scFv抗体的筛选和活性研究(Molecular Devices)

靶向FGFR3胞外区域的人scFv抗体的筛选和活性研究
成纤维细胞生长因子(FGF)是最大的一类中胚层和上皮细胞生长分化多肽因子家族。

FGFs在许多生物学过程中发挥重要作用，比如胚胎发育，伤口愈合，血细胞生成及血管发生等。

此外，已有研究表明FGFs可以增加多种肿瘤细胞的浸润性，如前列腺、膀胱、肾脏、乳房、胰腺等部位肿瘤。

目前，共发现20多种FGFs，对不同类型细胞具有不同的作用。

但是，只发现了5种FGF受体(FGFR)。

在蛋白水平上，这些受体具有55%-72%的同源性。

FGFR结构包括一个胞外配体结合区域，一个跨膜区域以及一个胞内激酶区域。

配体结合区域包含三个不同的类似免疫球蛋白结构域(称为免疫球蛋白I，II和III)。

FGFR1-3 mRNA的不同的剪接作用形成两种亚型α和β。

其中FGFR3具有两种不同的突变体IIIb和IIIc。

这两种变体具有不同的亲和活性：IIIc分布更加广泛，能和多种FGFs结合(FGF1，FGF2，FGF4，和FGF9)；IIIb优先和FGF1结合，能够较低程度和FGF8和FGF9结合。

在有肝素(heparin)作用的情况下，FGFs和FGFRs结合后，FGFs诱导受体二聚化，引起胞内激酶区域的自身磷酸化以及下游信号级联反应的激活。

配体受体结合后，FGFs会启动多种信号转导途径：胞内钙离子水平升高，诱导丝裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶C通路，激活腺苷酸环化酶以及诱导原癌基因c-myc 和c- fos。

已发现FGFR3会发生特殊突变，导致其酪氨酸激酶活性激活，引起一些与骨骼发育，多发性骨髓瘤，颈部肿瘤以及膀胱肿瘤相关的综合征。

最近的研究发现FGFR信号是前列腺肿瘤细胞在体外存活所完全必需的。

近来，FGFR3已被作为多发性骨髓瘤的可能治疗性靶点。

尽管已有确实证据表明激活的FGFR3突变存在于肿瘤组织中，但是关于FGFR3在肿瘤组织中的表达知道的非常少。

近来，使用基因芯片技术对基因表达分析后，发现和正常组织相比FGFR3在膀胱肿瘤样品中过表达。

基因表达水平通过Western blot和免疫组化分析在蛋白水平上进一步确证。

事实上，这种蛋白的过量产生在过渡性肿瘤中似乎比基因突变更容易发生。

所有这些数据都表明FGFR3可能是一个非常有吸引力的泌尿外科肿瘤的治疗性靶点。

膀胱肿瘤是生殖泌尿系统第二个最常见的恶性肿瘤之一。

大约40%-50%的膀胱肿瘤表现出FGFR3基因发生突变；表皮肿瘤发生的概率(80%)比浸润性肿瘤更大。

随着人们对FGFR3作为不同肿瘤治疗性靶点的兴趣越来越大，以及进来发现它在过渡细胞瘤中的过度表达，我们已开始使用噬菌体展示技术开发用于治疗的人源抗体。

噬菌体抗体展示是目前最好的一个开发用于研究，临床以及治疗用途人源抗体的方法。

但是，对于抗体开发来说，FGFR3分子非常难以琢磨，因为小鼠和人的FGFR3同源性非常高(92%)。

仅最近，有报道通过使用一个库容非常大(2.1*1010)的商业化Fab库，开发出针对一个FGFR3亚型的Fab片段。

在我们的试验中，我们使用了两个公开的scFv抗体库Tomlinson I + J (MRCGeneservices, Cambridge, United Kingdom)。

