紫外-可见分光光度计.ppt
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紫外可见分光光度计的使用课件PPT
定义与工作原理
定义
紫外可见分光光度计是一种基于 物质对紫外可见光的吸收特性进 行物质定量和定性分析的仪器。
工作原理
通过测量物质在特定波长下的吸光 度，利用朗伯-比尔定律（A=εbc） 计算物质的浓度。
类型与特点
类型
单光束分光光度计、双光束分光光度 计和双波长分光光度计。
特点
具有较高的测量精度和稳定性，广泛 应用于化学、生物学、医学、环境监 测等领域。
每次使用后记录仪器使用 情况，包括测试样品、测 试波长、测试结果等，以 便后续分析。
常见故障排除
波长不准确
检查仪器是否正确设置波长，并 确保仪器没有受到强烈震动或磁
场干扰。
读数不稳定
检查样品是否均匀，仪器是否处于 稳定状态，以及是否有外界干扰。
仪器无响应
检查电源是否正常，仪器是否处于 正常工作状态，以及是否有硬件故 障。
THANKS
开始测量
点击开始按钮，仪器自动扫描并记录 数据。
数据处理
将测量数据导入计算机进行进一步处 理和分析。
实验操作技巧
保持样品池清洁
定期清洗样品池，避免残留物对测量结果的 影响。
选择合适的标准物质
选择与待测样品性质相近的标准物质进行校 准，提高测量准确性。
控制环境因素
确保实验室内温度、湿度和光照等环境因素 稳定，以减小误差。
多次测量求平均值
为减小误差，可以对同一样品进行多次测量， 取平均值作为最终结果。
常见问题及解决方案
波长校准不准确
可能是由于仪器内部棱镜或光路不干 净导致。解决方法是清洁仪器内部并 重新进行波长校准。
测量数据不稳定
数据处理软件崩溃
可能是由于计算机内存不足或软件 bug导致。解决方法是关闭不必要的 程序，释放计算机内存，或更新数据 处理软件。
紫外可见分光光度法基本原理PPT讲稿
光是由光子流组成，光子的能量：
E=h=hc/
（Planck常数：h=6.626 × 10 -34 J × S ) 光的波长越短（频率越高），其能量越大。 白光(太阳光)：由各种单色光组成的复合光 单色光：单波长的光(由具有相同能量的光子组成) 可见光区：400-750 nm 紫外光区：近紫外区200 - 400 nm
生的吸收光谱在紫外—可见光区，称为紫外—可见光谱或分子的 电子光谱。
讨论：
（4）吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的 能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性 的依据。 （5）吸收谱带强度与分子偶极矩变化、跃迁几率有关， 也提供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长处测得的摩 尔吸光系数εmax也作为定性的依据。不同物质的λmax有时可能 相同，但εmax不一定相同； （6）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比， 这是定量分析的依据。
* σ σ* (150~210nm)
H
* n σ* (259nm)
HCI
H
（2）不饱和脂肪烃
• 这类化合物有孤立双键的烯烃(如乙烯)和共轭双键的烯
烃(如丁二烯)，它们含有π键电子，吸收能量后产生
π→π*跃迁。乙烯(孤立双键)的
m
a
为171nm(
x
＝
15530 L mol1 cm1 )；而丁二烯H(2C CH CH CH2 )
列吸收带，称为精细结构吸收带，亦称为B吸收带[从德文 Benzenoid(苯的)得名]，这是由于跃迁和苯环的振动的重叠引起的。B 吸收带的精细结构常用来辨认芳香族化合物。 苯环与生色团连结时，有B和K两种吸收带，有时还有R吸收带，其中 R吸收带的波长最长 。
生色团与助色团
生色团(Chromophore)： 最有用的紫外—可见光谱是由π→π＊和n→π＊跃迁产生
E=h=hc/
（Planck常数：h=6.626 × 10 -34 J × S ) 光的波长越短（频率越高），其能量越大。 白光(太阳光)：由各种单色光组成的复合光 单色光：单波长的光(由具有相同能量的光子组成) 可见光区：400-750 nm 紫外光区：近紫外区200 - 400 nm
生的吸收光谱在紫外—可见光区，称为紫外—可见光谱或分子的 电子光谱。
讨论：
（4）吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的 能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性 的依据。 （5）吸收谱带强度与分子偶极矩变化、跃迁几率有关， 也提供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长处测得的摩 尔吸光系数εmax也作为定性的依据。不同物质的λmax有时可能 相同，但εmax不一定相同； （6）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比， 这是定量分析的依据。
* σ σ* (150~210nm)
H
* n σ* (259nm)
HCI
H
（2）不饱和脂肪烃
• 这类化合物有孤立双键的烯烃(如乙烯)和共轭双键的烯
