第七章 目的基因的克隆与遗传转化
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转座子DNA探针
插入突变体
鉴定性状 遗传分析
筛选突变DNA 文库，PCR， RACE
基因部分DNA探针
完整目的基因
筛选野生型DNA 文库，PCR， RACE
7
(5)差异显示法 在生物个体发育不同阶段，或不同的组 织与细胞中或不同环境下，基因表达差异。即不同基因有 序的时空表达方式，叫做基因的差异表达。差异显示 PCR(differential display-PCR,DD-PCR)是指通过对来源 特定组织类型的总mRNA进行PCR扩增、电泳，并找出待测组 织和对照之间的特异扩增条带。
(三〕受体材料的选择
受体是指用于接受外源DNA的转化材料。良好的植物基因转
化受体系统应满足如下条件： 1、高效稳定的再生能力； 2、受体材料要有较高的遗传稳定性； 3、外植体来源方便，如胚和其它器官等；
4、对筛选剂敏感；
5、转化率高
13
常用的受体材料有以下几大类型:
1.愈伤组织再生系统
在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接 中，可促使砧木与接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木和接 穗沟通；在扦插中，从伤口愈伤组织可分化出不定根或不定芽， 进而形成完整植株。在植物器官、组织、细胞离体培养时，条 件适宜也可以长出愈伤组织。在一定条件下可进一步诱导器官 再生或胚状体而形成植株。外植体材料经过脱分化培养诱导形 成愈伤组织，转化（带有目的基因质粒的农杆菌侵染），分化 培养获得再生植株。下胚轴 优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因， 转化效率高。 缺点：遗传稳定性差、嵌合体
26
（六）转化体的安全性评价和育种利用
根据有关转基因产品的管理规定、在可控制的条件下进行安全 性评价和大田育种利用研究。 通过转基因方法往往难以直接获得理想的品种（系）原因：外 源基因失活、纯合致死、花粉致死、其它性状变化等。 因此获得转化体后，应结合杂交、回交、自交等常规转育手段，
最终选育综合性状优良的转基因品种。
目的基因体外重组到适当的已改造的质粒中 包括保存用中间载体（大肠杆菌寄主）：pBR322、pUC、 繁殖载体（大肠杆菌寄主）： JM109, TOP10 植物转化载体（农杆菌寄主）： pBI121, pCAM1001
10
选择标记基因
如何选择和筛选转化体同样是一个重要问题。科学 家一直试图把转化体带上一个标记，从而便于选择和 筛选。至今己建立了许多标记基因，并已插入各种转 化载体中，作为一种标记基因。 选择性标记基因是指在遗传转化中能够使转化细 胞(或个体)从众多的非转化细胞中筛选出来的标记基 因.它们通常可以使转基因细胞产生对某种选择剂具有 抗性的产物,从而使转基因细胞在添加这种选择的培养 基上正常生长,而非转基因细胞由于缺乏抗性则表现出 对此选择剂的敏感性,不能生长。带有抗菌素抗性基因 的受体菌能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中 11 生长。
27
转基因作物的生物安全性
直至今天，转基因作物的安全性在全球范围内引起了 激烈的争论。 反对者认为转基因作物具有极大的潜在危险，可能会 对人类健康和人类生存环境造成威胁。
28
国际上有几个典型的事件。
Pusztai事件： 英国Rowett研究所有位Pusztai博士，他用转雪花莲凝集素基因的土豆喂大鼠， 1998年秋天在英国电视台发表讲话，声称大鼠食用了这种土豆后，体重和器 官重量减轻，免疫系统受到了破坏。 后果：绿色和平组织、地球之友等反生物技术组织把这种土豆说成“杀手”， 并策划了破坏转基因作物试验地等行动，焚烧了印度的两块试验田，甚至美 国加州大学戴维斯分校的非转基因试验材料也遭破坏，以致研究生毕业论文 都无法如期完成。 英国皇家学会组织了同行评审，并于1999年５月发表评论，指出Pusztai的试 验有六方面的错误：不能确定转基因和非转基因马铃薯的化学成分有差异； 对食用转基因土豆的大鼠，未补充蛋白质以防止饥饿；供试动物数量少，饲 喂几种不同的食物，且都不是大鼠的标准食物，缺少统计学意义；试验设计 差；统计方法不当；试验结果无一致性等。
23
特异性PCR检测外源基因整合到受体
24
(2) 转录水平的鉴定
常用的方法 Northern杂交（标记的RNA为探针对总RNA杂交） RT-PCR 检测
mRNA cDNA PCR
25
（3）翻译水平的鉴定
为检测外源基因转录形成的mRNA能否翻译，还必须进行翻译或 者蛋白质水平检测。
主要方法：Western杂交
随机引物+3’ 锚定poly(t)引物
叶
根
叶mRNA
反转录
PCR PAGE
根mRNA
反转录
PCR
8
(6) 电子克隆 in silico cloning 借助于电子计算机，利用公布的核酸序列资料， 进行序列的拼接和组装最终获得完整基因序列的技 术，类似于cDNA文库的筛选但更加方便和快速。
9
（二）目的基因重组质粒的构建
第七章 目的基因的克隆与遗传转化
1
(一)目的基因的克隆 根据获得基因的途径主要可以分为两大类： 根据基因表达的产物—蛋白质进行基因克隆； 从基因组DNA或mRNA序列克隆基因。
1.根据基因表达的产物—蛋白进行基因克隆 主要步骤如下： 分离蛋白质 明确氨基酸序列 推导核苷酸序列 人工合成
利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。 虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因。 局限性：兼并密码子?
