单克隆抗体制备中两次筛选

学生的问题：教材中，在单克隆抗体制备中两次提到筛选问题，甚至提到了阳性细胞，对于两次筛选的方法和目的始终是一些人的困惑，那么两次筛选的目的和方法到底是什么。

第一次筛选

首先，在已免疫过的B淋巴细胞（即效应B细胞）和骨髓瘤细胞进行杂交时，可能出现的情况应该先弄清楚。

如果只考虑两两融合，可能的情况有：（效应）B淋巴细胞和（效应）B淋巴细胞的融合；（效应）B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合（即杂交瘤细胞）；骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞的融合（即瘤瘤细胞）。

第一类细胞在体外培养的条件下，因为无法无限增殖，最终死亡，因此，筛选的关键是限制第二类细胞的增殖。科学家在设计实验时，已经考虑到这方面问题，所以他们选择的瘤细胞是有遗传缺陷的，即胸腺嘧啶核苷激酶缺陷（TK－）或者次黄嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT－）缺陷。

筛选的目的：获得杂交瘤细胞。

筛选的方法： 用选择性培养基来完成，即HAT培养基。

加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的培养基称HAT培养基。

其中，氨基喋呤可阻断DNA合成的主要途径。主要途径阻断后，依靠应急途径即在HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）和TK（胸苷激酶）作用下，利用胸腺嘧啶和次黄嘌呤合成DNA，缺少其中一种，DNA合成不能发生。

用于杂交的骨髓瘤细胞系均由经有毒药物诱导而成选择产生的代谢缺陷型细胞，细胞内均无TK或HGPRT，所以单个或融合骨髓瘤细胞在HAT培养液中将死亡。B细胞虽然有HGPRT和TK，但在体外通常培养条件下，尤其是在单个细胞环境下难于长期存活和增殖传代。

因此，只有杂交瘤细胞才能在HAT培养液中生长繁殖。

即:

淋巴细胞：不能生长，5到7天死亡；DNA的主要合成途径被A阻断。

骨髓瘤细胞：不能生长，5到7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的旁路途经受阻。

骨髓瘤细胞和脾细胞融合形成杂交瘤细胞，可长期生长繁殖。利用淋巴细胞的HGRT将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息，从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力。

由于通过以上方法选择出杂交瘤细胞，虽然都是杂交瘤细胞，但可能是同一抗原的不同抗原决定簇刺激产生的。所以产生抗体是不纯的。如果不进一步提纯，这样得到的是多克隆抗体，所以，需要第二次筛选。

第二次筛选

要想获得单克隆抗体，所以必须得到由一个细胞分裂而成的一个细胞群，由这样的细胞群产生的抗体才是真正意义的单克隆

抗体。

筛选的目的：

筛选只针对某一种特定的抗原决定簇产生抗体的杂交瘤细胞，即得到由一个细胞分裂而成的一个细胞群并且能产生所需抗体

筛选的方法：

（1）分离单个细胞置入多孔培养板的每个孔中培养。

（2） 检测每孔细胞是否产生所注射抗原的抗体（即教材插图中提到的选出能产生特定抗体的阳性细胞群）所以筛选的条件是两层意思：单个细胞单孔培养保证每个孔中的细胞在产生抗体时是针对同一抗原的同一抗原决定簇产生的的，但每个孔中细胞却不一定都能产生抗体，把那些不产生抗体的细胞淘汰，对能分泌针对抗原某一决定簇抗体的阳性细胞选择下来继续克隆，从而保证大量的生产所需抗体。

最后，对选择下来的细胞进行克隆方法有两种：一种可以在体外培养；一种可以一直到小鼠腹腔中增殖,即可从中提取所需要的单克隆抗体。

附：关于两次专一抗体检验阳性（《生物学教学》）

在制备单克隆抗体的过程中要进行至少两次专一抗体检验阳性，如何理解多次专一抗体检验阳性这个概念呢？

融合后细胞是用细胞培养板来培养的，此时每个孔里加的是HAT培养基。培养的结果是有的孔有细胞，即有杂交瘤细胞；有的孔可能没有细胞，也就是无杂交瘤细胞。但是，有细胞的孔并不是都能产生目标抗体，有可能产生的是其他抗体。这是因为脾细胞中包含多种B细胞，它们产生的是不同的抗体。为了得到目标抗体，当然要进行检测，这就是所谓的“专一抗体检验”。“阳性”是一种术语，代表“存在”;“阴性”代表“不存在”。“检验阳性”的意思就是有这种抗体。被检验为阳性的孔称为“阳性孔”，这个孔里的细胞才有进行下一步处理的价值。这是第一次“专一抗体检验”。

阳性孔中的细胞除了含有分泌需要的特异性抗体的细胞外，还可能含有分泌其他抗体的细胞，也可能含有不分泌抗体的细胞，所以不能直接把阳性孔的细胞用以生产单克隆抗体。要进行第二次筛选，这个步骤称为“杂交瘤细胞的克隆化”。所谓克隆化是指使单个细胞无性繁殖而获得该细胞集团的整个培养过程。常用的方法包括有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法等。有限稀释法的简要过程就是将阳性孔细胞计数，将计数后的细胞准确地进行系列稀释，直至每毫升含10个细胞，再把稀释液接种到细胞培养板，按每孔接种0．1mL细胞悬液，即每孔含1个细胞。其他方法原理和操作不同，但是最终目的都是每个孔中接种1个细胞。如此每个孔中培养出来的细胞都

是单克隆细胞。

接下来就要进行第二次“专一抗体检验”，结果为阳性的细胞就是能分泌目标抗体的单克隆细胞，这些细胞就可以进行大规模的培养。教材中提到可能要进行多次“专一抗体检验”，是因为进行一次有限稀释法可能得到的不是单克隆细胞，要进行第三次甚至更多次的有限稀释和克隆化培养，还要再进行第三次甚至更多次“专一抗体检验”。