菌(毒)种保存及复苏技术

中国国境卫生检疫杂志 ２００６ 年 ８ 月第 ２９ 卷第 ４ 期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ａｕｇ．２００６，Ｖｏｌ ２９，Ｎｏ．４
菌(毒)种保存及复苏技术
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马洪波 冯子力 谭 华 （ 珠海出入境检验检疫局， 珠海 ５１９０１０）
摘要 微生物是重要的 生 物 资 源 ， 保 存 微 生 物 的 目 的 ， 不 仅 使 微 生 物 菌 株 保 持 着 原 有 的 生 命 力 、优 良 生 产 性 能 、 形态特征， 并使其遗传性状从分离时或从实验开始就一直保持不变， 为后人能更好地应用先进技术开发和运用微生 物， 为人类造福。为此， 对菌（ 毒） 种保存的原理以及复苏技术， 包括冷冻干燥保存法、超低温冰箱保存法、液氮保存法、 传代培养保存法、载体保存法等技术的操作步骤进行介绍， 为同行作为参考。
病 毒 是 非 细 胞 形 成 的 生 命 体 ， 仅 有 ＲＮＡ 或 ＤＮＡ 一 类 简 单 分 子 ， 有 时 甚 至 仅 有 基 因 片 段 ， 包 含 一种或多种蛋白质。一般来说， ＤＮＡ 病毒比 ＲＮＡ 病 毒更稳定， 但 ２ 种病毒都能较稳定地保存。许多病毒 可在 ４℃保存 １ 个月， 而在较低的温度下可保存 １ 年 以上而无需要特别的冷冻技术， 因病毒结构简单， 体 积小， 不含水分。
中国国境卫生检疫杂志 ２００６ 年 ８ 月第 ２９ 卷第 ４ 期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ａｕｇ．２００６，Ｖｏｌ ２９，Ｎｏ．４
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煮沸 ２～３ 次， 每次 １０～３０ｍｉｎ， 备用。 ２．３．３ 微生物保存物的准备 在最适宜的培养条件 下将细胞培养至静止期或成熟期， 进行纯度检查后 （ 参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文 件《微生物菌种纯度检测技术规程》） ， 与保护剂混合 均匀， 分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于 １０８～１０１０ 个／ｍｌ 为宜。
关键词 菌（ 毒） 种； 保存； 复苏； 〔中图分类号〕 Ｒ３７ 〔文献标识码〕 Ｂ
微生物的保存方法很多， 根据不同的微生物菌 （ 毒） 种株或不同的实验要求， 可选用不同的保存方 法［１］。
对于细菌、放 线菌、霉菌和 酵母菌等微 生物， 可 采用斜面保存法、矿物油保存法（ 液体石蜡保存法） 、 载体保存法、冷冻干燥保存法， 此外还有悬液保存 法、寄主保存法、液氮保存法。
〔收稿日期： ２００６－ ０７－ ２０〕
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中国国境卫生检疫杂志 ２００６ 年 ８ 月第 ２９ 卷第 ４ 期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ａｕｇ．２００６，Ｖｏｌ ２９，Ｎｏ．４
广泛、效果较好的一种菌种保存方法。 理 直接滴入安瓿管底部， 注 意不要溅污上部管壁， 每管分装量约 ０．１～０．２ｍｌ。若 是液体培养的微生物， 应离心去除培养基， 然后将培 养物与保护剂混匀， 再分装于安瓿管中。
对于病毒悬液（ 组织培养的上清培养液， 或组织 培养用的感染细胞均可） ， 可用灭菌移液管将 ０．２ｍｌ 冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内， 并将盖子拧紧。 分装安瓿管时间尽量要短， 最好在 １～２ｈ 内分装完毕 并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。 ２．３．４ 冻结保存 将安瓿管或塑料冻存管置于－ ８０℃ 冰箱中保存。 ２．３．５ 复 苏 方 法 从－ ８０℃冰 箱 中 取 出 安 瓿 管 或 塑 料冻存管， 应立即放置 ３８℃～４０℃水浴中快速复苏并 适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止。开启安 瓿管或塑料冻存管， 将内容物移至适宜的培养基上 进行培养。
