实用pcr流程表
实用pcr流程表知识讲解
实用p c r流程表临床PCR检验流程记录表检验日期：检验项目： HBV-DNA 扩增仪中保存文件名使用说明：①严格按单一流向进行实验，即试剂准备区→标本制备区→扩增区，严禁逆向移动。
本记录表的流向亦遵循此流程；②各项工作执行后在相应项目前的方框内打“√”；③本记录表最后归档保存在PCR实验室扩增区的专用文件夹中，以备查找。
检验日期：检验项目： HBV-DNA检验日期：检验项目： HBV-DNA1. 操作步骤：1.2.1取n个1.5ml的灭菌离心管，作好标记。
（n=样本数+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照）1.2.2向上述离心管中分别加入25ul蛋白酶溶液。
1.2.3分别加入待测样本、HCV阴性对照、HCV临界阳性对照和HCV强阳性对照各200ul.1.2.4加入200ul新鲜配制的裂解液工作液，盖上盖子，振荡15秒，充分混匀。
（注意：不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中）。
1.2.556摄氏度温浴15分钟。
瞬时离心，以去除管盖上的滴液。
1.2.6加入250ul无水乙醇，盖上盖子，彻底混匀（振荡15秒）。
在室温下静置5分钟（15-25摄氏度）。
注意：如果环境温度超过25摄氏度，无水乙醇需预冷。
瞬时离心，以去除管盖上的滴液。
1.2.7将n个核酸提取柱放入收集管中，小心地将步骤1.2.6中的液体移入核酸提取柱中。
盖上盖子，6000*g离心1分钟。
倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
（如果离心后核酸提取柱中仍有部分液体，以更高的速度再次离心，确保提取柱中无残余的液体）1.2.8小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液1，盖上盖子，6000*g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
1.2.9小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液2，盖上盖子，6000*g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
1.2.10小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul无水乙醇，盖上盖子，6000*g离心1分钟，丢弃收集管，将提取柱放入新的收集管中。
实用pcr流程表
临床PCR检验流程记录表检验日期：检验项目： HBV-DNA 扩增仪中保存文件名使用说明：①严格按单一流向进行实验，即试剂准备区→标本制备区→扩增区，严禁逆向移动。
本记录表的流向亦遵循此流程；②各项工作执行后在相应项目前的方框内打“√”；③本记录表最后归档保存在PCR实验室扩增区的专用文件夹中，以备查找。
1. 操作步骤：1.2.1取n个1.5ml的灭菌离心管，作好标记。
（n=样本数+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照）1.2.2向上述离心管中分别加入25ul蛋白酶溶液。
1.2.3分别加入待测样本、HCV阴性对照、HCV临界阳性对照和HCV强阳性对照各200ul.1.2.4加入200ul新鲜配制的裂解液工作液，盖上盖子，振荡15秒，充分混匀。
（注意：不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中）。
1.2.556摄氏度温浴15分钟。
瞬时离心，以去除管盖上的滴液。
1.2.6加入250ul无水乙醇，盖上盖子，彻底混匀（振荡15秒）。
在室温下静置5分钟（15-25摄氏度）。
注意：如果环境温度超过25摄氏度，无水乙醇需预冷。
瞬时离心，以去除管盖上的滴液。
1.2.7将n个核酸提取柱放入收集管中，小心地将步骤1.2.6中的液体移入核酸提取柱中。
盖上盖子，6000*g离心1分钟。
倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
（如果离心后核酸提取柱中仍有部分液体，以更高的速度再次离心，确保提取柱中无残余的液体）1.2.8小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液1，盖上盖子，6000*g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
1.2.9小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液2，盖上盖子，6000*g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
1.2.10小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul无水乙醇，盖上盖子，6000*g离心1分钟，丢弃收集管，将提取柱放入新的收集管中。
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临床PCR检验流程记录表检验日期：检验项目： HBV-DNA 扩增仪中保存文件名使用说明：①严格按单一流向进行实验，即试剂准备区→标本制备区→扩增区，严禁逆向移动。