两个库的库容都大概在1.4*108。

scFvs相比IgG以及Fabs具有更好的肿瘤浸润性，能够更快速被清除，同时具有更好的特异性。

在这篇报道中，我们已经筛选出了一些对FGFR3a的亚型IIIc具有特异性的人scFv抗体。

这些抗体通过FACS证明可以和膀胱肿瘤细胞系RT112发生反应，并且抑制细胞增殖，具有进一步用于治疗的潜力。

材料和方法
细胞系、蛋白、抗体：
RT112，HEK293；重组人FGFR3a（IIIc）/Fc，FGFR1a（IIIc）/Fc，FGF9，FGF1以及表皮生长因子。

鼠抗人FGFR3单克隆抗体，羊抗人IgG（Fc特异性），鼠抗c-myc单克隆抗体，微管蛋白抑制剂；HRP-抗c-myc抗体，抗6His抗体，抗M13抗体，HRP-抗M13单克隆抗体，FITC-兔抗鼠IgG，R-藻红蛋白羊抗鼠IgG，鼠IgG TrueBlot。

FGFR3 cDNA克隆和细胞转染
FGFR3的胞外区域和人IgG的Fc C端融合表达，构建表达载体pcDNA3.1-FGFR3(IIIc)WT-Fc和pcDNA3.1-FGFR3 (IIIc)S249C-Fc。

然后，转染HEK293T细胞。

免疫印迹法和FACS检测蛋白表达和活性。

从噬菌体库筛选FGFR3特异性scFv抗体
人scFv噬菌体库Tomlin-son I + J，辅助噬菌体KM13，E.coli TG1和HB2151。

分别单独培养两个噬菌体库，然后1:1混合噬菌体用于筛选。

按照示意图1所示，进行噬菌体库筛选和scFv表达。

第一轮筛选，使用1ug FGFR3或人IgG蛋白包被微孔板。

噬菌体先和人IgG孵育1小时去除可以和Fc发生反应的噬菌体；再和FGFR3包被的孔孵育2小时。

最后，微孔板使用0.1%PBST 洗涤10遍(下一轮筛选洗涤20遍)，使用100ul胰蛋白酶处理微孔板，洗脱结合的噬菌体。

洗脱获得的噬菌体按照Goletz等描述的方法进行另一轮的淘选。

图1：噬菌体库筛选FGFR3特异性scFv抗体流程图
噬菌体ELISA
使用0.3ug的FGFR3，FGFR1或者人IgG蛋白包被微孔板，洗涤，封闭，加入不同浓度前面筛选纯化后的噬菌体悬浮液。

孵育后，加入HRP-抗M13抗体，加入底物显色，450nm读取结果。

单克隆噬菌体ELISA
经过两轮或三轮的筛选后收获的噬菌体经过培养生长出克隆，然后使用QPix高通量自动化克隆筛选系统(Molecular Devices)挑取单克隆到含有100ul 2TY培养基的96微孔板，37度培养，第二天使用相同培养基对培养物1:100稀释，然后37度震荡培养2小时，加入25ul含有109辅助噬菌体KM13的2TY培养基，继续培养1小时。

菌体经过离心，重悬于2TY培养基，30度过夜培养。

最后，离心，取50ul上清，进行单克隆噬菌体ELISA分析。

可溶性scFv抗体的表达纯化和ELISA检测
获得的高特异性克隆，使用E.coli HB2151诱导表达，离心收获菌体，提取细菌周质腔蛋白，最后使用亲和色谱纯化。

纯化的各组分使用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析。

纯化的组分进一步使用分子筛层析分离出scFv蛋白的单体(scFv容易发生二聚体或者多聚体)。

表面等离子体共振分析
使用BiacoreX分析可溶性scFv和FGFR3的结合动力学，并且计算获得每个纯化的scFv的Kd值；使用竞争性结合分析确定每个scFv的特异性结合位点。

