筛选方法
抗体筛选方法
抗体筛选方法是一种用于筛选特定抗体的技术方法。
通常情况下，抗体筛选方法可以分为两种：基于免疫反应原理的筛选方法和基于分子亲和力的筛选方法。
基于免疫反应原理的筛选方法包括：直接ELISA法、间接ELISA 法、竞争ELISA法、免疫印迹法等。
这些方法的原理是利用抗体与抗原之间的特异性反应，通过检测抗体与抗原之间的结合情况，来筛选具有特异性的抗体。
基于分子亲和力的筛选方法包括：亲和层析法、磁珠分离法、表面等离子体共振技术、芯片技术等。
这些方法的原理是通过利用抗体与目标分子之间的结合能力来筛选具有高亲和力的抗体。
抗体筛选方法的选择取决于抗体的特定要求以及所需的应用场景。
在实际应用中，需要根据具体的情况来选择最适合的抗体筛选方法，以获得高品质、高效率的抗体。
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三种不规则抗体筛选方法对比分析
三种不规则抗体筛选方法对比分析
范少英;杨君青
【期刊名称】《河北医药》
【年(卷),期】2010(32)16
【摘要】@@ 红细胞ABO血型以外的不规则抗体是引起输血不良反应、新生儿溶血病、血型鉴定困难及疑难配型等的主要原因[1].交叉配血不合时,对有输血史、妊娠史或短期内需要接受多次输血者必须按<全国临床检验操作规程>有关规定作抗体筛选试验[2].本文采用微柱凝胶法、凝聚胺法和LIM抗人球法对献血者血清进行不规则抗体检测.
【总页数】2页(P2275-2276)
【作者】范少英;杨君青
【作者单位】066001,河北省秦皇岛市血站;066001,河北省秦皇岛市血站
【正文语种】中文
【中图分类】R446.1
【相关文献】
1.三种不规则抗体筛选细胞对比 [J], 左金玲;刘昕;牛丽彬
2.微柱凝胶法和凝聚胺法在不规则抗体检测的对比分析 [J], 滕艺艳;屈雅川
3.三种红细胞不规则抗体筛选试验方法的比较 [J], 孙爱农;许惠根;吴晓燕;黄小红;徐本卫;梁玉初
4.不规则抗体筛选方法的比较 [J], 李炜华
5.聚凝胺-微孔板法不规则抗体筛选方法的建立 [J], 任忠国
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原理和意义
抗筛细胞的要求 试管法抗球蛋白试验 凝胶法抗球蛋白试验 聚凝胺试验 常见疑难问题
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内 套 管壁
反应 室 反 应 室 底 孔 外管壁 亲和凝 胶
特殊粘液
试剂或 盐水 凝胶或 玻璃珠
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凝胶技术的原理
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溶血性抗体：抗体在体外激活补体，导致溶血。 可用5%的EDTA按1:10比例加入血清中，螯合钙离子 ，抑制补体激活。 冷抗体：先离心，37℃孵育2-3分钟，在水浴箱中直 接看结果。 自身抗体：直抗试验。
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常用的质控方法： 1. 聚凝胺法：用阳性对照试剂与待检血清按同样步骤进 行质控试验，结果应为“1+”的弱凝集。
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如果红细胞表面结合了抗体/补体，加入抗球蛋白分子后，可 在这些抗体/补体之间“搭桥”，产生红细胞凝集现象。 自身免疫性溶血性贫血、输血反应、新生儿溶血病的诊断
/wikipedia/commons/1/1c/Coombs_test_schematic.
反应室下端底孔很小，液体在孵育过程中不会流入下方微 柱中。 离心时，反应室中的红细胞和血清混合液穿过反应室底孔 ，与微柱中液体汇合。由于该液体的比重在红细胞与血清 之间，血清比重低，因此不能在离心力的作用下继续向柱 底运动，红细胞的比重略重，能继续向下脱离血清穿过液 体层，直达凝胶上部。 在这一过程中，被IgG致敏的红细胞将与液体层中的抗球 蛋白试剂反应，形成凝集，因而无法穿过凝胶层达到柱底 ，红细胞滞留在凝胶层的顶部。 未被IgG致敏的红细胞不会形成凝集，在离心力作用下会 直达柱底。血清因停留在液体层的上部，不会中和液体层 中的抗球蛋白试剂。柱的形状也很重要，很细或呈扁平状 ，柱内液体不易受离心力作用旋转混合
阳性：前3管中任一管出现凝集，阴性
对照不凝集。 阴性：全部不凝集。“多抗”管中加 质控细胞。 无效结果：阴性对照出现凝集；质控 细胞不凝集。
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原理和意义
试管法
微柱凝胶法 直抗阳性常见原因分析 直抗强阳性红细胞的处理方法
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抗筛细胞的要求 试管法抗球蛋白试验 凝胶法抗球蛋白试验 聚凝胺试验 常见疑难问题
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I.
