抗体筛选理论及方法(杨君青)

秦皇岛市中心血站 杨君青

溶血性抗体：抗体在体外激活补体，导致溶血。 可用5%的EDTA按1:10比例加入血清中，螯合钙离子 ，抑制补体激活。 冷抗体：先离心，37℃孵育2-3分钟，在水浴箱中直 接看结果。 自身抗体：直抗试验。


秦皇岛市中心血站 杨君青
常用的质控方法： 1. 聚凝胺法：用阳性对照试剂与待检血清按同样步骤进 行质控试验，结果应为“1+”的弱凝集。
秦皇岛市中心血站 杨君青



原理和意义
抗筛细胞的要求 试管法抗球蛋白试验 凝胶法抗球蛋白试验 聚凝胺试验 常见疑难问题
秦皇岛市中心血站 杨君青

蛋白凝集：
红细胞凝集
缗钱状凝集
秦皇岛市中心血站 杨君青
蛋白凝集： 1. 离心后在盐水介质即出现的、无明显反应格局的、 对反应温度（4℃、室温、37℃）变化不敏感的凝 集，结合镜检结果可判定为蛋白凝集。 2. 处理方法：可在另一根试管中加入相同的2滴血清 以及2滴生理盐水，再加入1滴红细胞，轻摇后离心 观察结果。凝集结果明显减弱。
秦皇岛市中心血站 杨君青
原理和意义
抗筛细胞的要求 试管法抗球蛋白试验 凝胶法抗球蛋白试验 聚凝胺试验 常见疑难问题
秦皇岛市中心血站 杨君青
内 套 管壁
反应 室 反 应 室 底 孔 外管壁 亲和凝 胶
特殊粘液
试剂或 盐水 凝胶或 玻璃珠
秦皇岛市中心血站 杨君青
凝胶技术的原理
秦皇岛市中心血站 杨君青


如果红细胞表面结合了抗体/补体，加入抗球蛋白分子后，可 在这些抗体/补体之间“搭桥”，产生红细胞凝集现象。 自身免疫性溶血性贫血、输血反应、新生儿溶血病的诊断
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/1c/Coombs_test_schematic.

三洗
配2-3%红
秦皇岛市中心血站 杨君青
直抗试验的理论及方法 抗筛试验的理论及方法
秦皇岛市中心血站 杨君青
原理和意义
抗筛细胞的要求 试管法抗球蛋白试验 凝胶法抗球蛋白试验 聚凝胺试验 常见疑难问题
秦皇岛市中心血站 杨君青

原理：

及时发现有临床意义的不规则抗体
源自文库
秦皇岛市中心血站 杨君青
秦皇岛市中心血站 杨君青



结 果 判 读
如果阴性对照（ctl）阳性，用温盐水/专用稀 释液洗涤RBC ，再配悬液。
秦皇岛市中心血站 杨君青
凝胶技术的优点

无需洗涤的抗球蛋白试验 敏感
在凝胶试验中常能发现其它试验不易发现的问题。

结果可保存
试验结果可在冰箱中保存数日，并且较容易被拍成照片。
阳性：前3管中任一管出现凝集，阴性
对照不凝集。 阴性：全部不凝集。“多抗”管中加 质控细胞。 无效结果：阴性对照出现凝集；质控 细胞不凝集。
秦皇岛市中心血站 杨君青
原理和意义
试管法
微柱凝胶法 直抗阳性常见原因分析 直抗强阳性红细胞的处理方法
秦皇岛市中心血站 杨君青
原理和意义
抗筛细胞的要求 试管法抗球蛋白试验 凝胶法抗球蛋白试验 聚凝胺试验 常见疑难问题
秦皇岛市中心血站 杨君青

不同批次的抗筛细胞，抗原谱不一样 抗原的有效性，随保存时间延长，部分抗原失效 抗原选择要符合当地人群的表型频率
秦皇岛市中心血站 杨君青
原理和意义

秦皇岛市中心血站 杨君青
看细胞扣的方法： 1. 轻轻转动或摇动试管，让液面反复冲刷细胞扣。 2. 每次冲刷可将少量红细胞冲下，观察圆形细胞扣的 上缘，如果随着上缘红细胞不断被冲下而出现缺口， 并有肉眼可见的红细胞凝块脱落，可判定为阳性。 3. 如果上缘始终保持圆滑直至细胞扣消失可判定为阴 性。

II
III
自身
1000g，15s
抗球蛋白
抗球蛋白
抗球蛋白
抗球蛋白
看盐水结果
1000g，15s
看抗人球结果
秦皇岛市中心血站 杨君青

阳性：I、II、III管中任一管出现凝集，自身对照不 凝集。 阴性：全部不凝集。任意一管中加直抗阳性细胞。

秦皇岛市中心血站 杨君青
三洗的正确方法： 1. 加入盐水，约至试管总容量2/3处。1000g离心1分 钟，倾去试管内盐水。 2. 振摇试管使红细胞完全悬浮。 3. 重复上述步骤一次。 4. 第三次洗涤，重复第1步，倾去试管内盐水后，保 持管口向下，立即置于吸水纸上1～3秒钟，利用吸 水纸吸尽残留盐水。