烃(如丁二烯)，它们含有π键电子，吸收能量后产生
π→π*跃迁。乙烯(孤立双键)的
m
a
为171nm(
x
＝
15530 L mol1 cm1 )；而丁二烯H(2C CH CH CH2 )
列吸收带，称为精细结构吸收带，亦称为B吸收带[从德文 Benzenoid(苯的)得名]，这是由于跃迁和苯环的振动的重叠引起的。B 吸收带的精细结构常用来辨认芳香族化合物。 苯环与生色团连结时，有B和K两种吸收带，有时还有R吸收带，其中 R吸收带的波长最长 。
生色团与助色团
生色团(Chromophore)： 最有用的紫外—可见光谱是由π→π＊和n→π＊跃迁产生
紫外---可见分光光度法
38
参比溶液、吸光度范围
参比溶液的选择
➢ 问题：邻二氮菲法测定水溶液中的铁离子含量应选择何种 参比溶液？
➢ 溶剂参比 ➢ 试剂参比 ➢ 试液参比 ➢ 褪色参比
吸光度范围
测量吸光度过高或过低，误差都很大， 一般适宜的吸光度范围是0.2～0.8。
➢ 问题：如果测定值过大或过小应如何处理？
精选完整ppt课件
项目二 紫外-可见分光光度法
中山火炬职业技术学院 精细化工专业
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1
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2
引入
项目2：用紫外-可见分光光度计对化妆品样品的维
生素C和铁含量进行分析评价
子项目1：用可见分光光度计对砷含量进行测定
子项目2：用紫外分光光度计对维生素C的含量的进 行测定
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3
教学内容
入射波长 显色剂用量 温度、时间 溶液酸度 溶剂
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32
显色剂用量
确定方法 配制一系列被测元素浓度相同不同显色剂用量的溶液，分别测其吸 光度，作A-CR曲线，找出曲线平台部分，选择一合适用量即可。
吸光度与显色剂浓度的关系曲线
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33
显色条件--溶液酸度
确定方法
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35
稳定性、干扰消除
稳定性实验 绘制A对t的曲线，选择吸光度平坦的部分确定最佳的显色时间。 干扰的消除
➢ 改变酸度、氧化剂、掩蔽剂消除； ➢ 改变入射波长； ➢ 改变合适的参比溶液。
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36
显色温度、溶剂选择
显色温度 ➢ 大多数显色反应是在常温下进行的，有些反应必须在较高温 度下。 ➢ 绘制工作曲线和进行样品测定时应该使溶液温度保持一致。
紫外可见分光光度PPT(完整版)课件
因此，可能的跃迁为σ → σ*、π→ π*、n→ σ* n→ π*等。
2023/10/14
10
Wavelength
2023/10/14
11
て
~104 10～100 100～300
k
~200 200～800
<200 ~150(<200)
Amax(nm)
<U<M<M<xD<U<*0<1<*1<0<*0<0
(red shift 或bathochromic
shift) 指取代基或溶剂效应引起吸收带 向长波方向的移动；
蓝移 ( blue shift 或 hypsochron sh ift) 或紫移： 吸收带向短
波方向移动
2023/10/14
16
常见助色团及其助色效应(红移)λ
-F<-Cl<-Br<-OH<-OCH₃<-N NHCH₃<-N(CH₃)₂<-NHC₆H₅<
6
分子中电子能级、振动能级和转动能级示意图
2023/10/14
不是任一波长的 光都可以被某一物质 所吸收，由于不同物 质的分子其组成结构 不同，它们所具有的 特征能级也不同，故 能级差不同，而各物 质只能吸收与它们内 部能级差相当的光辐 射，所以，不同物质 对不同波长的光吸收 具有选择性。
7
物质颜色与光吸收的关系
2023/10/14
29
四、 无机化合物的吸收光谱
金属离子 金属离子
配位体
d-d配位场跃迁
配位体
配位体π- π*
金属离子
配位体
电荷转移
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Wavelength
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て
~104 10～100 100～300
k
~200 200～800
<200 ~150(<200)
Amax(nm)
<U<M<M<xD<U<*0<1<*1<0<*0<0
(red shift 或bathochromic
shift) 指取代基或溶剂效应引起吸收带 向长波方向的移动；
蓝移 ( blue shift 或 hypsochron sh ift) 或紫移： 吸收带向短
波方向移动
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常见助色团及其助色效应(红移)λ
-F<-Cl<-Br<-OH<-OCH₃<-N NHCH₃<-N(CH₃)₂<-NHC₆H₅<