Tumor induced by A. tumefaciens
19
Ti Plasmid
T-DNA region
已知农杆菌附着到 植物细胞后，只留
auxin
Left border Right border
在细胞间隙中。TDNA首先在细菌中被 加工、剪切、复制， 然后转入植物细胞。
vir genes
ori
外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复 制和表达。 农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒 (root-indcing plasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应 用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。
18
• 农杆菌: 包含Ti质粒 Tumor inducing plasmid (bacterial plasmid) • T-DNA (TransferredDNA), 可以转移进入植 物基因Hale Waihona Puke Baidu.
29
斑蝶事件：
1999年5月，康奈尔大学的一个研究组在《Nature》杂志 上发表文章，声称转基因抗虫玉米的花粉飘到一种名叫“马利 筋”的杂草上，用马利筋叶片饲喂美国大斑蝶，导致44％的幼 虫死亡。 这一实验结果在科学上没有说服力：玉米的花粉非常重， 扩散不远，在玉米地以外５米，马利筋叶片/CM2上只找到一个 玉米花粉；2000年开始在美国三个州和加拿大进行的田间试验 都证明，抗虫玉米花粉对斑蝶并不构成威胁，实验室试验中用 １０倍于田间的花粉量来喂大斑蝶的幼虫，也没有发现对其生 长发育有影响。 斑蝶减少的真正原因，一是农药的过度使用，二是墨西哥 生态环境的破坏。 30
中国Ｂt抗虫棉破坏环境事件： 2002年6月3日，南京环科所与绿色和平组织在北京召开会 议，６月４日《China daily》上发表了题为“GM （genetically modified） Cotton Damage Enviroment”的文 章。
20
2.外源基因直接导入法
最主要的是基因枪轰击法
（微弹轰击技术micro-projectile bombardment)
将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，借助高压动力射入受体 细胞或组织，最后整合到植物基因组并得以表达。 步骤简单易行：适合于大多数细胞或组织，克服了受体材料的限制，不 必制备原生质体，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最 有效方法之一。 到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数禾本科农作物、果 树花卉和林木等植物上获得转基因植株。 单子叶植物
Gus基因（β-葡糖苷酸酶基因）
在植物细胞中所产生的葡糖苷酸酶在检测上具有以下特点： 在一定条件下与X-G1ucuionic acid （5-bromo-4-chioro-3-indoylβ-D-glucuronic acid）底物发生作用，产生蓝色沉淀，可以直接 观察到植物组织中形成的蓝色斑点。
12
化受体系统； 二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管
导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。
16
（四）转基因方法 概括起来说主要有两类：
第一类是以载体为媒介的遗传转化，也称为间接转移系统法。
第二类是外源目的DNA的直接转化。
17
1.载体介导转移系统
最常见的转基因方法。
将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的
4.胚状体再生系统
是指具有胚胎性质的个体。
优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力强， 嵌合体少，易于培养、再生。
缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。
5.生殖细胞受体系统
以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的 系统。
一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转
2
2.从基因组DNA或mRNA序列克隆基因
(1)同源序列法 (Homology Based Candidate Gene Method) 根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有保守氨基酸序列的特 点克隆基因家族未知成员。
氨基酸序列比较
设计简并引物
PCR扩增
文库筛选/RACE
3
(2)表达序列标签EST是指能够特异性标记某个基因的部分序列，通常包 含了该基因足够的结构信息区，可以与其它基因相区分。主要是通过 cDNA的途径获得。 获得EST的途径: 大规模cDNA文库测序 各种mRNA水平的分析手段
21