使用同样的方法分析scFvs和FGF9，FGF1以及EGF是否能竞争结合FGFR3。

流式细胞仪和共聚焦显微镜分析
使用流失细胞仪分析噬菌体scFv和纯化后可溶性scFv在细胞水平上和FGFR3的结合活性。

通过处理RT112细胞，然后使用共聚焦显微镜进一步分析抗体结合活性。

细胞增殖分析
使用不同浓度的抗FGFR3 scFvs抗体(0.02-2umol/L)处理RT-112细胞，48小时后，使用MTT对细胞进行染色，然后570nm 读数。

细胞活力通过下面公式计算：Abs-scFv处理的细胞/Abs-对照组细胞。

结果
筛选FGFR3特异性scFv抗体：如表1所示，总共随机挑选了288个克隆，通过ELISA检测，获得15个FGFR3特异性的抗体克隆。

通过测序发现，15个克隆里面有6个克隆的序列是唯一的。

3A和1D序列内部有一个终止密码子，只在VL的CDR2区有一个碱基突变。

其他4个克隆的序列有比较大的区别，主要区别集中在CDR2和CDR3。

其中CDR3在VH和VL都是高度可变的，CDR2的突变主要集中在VH。

ELISA特异性鉴定发现：如图2所示，尽管FGFR1和FGFR3具有高度同源性(>62%)，6个筛选到的scFv克隆都对FGFR3具有显著的结合特异性；相反和FGFR1的结合活性非常弱，和阴性对照人IgG的反应结果类似。

图2：ELISA检测筛选到的可溶性scFvs结合
特异性。

从培养上清中获得的scFv-pIII融合
蛋白，通过ELISA方法检测和FGFR3-Fc
(黑色)，FGFR1-Fc(灰色)以及阴性对照人
IgG(白色)的结合活性。

使用Biacore分析了纯化后单体scFv抗体和FGFR3的亲和力。

如表2所示，检测了不同scFvs的Kon，Koff以及Kd值。

Kd值在40.9和12.4nmol/L之间变化，表明筛选到的scFv具有中等到较高的亲和活性。

如果考虑了使用的噬菌体的库容只有1.6*108，属于中等大小库容，这个结果已经非常好了。

scFv抗体对RT112细胞表达的FGFR3的活性：使用FACS检测了scFvs和膀胱癌RT112细胞表达的天然FGFR3蛋白的结合活性。

如图3A所以，首先检测了6个scFvs噬菌体克隆，6个克隆都可以和膀胱癌RT112细胞发生显著的反应。

然后，检测纯化后的4个scFvs蛋白(3B，3C，2D，7D)的结合活性，发现3C和7D可以和RT112细胞发生显著的反应，2D和3B的反应活性相对较弱。

使用共聚焦显微镜观察了3C和7D染色的细胞，进一步显示出scFv的膜蛋白染色特征(图3A)。

通过在非变性条件下的免疫沉淀方法进一步证明scFv和FGFR3的亲和特异性。

如图3B所示，纯化后的两个scFv（3C和7D）都在正确的位置产生显著的蛋白条件，进一步证明这两个scFv抗体可以识别可溶性的和天然的FGFR3受体。

scFv抗体和FGFR3突变体的反应活性：因为FGFR3在膀胱癌细胞中经常发生突变，所以，也检测了两个scFv抗体和FGFR3 S249C突变体的结合活性，已有报道FGFR3 S249C是在膀胱癌细胞中最经常发生的突变形式。

通过PCR方法在FGFR3中引入上面的突变，并通过DNA测序证明突变位点正确(如图4A)。

通过western bolt验证转染的HEK293T细胞可以正确表达突变的FGFR3S249C蛋白(如图4B)，并且FGFR3S249C具有和野生型FGFR3WT相类似的表达水平。