6
分子中电子能级、振动能级和转动能级示意图
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不是任一波长的 光都可以被某一物质 所吸收，由于不同物 质的分子其组成结构 不同，它们所具有的 特征能级也不同，故 能级差不同，而各物 质只能吸收与它们内 部能级差相当的光辐 射，所以，不同物质 对不同波长的光吸收 具有选择性。
7
物质颜色与光吸收的关系
2023/10/14
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四、 无机化合物的吸收光谱
金属离子 金属离子
配位体
d-d配位场跃迁
配位体
配位体π- π*
金属离子
配位体
电荷转移
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紫外可见分光光度计课件ppt
/moban
3、朗伯-比尔定律 比吸光系数
比吸光系数是指百分含量为1%， l为1cm时的 吸光度值，用 E
1% 1cm表示。
0.1M r E
1% 1cm
/moban
3、朗伯-比尔定律
四 偏离朗伯-比耳定律的因素
（1）入射光为非单色光
（2）溶液的不均性。
实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸 馏水中的微生物，存在散射以及共振发射等， 均可吸光质点的吸光特性变化大。 （3）光程的不一致性。 光源不是点光源，比色皿光径长度不一 致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均造 成光径不一致，从而与定律偏离。
/moban
4、紫外-可见分光光度计
一
主要部件的性能与作用
基本结构:
光源→单色器→吸收池→检测器→信号显示系统 样品
/moban
4、紫外-可见分光光度计 1 光源
在紫外可见分光光度计中，常用的光源有 两类：热辐射光源和气体放电光源 热辐射光源用于可见光区，如钨灯和卤钨 灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和 氘灯。
pH值
3、朗伯-比尔定律 一 吸光度和透光度
设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia,透射光 强度为 It，反射光强度为Ir，则 I 0= I a+ I t+ I r
由于反射光强度很弱，其影响很小，上式可简化 为：
I 0= I a+ I t
/moban
3、朗伯-比尔定律
吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示， 即 A=lg1/T=ห้องสมุดไป่ตู้gI0/It
生物化学，医学卫生，临床检验，食品卫生，药品
检验，农业化学等领域的生产。
恳请各位老师批评指正
/moban
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饱和烃及其取代衍生物
不饱和脂肪族有 机化合物
不饱和烃及共轭烯烃、 羟基化合物
芳香化合物 不饱和杂环化合物
苯及其衍生物
第二部分 紫外—可见分光光度计
一、紫外-可见分光光度计的基本构造
基本构造主要由光源、单色器、吸收池、检测器和显 示器五大部分组成。
光源 单色器 样品池 检测器
显示器
1.光源 在整个紫外光区或可见光区可以发射连续光谱，
紫外—可见分光光度计
第一部分 紫外-可见吸收光谱法的原理 第二部分 紫外-可见分光光度计构造与类型 第三部分 紫外-可见分光光度计的应用 第四部分 紫外-可见吸收光谱分析的条件和影响因素 第五部分 仪器的使用操作、维护
第一部分 紫外-可见吸收光谱法的原理
一、基本原理 :光的选择性吸收
分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后， 发生了电子能级跃迁，而产生了相应的吸收光谱。 属分子吸收光谱。
（2）吸收物质在特定波长和溶剂条件下的特征常数；
（3）不随浓度c 和光程长度b的改变而改变。在温度和 波长等条件一定时，k仅与吸收物质本身的性质有关；
（4）是物质吸光能力的量度，可作为定性鉴定的参数；
（5）同一物质在不同波长下的 k 值是不同的。在 最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以 kmax 表示。K max表明了该吸收物质最大限度的吸光能
力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵 敏度。
（6）kmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度
法测定该物质的灵敏度越高。
（7）k在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm
时该溶液在某一波长下的吸光度。
三、紫外吸收光谱与分子结构的关系
有机化合物的紫外吸收光谱常被用作结构分析的依据：
饱和有机化合物
能量转化、酶的降解、生物合成等的反应变化。
特点：时间辨别、快速扫描、测定生物化学瞬间 产物的吸收光谱和随时间变化值。
（１）单光束分光光度计