（五）转化体的筛选和鉴定 1.转化体的筛选 外源目的基因转化频率低 目的基因已被整合到核基因组并表达的转化细胞很少，使用特异 性选择标记基因（selectable marker genes）进行标记，有效 地选择出真正转化细胞。 常用选择标记基因： 抗生素抗性基因 除草剂抗性基因 标记基因在受体细胞表达，使转化细胞具有抵抗相应抗生素 或除草剂的能力而存活下来。非转化细胞则被抑制、杀死。
22
2.转化体的鉴定 通过筛选得到的再生植株初步证明标记基因整合进入受体 细胞。至于目的基因是否整合到受体核基因组、是否表达，
还必须对抗性植株进一步检测。
(1)DNA水平的鉴定 检测内容：是否整合、拷贝数。 检测方法：特异性PCR（以外源基因两侧序列设计引物） Southern杂交（外源目的基因序列为探针）
14
2.直接分化再生系统
外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直
接分化出不定芽形成再生植株。茎尖
优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定； 缺点：材料局限，转化率低。
3.原生质体再生系统
脱去细胞壁的细胞叫原生质体，原生质体恢复细胞壁具有分 化再生能力，是应用最早的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因型一 致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多种转化 系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。 15
精细定位
0.8 c
cDNA文库筛选
6
(4)转座子标签法 转座子是染色体上一段可复制、移动的 DNA片段。当转座子插入到某个功能基因内部时，就会引起该 基因的失活，并诱导产生突变型；当转座子再次转座或切离这 一位点时，失活基因的功能又可得到恢复。目前应用最为广泛 的转座子系统是Ac/Ds玉米转座子系统。
cDNA文库 PCR 反转录酶 mRNA cDNA 差异显示 抑制消减杂交 … GenBank dbEST
4
EST
RACE/文 库筛选
(3)根据连锁图谱克隆目的基因 图位克隆技术(Map-based cloning)
5
cM Marker bp BAC
染色体步移 亚克隆 染色体步移 候选基因
1 a Gene
报告基因:
报告基因（reporter gene）是一种编码可被检测的蛋白质或 酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基 因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因， 或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而 利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化 体。作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下 几个条件：（1）已被克隆和全序列已测定；（2）表达产物在 受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的 内源性表达产物；（3）其表达产物能进行定量测定。
插入突变体
鉴定性状 遗传分析
筛选突变DNA 文库，PCR， RACE
基因部分DNA探针
完整目的基因
筛选野生型DNA 文库，PCR， RACE
7
(5)差异显示法 在生物个体发育不同阶段，或不同的组 织与细胞中或不同环境下，基因表达差异。即不同基因有 序的时空表达方式，叫做基因的差异表达。差异显示 PCR(differential display-PCR,DD-PCR)是指通过对来源 特定组织类型的总mRNA进行PCR扩增、电泳，并找出待测组 织和对照之间的特异扩增条带。
(三〕受体材料的选择
受体是指用于接受外源DNA的转化材料。良好的植物基因转
化受体系统应满足如下条件： 1、高效稳定的再生能力； 2、受体材料要有较高的遗传稳定性； 3、外植体来源方便，如胚和其它器官等；
4、对筛选剂敏感；
5、转化率高
13
常用的受体材料有以下几大类型:
1.愈伤组织再生系统
在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接 中，可促使砧木与接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木和接 穗沟通；在扦插中，从伤口愈伤组织可分化出不定根或不定芽， 进而形成完整植株。在植物器官、组织、细胞离体培养时，条 件适宜也可以长出愈伤组织。在一定条件下可进一步诱导器官 再生或胚状体而形成植株。外植体材料经过脱分化培养诱导形 成愈伤组织，转化（带有目的基因质粒的农杆菌侵染），分化 培养获得再生植株。下胚轴 优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因， 转化效率高。 缺点：遗传稳定性差、嵌合体
26
（六）转化体的安全性评价和育种利用