本记录表的流向亦遵循此流程；②各项工作执行后在相应项目前的方框内打“√”；③本记录表最后归档保存在PCR实验室扩增区的专用文件夹中，以备查找。
实验前准备□试剂在有效期内□扩增仪、加样器、金属浴、温湿度计等仪器在校准有效期内（校准之日起1年）□生物安全柜的滤膜在使用有效期内□离心管、带滤芯吸头已经过质检合格□各区按消毒液配制SOP配制500mg/L含氯消毒液、2000mg/L含氯消毒液和70%酒精，即用即配。
□打开通风设备操作者试剂准备区实验前：□更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套□实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭）冰箱温度：冷藏室（2～8℃）℃；冷冻室（-20±2℃）℃实验室温度℃（允许范围：15～30℃）；相对湿度：（允许范围：30%～70%）PCR试剂来源：试剂厂家：口深圳匹基生物工程有限公司批号：检验项目：HBV-DNA本次实验用量：人份；剩余量：人份其他有关试剂配制：仪器设备使用：离心机：□正常□不正常；振荡器：□正常□不正常；生物安全柜：口正常口不正常实验后：□按实验室清洁消毒SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上。
□按实验室废弃物处理SOP处理实验废弃物。
操作者检验日期：检验项目： HBV-DNA样本处理区实验前：□更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套□实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭）冰箱温度：冷藏室（2～8℃）℃；冷冻室（-20±2℃）℃实验室温度℃（允许范围：15～30℃）；相对湿度：（允许范围：30%～70%）HBV-DNA阳性室内质控物来源：浓度及批号：扩增位置：HBV-DNA阴性室内质控物来源：批号：扩增位置：所处理的HBV-DNA标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置：1 9 17 25 33 41 49 57 65 73 81 892 10 18 26 34 42 50 58 66 74 82 903 11 19 27 35 43 51 59 67 75 83 914 12 20 28 36 44 52 60 68 76 84 925 13 21 29 37 45 53 61 69 77 85 936 14 22 30 38 46 54 62 70 78 86 947 15 23 31 39 47 55 63 71 79 87 958 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96核酸提取及加样过程：□按乙型肝炎病毒DNA荧光定量PCR操作程序SOP进行。
PCR技术详细步骤.
送至高压3次，试验前将枪头放入吸头台。 3, 试剂配制和准备： (1) 双蒸水： 100ml盐水瓶内装40ml蒸馏水，送至高压，后分装到几个 1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。 (2) PCR中所需要的各种试剂 三，PCR时注意事项： 佩戴一次性手套，同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。 四，PCR步骤 1， 准备100ul EP管 2， 依次在管中加入：（50ul反应体系） ddH2O 37.5ul ×？ 10mM dNTP 1ul ×？ 10×PCR buffer 5ul ×？ 25mM Mgcl2 （加之前要摇匀） 3ul ×？ 上游引物 1ul ×？ 下游引物 1ul ×？ 模板cDNA 1ul 3， 稍离心 4， 100℃沸水浴1分钟 5， 趁热加入Tag酶0.5ul（冰上操作） 6， 再加入50ul液体石蜡封闭 7， 10000rmp离心1分钟 8， PCR条件 94℃ 1min 58℃ 50sec 72℃ 1min30sec 进行40个循环，然后72℃ 10min 完后4℃保温。 9，10000rmp离心5min 10，将下层水相转入新的0.65mlEP管中，-20℃保存。 6 电泳鉴定 一，准备工作 1，实验器具与材料： （1）移液枪：10ul （2）吸头：20ul （3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个 （4）三角烧瓶：50ml一个