FACS分析证明两个scFvs 3C和7D都可以识别表达了突变FGFR3蛋白的HEK293T细胞，甚至比表达野生型FGFR3蛋白的细胞的反应活性更强(图4C)。

抑制RT112细胞增殖：我们检测了scFvs在体外抑制RT112肿瘤细胞增殖的有效性。

加入三个不同浓度的scFv到RT112细胞，如图5A所示，两个scFv 3C和7D都能够显著抑制细胞增殖，而且抑制效应和加入的抗体浓度成正相关。

2umol/L浓度的时候，抑制活性最强，但是在0.2umol/L的时候，仍然具有显著的抑制活性。

除此之外，检测了不同的生长因子对scFvs抑制效应的影响。

如图5B所示，scFvs的抑制效应具有蛋白因子特异性。

3C和7D都可以抑制由FGF9诱导的增殖，但是，只有7D能够抑制FGF1诱导的增殖。

两个scFvs抗体都不能抑制EGF诱导的细胞增殖，此外，加入可溶性的FGFR3蛋白，可以掩盖掉scFv的抑制效果。

从形态学上看，3C和7D处理后，细胞形态会发生变化，尤其是7D处理后能明显导致细胞空泡形成(图5C)
图3.FACS和共聚焦显微镜分析噬菌体、可溶性scFvs 蛋白和RT112膀胱癌细胞的结合活性。

A. FACS 直方图显示每个scFv克隆的结合活性(粗线)以及背景荧光(灰色)。

RT112细胞使用3C 和7D scFvs标记，使用FITC荧光抗体以及DAPI染色细胞。

激光共聚焦显微镜下成像显示(绿色)scFvs蛋白结合细胞膜，(红色) DAPI染色细胞核区域。

B. RT112细胞裂解液FGFR3 IP分析。

A.RT112细胞裂解液；B. 阴性对照；C, scFv
3C；D, scFv7D。

图4.筛选到的scFvs和FGFR3突变体胞外区域的反应活性。

A.测序显示DNA序列中引入突变：Ser(TCC) 249 突变为Cys (TGC)。

B. 免疫印迹分析证明野生型FGFR3和突变FGFR3 (S249C) 在HEK293T细胞中的表达。

C.F A C S分析s c F v蛋白和表达野生型FGFR3及突变FGFR3 (S249C) HEK293T细胞的结合活性。

柱状图中：灰色表示阴性对照；黑色线表示
FGFR3(IIIc)WT ；虚线表示FGFR3(IIIc)S249C。

图5. FGFR3特异性的scfvs抗体对RT112细胞增殖的
抑制。

A. 不同浓度的3B, 3C, 2D和7D scFvs抗体对
RT112细胞的抑制活性。

C. 2 umol/L 3C and 7D
scFvs处理细胞后，细胞数目和形态的分析。

讨论
FGFR3是一个受体酪氨酸激酶，通过激活不同的信号通路在细胞生长和肿瘤形成过程中发挥作用。

除了膀胱癌，FGFR3在许多类型肿瘤中发生突变和过表达，所以FGFR3能作为一个优秀的有效的治疗的肿瘤靶点。

以前的研究表明，可溶性的天然FGFR3的胞外配体结合区域具有抑制细胞增殖的效应，原理就是可以竞争结合配体，减少配体和细胞表面受体结合。

抗体片段可能模仿类似的机制来抑制细胞增殖，事实上，许多研究已经表明，3C和7D能够抑制RT112细胞增殖的机理就是抗体片段直接阻止了FGF-FGFR3的相互作用，从而抑制了FGFR3的激活。

但是3C和7D结合FGFR3后的解离速度太快(即Koff值太高约1.22*10-2和6.14*10-2)，Koff的减少，意味着Kd值的增加，即抗体亲和力增加。

所以，可以以3C和7D scFv的序列为模板，在此基础上通过CDR区突变或者体细胞突变模仿来进行亲和力成熟。

参考资料
1. Jorge Martínez-Torrecuadrada, Gabriela Cifuentes, Paula López-Serra, et al., Targeting the Extracellular Domain of Fibroblast Growth Factor Receptor 3 with Human Single-Chain Fv Antibodies Inhibits Bladder Carcinoma
Cell Line Proliferation. Clin Cancer Res 2005;11:6280-6290.。