经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶 液，以进行吸光度的测定。
简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般 不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。
参比池
样品池
（２）双光束分光光度计
经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一 束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光 的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成 吸光度并作为波长的函数记录下来。
自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测 器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复 杂，价格较高。
参比池
M1
M3
M2 样品池
M4Leabharlann 岛津UV-2450（３）双波长分光光度计
由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色 器，得到两束不同波长（?1和? 2）的单色光；通过折波器 以一定的频率交替通过同一样品池，然后由检测器交替接 收信号，最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值ΔA。
无需参比池。△A就是扣除了背景吸收的吸光度。
对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析， 以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波 长分光光度法，往往能提高方法的灵敏度和选择性。利用双 波长分光光度计，能获得导数光谱。
双波长 BECKMAN-DU_640
（４）动力学分光光度计 解决在光化学反应、辐射化学反应和酶催化反应中，
3.吸收池 用于盛装试液的装置。吸收材料必须能够透过所测光谱范
围的光。一般可见光区使用玻璃吸收池，紫外光区使用石英 吸收池。 规格有0.5、1.0、2.0、5.0cm 等。
在高精度的分析测定中（紫外区尤其重要）吸收池要挑选 配对，因为吸收池材料的本身吸光特性以及吸收池的光程长
度的精度等对分析结果都有影响。
4. 检测器 利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用
的有光电管、光电倍增管、光电二极管、光电摄像管等。 要求灵敏度高、响应时间短、噪声水平低、稳定性好的优点。
5. 显示器 将监测器输出的信号放大并显示
出来的装置。 常用的液晶数字指示窗口和计算
控制显示。
二、紫外-可见分光光度计的分类及特点
具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用 寿命。
可见光区常用的光源是钨灯或碘钨灯，波长范 围是350-1000 nm。
在紫外区常为氢灯或氘灯，发射的连续波长范 围是180-360 nm。
2.单色器 单色器是将光源辐射的复合光分成单色光的光学装置。它是
分光光度计的心脏部分。单色器一般由狭缝、色散元件及透镜系 统组成。关键是色散元件，最常见的色散元件是棱镜和光栅。
(一)按仪器使用波长分类：
①真空紫外分光光度计（0.1-200 nm）； ②可见分光光度计（350-700 nm）； ③紫外-可见分光光度计（190-1100 nm）； ④紫外-可见-红外分光光度计（190-2500 nm）；
（二）按仪器使用的光学系统分类：
①单光束分光光度计； ②双光束分光光度计 ③双波长分光光度计 ④动力学分光光度计
入射光 I0
透射光 It
A＝kbc 式中:
A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度； k：摩尔吸光系数，单位 L·mol－１·cm－１；
b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位 mol·L－１；
? 2.摩尔吸光系数:(A＝kbc)
(1) k与入射波长、溶液的性质以及温度有关。
狭缝：将单色器的散射光切割成单色光。直接关系到仪器的分辨 率。狭缝越小，光的单色性越好。分为入射狭缝和出射狭缝。 棱镜:玻璃350～3200 nm，石英185～4000 nm。 光栅:波长范围宽，色散均匀，分辨性能好，使用方便。
4
2
5
1 3
1.入射狭缝 2.准直透镜 3.棱镜 4.聚焦棱镜 5.出射狭缝
紫外-可见吸收光谱分析是研究物质在紫外-可 见光波下的分子吸收光谱的分析方法。 紫外-可见区可细分为： （1）10-200nm；远紫外光区 （2）200-400nm；近紫外光区 （3）400-800nm；可见光区
二、光的吸收定律：
? 1.朗伯——比尔定律：A＝kbc。
表明：一定温度下，一定波长的单色光通过均匀的、非散射的溶液 时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。