Hale Waihona Puke 至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。 （2）RT中所需要的各种试剂 （3）引物浓度计算方法： （新合成的引物的稀释） 假如终浓度为X uM(pmol/ul) 加DEPC水体积（ul）＝（OD×33×1000000）/（分子量 ×X） 二，RT时注意事项： 为避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。 三，RT步骤 用SSⅢ逆转录酶进行RT（20ul体积） 1， 准备0.65ml的EP管 2， 冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA， 1uldNTP，短暂离心。 3， 65℃水浴5分钟后，立刻0℃冰水浴至少1分钟。 4， 短暂离心后，冰上操作：加入4ul 5×First-Strand Buffer，1ul 0.1MDTT，1ul RNAse Inhibitor，1ul SSⅢ逆转录酶。 5， 短暂离心 6， 50℃水浴60分钟进行逆转录。 7， 70℃水浴15分钟灭活逆转录酶 8， -20℃保存，或立即进行PCR。 用AMV逆转录酶进行RT（10ul体积） 1， 准备0.65mlEP管 2， 加入4.5ul DEPC水，1ul引物，1ul模板RNA 3， 稍离心，100℃沸水裕1min 4， 加入0.5uldNTP，2ul 5×Buffer，1ul AMV逆转录酶 5， 稍离心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT 6， 100℃沸水裕3min灭活AMV 7， 立即PCR或-20℃保存。 5 聚合酶链式反应（PCR） 二，准备工作 8， 实验器具与材料： （1）移液枪：200ul、10ul （2）吸头：200ul、20ul （3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个 （4）EP管1.5ml、100ul 2，实验器具的处理与准备 (1) 塑料制品：（包括吸头、EP管等）
PCR实验室操作流程
PCR实验室操作流程PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学实验技术，用于在体外扩增DNA序列。
下面是PCR实验室操作流程的详细说明。
1.实验前准备：a.准备必需的试剂和材料，包括PCR反应缓冲液、dNTPs、引物、聚合酶、模板DNA、消毒水、离心机、PCR仪等。
b.检查PCR反应缓冲液、dNTPs、引物和聚合酶的保存条件和有效期。
c.将PCR反应管、移液器、移液枪、显微镜幻灯片等进行消毒处理。
2.PCR反应体系的准备：a.将PCR反应缓冲液、dNTPs、引物和聚合酶按照规定比例混合，制备PCR反应体系。
b.添加模板DNA，使总体积达到预定的体积。
3.PCR反应管的装填：a.执行无菌操作，将PCR反应体系均匀地分装到PCR反应管中，避免空气泡影响反应结果。
b.添加防止蒸发的润滑油至PCR反应管中。
4.PCR仪的设置：a.打开PCR仪，设定所需的温度和时间参数。
b.确保PCR仪处于冷却状态，使反应管可以准确控制升温和降温的过程。
5.PCR反应程序设置：a.根据扩增的目标基因长度和引物设计，确定适当的PCR循环数、退火温度和延伸时间。
b.在PCR仪的控制面板上设置所需的循环数、温度和时间参数。
6.PCR反应的进行：a.将PCR反应管放入PCR仪的样品位。
b.关闭PCR仪的盖子，启动PCR反应。
7.PCR反应结束后：a.关闭PCR仪，取出PCR反应管。
b.使用电泳或其他方法，对PCR产物进行分析和检测。
8.PCR反应管和废弃物处理：a.将PCR反应管中的废液倒入废液收集容器中。
b.将PCR反应管进行无菌处理，避免污染实验室环境。
c.将废弃物放入相应的废弃物容器中，以便进行妥善处置。
需要注意的是，PCR实验室操作流程中的无菌操作和个人防护是非常重要的。
在整个实验过程中，实验人员应佩戴实验手套，并注意将不同试剂和反应物进行分装。
此外，实验结束后，实验台面和设备都需要进行彻底的清洁和消毒处理，以保证实验环境的无菌和清洁。
实用pcr流程表样本
临床PCR检验流程记录表检验日期: 检验项目: HBV-DNA 扩增仪中保存文件名使用说明: ①严格按单一流向进行实验, 即试剂准备区→标本制备区→扩增区, 严禁逆向移动。
本记录表的流向亦遵循此流程; ②各项工作执行后在相应项当前的方框内打”√”; ③本记录表最后归档保存在PCR实验室扩增区的专用文件夹中, 以备查找。
检验日期: 检验项目: HBV-DNA检验日期: 检验项目: HBV-DNA1. 操作步骤:1.2.1取n个1.5ml的灭菌离心管, 作好标记。
( n=样本数+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照)1.2.2向上述离心管中分别加入25ul蛋白酶溶液。
1.2.3分别加入待测样本、 HCV阴性对照、 HCV临界阳性对照和HCV强阳性对照各200ul.1.2.4加入200ul新鲜配制的裂解液工作液, 盖上盖子, 振荡15秒, 充分混匀。
( 注意: 不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中) 。
1.2.556摄氏度温浴15分钟。
瞬时离心, 以去除管盖上的滴液。
1.2.6加入250ul无水乙醇, 盖上盖子, 彻底混匀( 振荡15秒) 。
在室温下静置5分钟( 15-25摄氏度) 。
注意: 如果环境温度超过25摄氏度, 无水乙醇需预冷。
瞬时离心, 以去除管盖上的滴液。
1.2.7将n个核酸提取柱放入收集管中, 小心地将步骤1.2.6中的液体移入核酸提取柱中。
盖上盖子, 6000*g离心1分钟。
倒掉收集管中的废液, 将提取柱重新放入收集管中。