操作技术要求较低
凝胶试验的操作主要是简单的加样和判读，孵育、离心过 程都有专门的设备。其中能被人为改变的因素较少。
秦皇岛市中心血站 杨君青
原理和意义
试管法
微柱凝胶法 直抗阳性常见原因分析 直抗强阳性红细胞的处理方法
秦皇岛市中心血站 杨君青
IgG阳性：自身抗体、输血反应、新生儿溶血病； 少数健康人 单独C3阳性： 1. IgM冷抗体在体外激活补体：采血时使用EDTA抗 凝管。 2. 自免溶贫： 冷凝集素综合征（-91） 阵发性冷性血红蛋白尿（-94%） 温型自身免疫溶血性贫血（-7%）
抗筛细胞的要求 试管法抗球蛋白试验 凝胶法抗球蛋白试验 聚凝胺试验 常见疑难问题
秦皇岛市中心血站 杨君青
I.
盐水介质
II. 抗人球介质
37℃，30min或2d LIM, 10-15min或10d LIM, 13min
I
II
III
自身
三洗
I Ps 抗筛细胞I Ps Ps Ps Pc 抗筛细胞II 抗筛细胞III
秦皇岛市中心血站 杨君青
原理和意义
试管法
微柱凝胶法 直抗阳性常见原因分析 直抗强阳性红细胞的处理方法
秦皇岛市中心血站 杨君青
多抗
抗IgG
抗C3
对照
抗IgG+C3
抗IgG
Pc
抗C3 Pc 1000g，15s 看结果
Pc
AB浆/5%白蛋 白（阴性对照） Pc
秦皇岛市中心血站 杨君青
2. 试管法间接抗球蛋白试验：自制的IgG致敏红细胞。
秦皇岛市中心血站 杨君青
谢谢！
秦皇岛市中心血站 杨君青

反应室下端底孔很小，液体在孵育过程中不会流入下方微 柱中。 离心时，反应室中的红细胞和血清混合液穿过反应室底孔 ，与微柱中液体汇合。由于该液体的比重在红细胞与血清 之间，血清比重低，因此不能在离心力的作用下继续向柱 底运动，红细胞的比重略重，能继续向下脱离血清穿过液 体层，直达凝胶上部。 在这一过程中，被IgG致敏的红细胞将与液体层中的抗球 蛋白试剂反应，形成凝集，因而无法穿过凝胶层达到柱底 ，红细胞滞留在凝胶层的顶部。 未被IgG致敏的红细胞不会形成凝集，在离心力作用下会 直达柱底。血清因停留在液体层的上部，不会中和液体层 中的抗球蛋白试剂。柱的形状也很重要，很细或呈扁平状 ，柱内液体不易受离心力作用旋转混合

秦皇岛市中心血站 杨君青
原理和意义
试管法
微柱凝胶法 直抗阳性常见原因分析 直抗强阳性红细胞的处理方法
秦皇岛市中心血站 杨君青

为什么要处理？ ABO、Rh定型、抗体筛选/鉴定时，阴性对照可能 出现凝集，发生假阳性反应。
怎么处理？热放散法 1%红悬液 56℃放散10min 悬液 直抗试验
秦皇岛市中心血站 杨君青 2019.3.30
红细胞表面电荷及其相互间的距离
秦皇岛市中心血站 杨君青
IgG和免疫球蛋白
秦皇岛市中心血站 杨君青
免疫球蛋白的结构模式图
秦皇岛市中心血站 杨君青
抗原-抗体反应
在盐水介质中，红细胞之间的 距离约24 nm；IgM 抗体 Fab端之间的最大距离大于35 nm ；IgG仅14nm，不足以连接 两个相邻红细胞，需借助其他实验技术才能出现凝集反应。
内 套 管壁
反应 室
反 应 室 底 孔
外管壁
特殊粘液 亲和凝 胶
试剂或 盐水 凝胶或 玻璃珠
秦皇岛市中心血站 杨君青
秦皇岛市中心血站 杨君青
58
秦皇岛市中心血站 杨君青
凝胶技术的原理

反应室下端底孔很小，液体在孵育过程中不会流入下方微 柱中。 离心时，反应室中的红细胞和血清混合液穿过反应室底孔 ，与微柱中液体汇合。由于该液体的比重在红细胞与血清 之间，血清比重低，因此不能在离心力的作用下继续向柱 底运动，红细胞的比重略重，能继续向下脱离血清穿过液 体层，直达凝胶上部。 在这一过程中，被IgG致敏的红细胞将与液体层中的抗球 蛋白试剂反应，形成凝集，因而无法穿过凝胶层达到柱底 ，红细胞滞留在凝胶层的顶部。 未被IgG致敏的红细胞不会形成凝集，在离心力作用下会 直达柱底。血清因停留在液体层的上部，不会中和液体层 中的抗球蛋白试剂。柱的形状也很重要，很细或呈扁平状 ，柱内液体不易受离心力作用旋转混合
24nm距离
IgM
IgG
秦皇岛市中心血站 杨君青
抗球蛋白试验 - 检测 IgG
通过抗人球蛋白抗体的特异性桥连作用，促进红细胞 的凝集。可分为直接和间接抗球蛋白试验。
秦皇岛市中心血站 杨君青
直抗试验的理论及方法 抗筛试验的理论及方法
秦皇岛市中心血站 杨君青
原理和意义
试管法
微柱凝胶法 直抗阳性常见原因分析 直抗强阳性红细胞的处理方法