盐水介质
II. 抗人球介质
37℃，30min或2d LIM, 10-15min或10d LIM, 13min
I
II
III
自身
三洗
I Ps 抗筛细胞I Ps Ps Ps Pc 抗筛细胞II 抗筛细胞III
24nm距离
IgM
IgG
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抗球蛋白试验 - 检测 IgG
通过抗人球蛋白抗体的特异性桥连作用，促进红细胞 的凝集。可分为直接和间接抗球蛋白试验。
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直抗试验的理论及方法 抗筛试验的理论及方法
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原理和意义
试管法
微柱凝胶法 直抗阳性常见原因分析 直抗强阳性红细胞的处理方法
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为什么要处理？ ABO、Rh定型、抗体筛选/鉴定时，阴性对照可能 出现凝集，发生假阳性反应。
怎么处理？热放散法 1%红悬液 56℃放散10min 悬液 直抗试验
2. 试管法间接抗球蛋白试验：自制的IgG致敏红细胞。
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谢谢！
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秦皇岛市中心血站 杨君青 2019.3.30
红细胞表面电荷及其相互间的距离
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IgG和免疫球蛋白
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免疫球蛋白的结构模式图
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抗原-抗体反应
在盐水介质中，红细胞之间的 距离约24 nm；IgM 抗体 Fab端之间的最大距离大于35 nm ；IgG仅14nm，不足以连接 两个相邻红细胞，需借助其他实验技术才能出现凝集反应。
II
III
自身
1000g，15s
抗球蛋白
抗球蛋白
抗球蛋白
抗球蛋白
看盐水结果
1000g，15s
看抗人球结果
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阳性：I、II、III管中任一管出现凝集，自身对照不 凝集。 阴性：全部不凝集。任意一管中加直抗阳性细胞。
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三洗的正确方法： 1. 加入盐水，约至试管总容量2/3处。1000g离心1分 钟，倾去试管内盐水。 2. 振摇试管使红细胞完全悬浮。 3. 重复上述步骤一次。 4. 第三次洗涤，重复第1步，倾去试管内盐水后，保 持管口向下，立即置于吸水纸上1～3秒钟，利用吸 水纸吸尽残留盐水。
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结 果 判 读
如果阴性对照（ctl）阳性，用温盐水/专用稀 释液洗涤RBC ，再配悬液。
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凝胶技术的优点
无需洗涤的抗球蛋白试验 敏感
在凝胶试验中常能发现其它试验不易发现的问题。
结果可保存
试验结果可在冰箱中保存数日，并且较容易被拍成照片。
原理和意义
抗筛细胞的要求 试管法抗球蛋白试验 凝胶法抗球蛋白试验 聚凝胺试验 常见疑难问题
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不同批次的抗筛细胞，抗原谱不一样 抗原的有效性，随保存时间延长，部分抗原失效 抗原选择要符合当地人群的表型频率
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原理和意义
内 套 管壁
反应 室
反 应 室 底 孔
外管壁
特殊粘液 亲和凝 胶
试剂或 盐水 凝胶或 玻璃珠
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凝胶技术的原理
反应室下端底孔很小，液体在孵育过程中不会流入下方微 柱中。 离心时，反应室中的红细胞和血清混合液穿过反应室底孔 ，与微柱中液体汇合。由于该液体的比重在红细胞与血清 之间，血清比重低，因此不能在离心力的作用下继续向柱 底运动，红细胞的比重略重，能继续向下脱离血清穿过液 体层，直达凝胶上部。 在这一过程中，被IgG致敏的红细胞将与液体层中的抗球 蛋白试剂反应，形成凝集，因而无法穿过凝胶层达到柱底 ，红细胞滞留在凝胶层的顶部。 未被IgG致敏的红细胞不会形成凝集，在离心力作用下会 直达柱底。血清因停留在液体层的上部，不会中和液体层 中的抗球蛋白试剂。柱的形状也很重要，很细或呈扁平状 ，柱内液体不易受离心力作用旋转混合
三洗
配2-3%红
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直抗试验的理论及方法 抗筛试验的理论及方法
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原理和意义
抗筛细胞的要求 试管法抗球蛋白试验 凝胶法抗球蛋白试验 聚凝胺试验 常见疑难问题
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原理：
及时发现有临床意义的不规则抗体
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原理和意义
试管法
微柱凝胶法 直抗阳性常见原因分析 直抗强阳性红细胞的处理方法
秦皇岛市中心抗IgG+C3
抗IgG
Pc
抗C3 Pc 1000g，15s 看结果
Pc
AB浆/5%白蛋 白（阴性对照） Pc
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操作技术要求较低
凝胶试验的操作主要是简单的加样和判读，孵育、离心过 程都有专门的设备。其中能被人为改变的因素较少。
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原理和意义
试管法
微柱凝胶法 直抗阳性常见原因分析 直抗强阳性红细胞的处理方法
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IgG阳性：自身抗体、输血反应、新生儿溶血病； 少数健康人 单独C3阳性： 1. IgM冷抗体在体外激活补体：采血时使用EDTA抗 凝管。 2. 自免溶贫： 冷凝集素综合征（-91） 阵发性冷性血红蛋白尿（-94%） 温型自身免疫溶血性贫血（-7%）
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原理和意义
抗筛细胞的要求 试管法抗球蛋白试验 凝胶法抗球蛋白试验 聚凝胺试验 常见疑难问题
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蛋白凝集：
红细胞凝集
缗钱状凝集
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蛋白凝集： 1. 离心后在盐水介质即出现的、无明显反应格局的、 对反应温度（4℃、室温、37℃）变化不敏感的凝 集，结合镜检结果可判定为蛋白凝集。 2. 处理方法：可在另一根试管中加入相同的2滴血清 以及2滴生理盐水，再加入1滴红细胞，轻摇后离心 观察结果。凝集结果明显减弱。
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看细胞扣的方法： 1. 轻轻转动或摇动试管，让液面反复冲刷细胞扣。 2. 每次冲刷可将少量红细胞冲下，观察圆形细胞扣的 上缘，如果随着上缘红细胞不断被冲下而出现缺口， 并有肉眼可见的红细胞凝块脱落，可判定为阳性。 3. 如果上缘始终保持圆滑直至细胞扣消失可判定为阴 性。