根据有关转基因产品的管理规定、在可控制的条件下进行安全 性评价和大田育种利用研究。 通过转基因方法往往难以直接获得理想的品种（系）原因：外 源基因失活、纯合致死、花粉致死、其它性状变化等。 因此获得转化体后，应结合杂交、回交、自交等常规转育手段，
最终选育综合性状优良的转基因品种。
目的基因体外重组到适当的已改造的质粒中 包括保存用中间载体（大肠杆菌寄主）：pBR322、pUC、 繁殖载体（大肠杆菌寄主）： JM109, TOP10 植物转化载体（农杆菌寄主）： pBI121, pCAM1001
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选择标记基因
如何选择和筛选转化体同样是一个重要问题。科学 家一直试图把转化体带上一个标记，从而便于选择和 筛选。至今己建立了许多标记基因，并已插入各种转 化载体中，作为一种标记基因。 选择性标记基因是指在遗传转化中能够使转化细 胞(或个体)从众多的非转化细胞中筛选出来的标记基 因.它们通常可以使转基因细胞产生对某种选择剂具有 抗性的产物,从而使转基因细胞在添加这种选择的培养 基上正常生长,而非转基因细胞由于缺乏抗性则表现出 对此选择剂的敏感性,不能生长。带有抗菌素抗性基因 的受体菌能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中 11 生长。
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转基因作物的生物安全性
直至今天，转基因作物的安全性在全球范围内引起了 激烈的争论。 反对者认为转基因作物具有极大的潜在危险，可能会 对人类健康和人类生存环境造成威胁。
28
国际上有几个典型的事件。
Pusztai事件： 英国Rowett研究所有位Pusztai博士，他用转雪花莲凝集素基因的土豆喂大鼠， 1998年秋天在英国电视台发表讲话，声称大鼠食用了这种土豆后，体重和器 官重量减轻，免疫系统受到了破坏。 后果：绿色和平组织、地球之友等反生物技术组织把这种土豆说成“杀手”， 并策划了破坏转基因作物试验地等行动，焚烧了印度的两块试验田，甚至美 国加州大学戴维斯分校的非转基因试验材料也遭破坏，以致研究生毕业论文 都无法如期完成。 英国皇家学会组织了同行评审，并于1999年５月发表评论，指出Pusztai的试 验有六方面的错误：不能确定转基因和非转基因马铃薯的化学成分有差异； 对食用转基因土豆的大鼠，未补充蛋白质以防止饥饿；供试动物数量少，饲 喂几种不同的食物，且都不是大鼠的标准食物，缺少统计学意义；试验设计 差；统计方法不当；试验结果无一致性等。
23
特异性PCR检测外源基因整合到受体
24
(2) 转录水平的鉴定
常用的方法 Northern杂交（标记的RNA为探针对总RNA杂交） RT-PCR 检测
mRNA cDNA PCR
25
（3）翻译水平的鉴定
为检测外源基因转录形成的mRNA能否翻译，还必须进行翻译或 者蛋白质水平检测。
主要方法：Western杂交
随机引物+3’ 锚定poly(t)引物
叶
根
叶mRNA
反转录
PCR PAGE
根mRNA
反转录
PCR
8
(6) 电子克隆 in silico cloning 借助于电子计算机，利用公布的核酸序列资料， 进行序列的拼接和组装最终获得完整基因序列的技 术，类似于cDNA文库的筛选但更加方便和快速。
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（二）目的基因重组质粒的构建
第七章 目的基因的克隆与遗传转化
1
(一)目的基因的克隆 根据获得基因的途径主要可以分为两大类： 根据基因表达的产物—蛋白质进行基因克隆； 从基因组DNA或mRNA序列克隆基因。
1.根据基因表达的产物—蛋白进行基因克隆 主要步骤如下： 分离蛋白质 明确氨基酸序列 推导核苷酸序列 人工合成
利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。 虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因。 局限性：兼并密码子?
Tumor induced by A. tumefaciens
19
Ti Plasmid
T-DNA region
已知农杆菌附着到 植物细胞后，只留
auxin
Left border Right border
在细胞间隙中。TDNA首先在细菌中被 加工、剪切、复制， 然后转入植物细胞。
vir genes
ori
外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复 制和表达。 农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒 (root-indcing plasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应 用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。
18
• 农杆菌: 包含Ti质粒 Tumor inducing plasmid (bacterial plasmid) • T-DNA (TransferredDNA), 可以转移进入植 物基因Hale Waihona Puke Baidu.