２ 超低温保存法［４］
２．１ 一般概念 将菌（ 毒） 种保存在－ ８０℃冰箱中以 减缓细胞的生理活动进行冷冻的一种保存方法。大 多数微生物可用超低温保存， 超低温保存法是适用 范围最广的微生物保存法。
需要复杂营养的微生物种， 如用其他的贮存方 法不能保持其活力（ 如植物的病原性真菌） ， 通常可 用超低温的方法保存。
１．１ 一般概念 冷冻干燥法［２～３］（ 简称“冻干法”） ， 是 目前长期保存细菌、酵母 、真菌、病毒 和立克次体 的 标准方法， 对一般生活力强的微生物及其孢子以及 无芽胞菌都适用， 即使对一些很难保存的致病菌， 如 脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。其原理是采用 低温、干燥和真空办法， 使菌（ 毒） 种的新陈代谢活动 处于高 度静止状 态 ， 也 就 是 在 极 低 温 度 下 （ － ７０℃左 右） 快速冷冻， 然后在低温下真空干燥， 使菌（ 毒） 体 细胞结构成分保持原来状态。因此， 菌种保存 １０～２０ 年， 仍不降低其原有性能。冷冻干燥法是目前应用最
病毒保存的方法有： 冰箱保存法： 普通冰箱保 存： ４～８℃； 低温冰箱保存： － ２０℃～－ ４０℃； 超低温冰箱 保存： － ８５℃。液氮保存方法： － １９６℃。冷冻真空干燥 保存法（ 冻干法） ： 又称低压冻干法和冰冻干燥法。下 面着重介绍几种常用的菌（ 毒） 种保存及复苏技术。
１ 冻干保存法
或多个体温超标者， 大大提高了通关速度。同时， 每 个出境、入境通道只需设一个测温工作岗， 减少了测 温工作岗的设置， 也节省了大量的人力。
（ ３） 提高了对口岸现场检验检疫执法行为的监 察能力。系统设有视频、音频、录像录音等功能， 监控 中心可对现场各个工作点工作人员的工作情况进行 实时监控， 同时通过录像回放功能， 为行政案件的处 理和执法行为的监察提供了客观证据。
３ 液氮超低温保存
３．１ 一 般 概 念 液 氮 超 低 温 保 存 技 术 是 将 菌 种 保 存在－ １９６℃的液态氮中， 或在－ １５０℃的氮气中的长 期保存方法， 大多数微生物可用液氮超低温保存。其 原理是利用微生物在－ １３０℃以下， 菌体细胞新陈代 谢活动降低到最低水平， 甚至处于休眠状态， 从而有 效地保存微生物。它的优点是： 保存时间可长达数年 至数 １０ 年； 适用范围广， 对一些即使不耐低温菌种， 如草菇等， 也可在保护剂的保护下进行超低温保存， 此外， 经保存的菌种基本上不发生变异。缺点是需要 液氮罐， 在长期贮存的过程中必须经常注意补充液 氮。这种贮存方式比冻干法需要更多的经费， 包括为 了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。 ３．２ 材 料 液 氮 罐 、安 瓿 管 或 冻 存 管 、防 护 手 套 和 面 罩 、永 久 性 记 号 笔 、气 体 喷 灯 、装 液 氮 的 保 温 瓶 、冷 冻保护剂等。 ３．３ 操作步骤 ３．３．１ 安 瓿 管 或 冻 存 管 的 准 备 用 圆 底 硼 硅 玻 璃 制 品的安瓿管， 或螺旋口的塑料冻存管。安瓿瓶应能经 受温度的突变而不破裂， 并易熔封管口。将冻存管或 安瓿管清洗、灭菌， 贴上标签， 备用。
（ ４） 提高了应对口岸突发事件的快速反应能力。 系统通过光纤等网络技术与国家质检总局、深圳局 的监控中心连接， 形成高速网络系统， 通过该系统直
接下达指令， 从而实现了罗湖出入境检验检疫局、深 圳出入境检验检疫局、国家质检总局监控中心应急 指挥的一体化。
４ 系统的规划
系统的建设分为 ２ 期， 目前已完成 １ 期工程， 实 现了信息化和网络化。２ 期工程主要是系统化建设。 将开发旅检口岸检验检疫综合业务管理系统， 包括 疫 情 预 警 与 快 速 反 应 管 理 系 统 、核 辐 射 监 测 系 统 、携 带物检疫查验管理系统和行政监察系统等。