29
斑蝶事件：
1999年5月，康奈尔大学的一个研究组在《Nature》杂志 上发表文章，声称转基因抗虫玉米的花粉飘到一种名叫“马利 筋”的杂草上，用马利筋叶片饲喂美国大斑蝶，导致44％的幼 虫死亡。 这一实验结果在科学上没有说服力：玉米的花粉非常重， 扩散不远，在玉米地以外５米，马利筋叶片/CM2上只找到一个 玉米花粉；2000年开始在美国三个州和加拿大进行的田间试验 都证明，抗虫玉米花粉对斑蝶并不构成威胁，实验室试验中用 １０倍于田间的花粉量来喂大斑蝶的幼虫，也没有发现对其生 长发育有影响。 斑蝶减少的真正原因，一是农药的过度使用，二是墨西哥 生态环境的破坏。 30
中国Ｂt抗虫棉破坏环境事件： 2002年6月3日，南京环科所与绿色和平组织在北京召开会 议，６月４日《China daily》上发表了题为“GM （genetically modified） Cotton Damage Enviroment”的文 章。
20
2.外源基因直接导入法
最主要的是基因枪轰击法
（微弹轰击技术micro-projectile bombardment)
将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，借助高压动力射入受体 细胞或组织，最后整合到植物基因组并得以表达。 步骤简单易行：适合于大多数细胞或组织，克服了受体材料的限制，不 必制备原生质体，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最 有效方法之一。 到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数禾本科农作物、果 树花卉和林木等植物上获得转基因植株。 单子叶植物
Gus基因（β-葡糖苷酸酶基因）
在植物细胞中所产生的葡糖苷酸酶在检测上具有以下特点： 在一定条件下与X-G1ucuionic acid （5-bromo-4-chioro-3-indoylβ-D-glucuronic acid）底物发生作用，产生蓝色沉淀，可以直接 观察到植物组织中形成的蓝色斑点。
12
化受体系统； 二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管
导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。
16
（四）转基因方法 概括起来说主要有两类：
第一类是以载体为媒介的遗传转化，也称为间接转移系统法。
第二类是外源目的DNA的直接转化。
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1.载体介导转移系统
最常见的转基因方法。
将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的
4.胚状体再生系统
是指具有胚胎性质的个体。
优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力强， 嵌合体少，易于培养、再生。
缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。
5.生殖细胞受体系统
以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的 系统。
一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转
2
2.从基因组DNA或mRNA序列克隆基因
(1)同源序列法 (Homology Based Candidate Gene Method) 根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有保守氨基酸序列的特 点克隆基因家族未知成员。
氨基酸序列比较
设计简并引物
PCR扩增
文库筛选/RACE
3
(2)表达序列标签EST是指能够特异性标记某个基因的部分序列，通常包 含了该基因足够的结构信息区，可以与其它基因相区分。主要是通过 cDNA的途径获得。 获得EST的途径: 大规模cDNA文库测序 各种mRNA水平的分析手段
21
（五）转化体的筛选和鉴定 1.转化体的筛选 外源目的基因转化频率低 目的基因已被整合到核基因组并表达的转化细胞很少，使用特异 性选择标记基因（selectable marker genes）进行标记，有效 地选择出真正转化细胞。 常用选择标记基因： 抗生素抗性基因 除草剂抗性基因 标记基因在受体细胞表达，使转化细胞具有抵抗相应抗生素 或除草剂的能力而存活下来。非转化细胞则被抑制、杀死。
22
2.转化体的鉴定 通过筛选得到的再生植株初步证明标记基因整合进入受体 细胞。至于目的基因是否整合到受体核基因组、是否表达，
还必须对抗性植株进一步检测。
(1)DNA水平的鉴定 检测内容：是否整合、拷贝数。 检测方法：特异性PCR（以外源基因两侧序列设计引物） Southern杂交（外源目的基因序列为探针）
14
2.直接分化再生系统
外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直
接分化出不定芽形成再生植株。茎尖
优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定； 缺点：材料局限，转化率低。
3.原生质体再生系统
脱去细胞壁的细胞叫原生质体，原生质体恢复细胞壁具有分 化再生能力，是应用最早的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因型一 致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多种转化 系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。 15
精细定位
0.8 c
cDNA文库筛选
6
(4)转座子标签法 转座子是染色体上一段可复制、移动的 DNA片段。当转座子插入到某个功能基因内部时，就会引起该 基因的失活，并诱导产生突变型；当转座子再次转座或切离这 一位点时，失活基因的功能又可得到恢复。目前应用最为广泛 的转座子系统是Ac/Ds玉米转座子系统。
cDNA文库 PCR 反转录酶 mRNA cDNA 差异显示 抑制消减杂交 … GenBank dbEST
4
EST
RACE/文 库筛选
(3)根据连锁图谱克隆目的基因 图位克隆技术(Map-based cloning)
5
cM Marker bp BAC
染色体步移 亚克隆 染色体步移 候选基因
1 a Gene
报告基因:
报告基因（reporter gene）是一种编码可被检测的蛋白质或 酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基 因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因， 或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而 利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化 体。作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下 几个条件：（1）已被克隆和全序列已测定；（2）表达产物在 受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的 内源性表达产物；（3）其表达产物能进行定量测定。