由于病毒具有较长和耐久的生命及较强的感染 力， 容易通过昆虫或血液传染后致人丧命。因此， 在病 毒的冷冻保存过程中应严格遵守特定的操作规程和安 全指南。例如， 干净的工作环境、实验室、一次性使用器 具等。由于在植物、昆虫或动物体上病毒均能生殖， 因 此， 保持环境的清洁、避免病毒的传染尤为重要。 ２．２ 材料 待保存的菌种或病毒液、超低温冰箱、 安瓿管或冷冻管、冷冻保护剂等。 ２．３ 操作步骤 ２．３．１ 安瓿管的准备 安瓿管的处理同 １．３．１， 或使 用灭菌过的 １ 次性塑料冻存管。贴上标签， 标上菌 （ 毒） 号及时间， 备用。 ２．３．２ 保护剂的选择和准备 保护剂种类要根据微 生物类别选择。配制保护剂时， 应注意其浓度及 ｐＨ 值， 以及灭菌方法。如血清， 可用过滤灭菌； 牛奶要先 脱脂， 用离心方法去除上层油脂， 一般 在 １００℃间歇
空离心冷冻干燥机里， 进行预冻及真空干燥。无该设 备者， 可将分装好的安瓿管在低温冰箱中冷冻， 或在 冰箱冷冻室进行预冻。预冻以后， 将安瓿管放入真空 器中， 开动真空泵进行干燥。 １．３．６ 封管与保存 封口以后， 保存于冰箱或室温 暗处。做好的安瓿管应放置在低温避光处保存。用铝 盖密封冷冻管上的塞子。 １．３．７ 复苏培养 冻干菌（毒）种复苏较简单，在开启的 安瓿管或冷冻管前， 先用体积分数为 ７５％酒精将管的 外壁消毒， 小心移去铝盖和拔出塞子， 使细菌复苏。将 少量液体营养培养基加入冷冻管中， 与冻干的细菌混 匀， 再将重新水合的菌（毒）种转种至营养培养基内或 接入 ＰＤＡ 培养基上，在合适的条件下进行培养。
病毒的保存在病毒研究中是一个很重要的环 节， 不论是病毒的基础研究， 还是应用研究都与病毒 的保存有着紧密的联系。
病毒保存的原则是： 低温条件下保存， 温度愈低 愈好； 根据不同的病毒种类， 采用不同的病毒保存方 法； 在保存过程中应尽量减少不必要的传代， 严格按 规范操作， 避免毒种相互交叉感染， 使病毒不产生变 异， 保持病毒的遗传稳定性； 在特定的保存条件下 （ 温度、方法） ， 经过一段时 间保存之后 ， 一定要进行 活化增殖， 同时测定病毒活力大小， 再入库保存。
的浓度（ １０６～１０７ 个细胞 ／ｍｌ） 分装在小灭菌瓶或安瓿 内， 迅速将这些小瓶在极低温度的液体溶剂内水浴 或用仪器超低温冷冻（ － ６０℃） ， 再用真空泵除去这些 冷冻悬浮液中的水分， 在真空状态下用空气喷灯熔 解小瓶顶部的玻璃进行热封口， 然后贮存于低于 ５℃ 的冰箱内。保 存温度低 （ － ３０～－ ７０℃） 可 以 延 长 其 活 力。当微生物浓度较高时， 生存率高， 保存期也长。长 期保存时， 贮藏温度越低则越好。 １．２ 材料 １．２．１ 菌株 待保存的各种菌种。 １．２．２ 试 剂 体 积 分 数 为 ２％的 ＨＣｌ、牛 奶 、冷 冻 保 护液。 １．２．３ 器具 冷冻真 空装置（ 冻干 仪 ） 、安 瓿 管 或 冷 冻管、离心机、脱脂棉、铝制封口盖等。 １．３ 操作步骤 １．３．１ 准备安瓿管 取中性玻璃安瓿瓶， 先用体积 分数为 ２％的 ＨＣｌ 浸泡 １２ｈ， 再水洗多次， 烘干。管口 加棉塞， 灭菌备用。也可用冷冻管， 使用前要经 １６０℃ 灭菌 ２ｈ。 １．３．２ 保护剂的选择 在冻干前一般要加冷冻保护 剂， 保护剂的作用是使细胞在冻干过程中免受损伤 及减少在保存过程中的死亡。保护剂种类很多， 如牛 马血清、无菌牛奶等， 多数菌种保存是脱脂牛奶。美 国的典型菌 种 保 存 中 心 （ ＡＴＣＣ） 常 规 用 体 积 分 数 为 １０％的脱脂奶或质量分数为 １２％的蔗糖作为冷冻保 护剂， 而美国农业部（ ＵＳＤＡ） 的农业研究服务机构的 实验人员用牛或马血清作为微生物的冷冻保护剂。 在菌液中加入甘油和二甲 亚砜 （ ＤＭＳＯ） 也可防 止冷 冻中微生物的死亡， 但实际操作中应根据不同微生 物决定应用或不用防冻剂。 １．３．３ 准备菌种 用冷冻干燥法保存的菌种， 其保 存期可 达数年至 １０ 数 年。为了在 许多年后不 出差 错， 故所用菌种要特别注意其纯度， 即不能有杂菌污 染， 然后在最适培养基中用最适温度培养， 以培养出 良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生 长期， 若用对数生长期的菌种进行保存， 其存活率反 而降低。一般， 细菌要求 ２４～４８ｈ 的培养物； 酵母需培 养 ３ｄ； 形 成 孢 子 的 微 生 物 则 宜 保 存 孢 子 ； 放 线 菌 与 丝状真菌则培养 ７～１０ｄ。 １．３．４ 制备菌悬液与分装 以细菌斜面为例， 用无 菌脱脂牛乳加入斜面试管中， 用接种环将菌种刮下， 轻轻搅乱， 制成浓菌液， 分装至安瓿管。 １．３．５ 预冻与真空干燥 将安瓿管放进冻干仪或真