( 如果离心后核酸提取柱中仍有部分液体, 以更高的速度再次离心, 确保提取柱中无残余的液体)1.2.8小心的打开核酸提取柱的盖子, 加入500ul洗液1, 盖上盖子, 6000*g离心1分钟, 倒掉收集管中的废液, 将提取柱重新放入收集管中。
1.2.9小心的打开核酸提取柱的盖子, 加入500ul洗液2, 盖上盖子, 6000*g离心1分钟, 倒掉收集管中的废液, 将提取柱重新放入收集管中。
Q-PCR操作简易流程--根据试剂盒整理
一、总RNA提取流程适量超低温冻结的动物组织，研钵内加液氮研磨，至粉末状♓加入适量（100mg组织加1ml）RNAiso Plus，将研磨成粉末状的样品完全覆盖♓室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状♓将匀浆液转移至离心管，室温静置5min，12000g 4℃离心5min♓小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）♓加入氯仿（为RNAiso Plus 的1/5 体积量），盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15s♓室温静置5min，12000g 4℃离心15min♓匀浆液分为3层，吸取无色上清液至新离心管中♓上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀，在15-30℃下静置10min♓12000g 4℃离心10min，离心后，底部会出现沉淀，即为RNA♓小心弃去上清，沿管壁加入1ml 75%乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁♓12000g 4℃离心15min，小心弃去乙醇，超净台内干燥2-5min♓加入适量（一般40-50ul试沉淀大小）DEPC处理水中，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀♓待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存二、RT-PCR1、冰上在一个管子中制备如下反应混合物：2、轻柔混合，微量离心机离心3-5秒。
70°C孵育混合物5min，冰冷却，短暂离心，收集沉淀。
3、管子置于冰上，按指定顺序加入以下成份：1. 合成适合PCR 扩增的第一链cDNA①冰上在一个管子中制备如下反应混合物：模板RNA*：总RNA 0.1-5μg或poly(A)+ RNA 10ng- 0.5μg或特异RNA 0.01pg - 0.5μg引物：oligo(dT)18引物(0.5μg/μl) 1μl或随机六聚物引物(0.2μg/μl) 1μl或序列特异性引物15–20pmolDEPC处理过的水to 12μl轻柔混合，微量离心机离心3-5秒。
②70°C孵育混合物5min，冰冷却，短暂离心，收集沉淀。
临床PCR检验流程记录表
口按实验室废弃物处理程序（SOP编号）处理实验废弃物。
操作者：____________
扩增区（3区）
实验前：口打开通风设备口实验台面清洁（水或75%酒精擦拭）
口实验室温度：____℃（允许范围：10~30℃）；相对湿度____（允许范围：30%~80%）
扩增仪操作：口开机自检及运行正常；
口按扩增仪操作（sop编号）sop进行编程、参数、设定；
室内质控结果：________________ 口填写室内质控记录、描质控图
是否失控：口是 口否
实验结果失控原因与处理：（失控标准参照室内质量控制SOP程序）
实验结果：见所附扩增仪打印结果。
实验后：口填写相关记录表；
口按实验室清洁程序（SOP编号）清洁实验室台面、地面，并进行紫外线照射30分钟以上；
口按实验室废弃物处理程序（SOP编号）处理实验废弃物。
操作者：____________
检测日期：____________
口 正常 口不正常
口实验室温度：____℃（允许范围：10~30℃）；相对湿度____（允许范围：30%~80%）
PCR试剂来源：（深圳匹基公司） 批号：____________
检验项目：_________ 本次实际用量：_______人份
具体配置内容______________________________________________________
仪器设备的使用：
离心机：口正常 口不正常 振荡器：口正常 口不正常
实验后：口移动器调至最大量程刻度并复位；
口填写相关记录表；
口按实验室清洁程序（SOP编号）清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上；
pcr实验室操作流程
pcr实验室操作流程
1.样品制备：将样品按需要提取DNA或RNA，片段化处理，使其适合PCR实验。
2.PCR反应液配制：PCR反应液，含有特定的DNA聚合酶、DNA模板、水、dNTP（核苷酸）和引物，按照需要的比例，进行配制。
3.PCR反应：将PCR反应液加入PCR管中，放入PCR热循环仪中，用
不同温度对样品进行反应，循环多次，以获得期望的扩增结果。
4.模板产物检测：将反应产物加入凝胶电泳中，检测DNA模板产物，
可以检测出被扩增片段的种类和量。
5.结果分析：将凝胶电泳的结果与含有标准核酸的样品进行对比，表
明扩增的项目，对结果进行分析，以获得正确的结论。
实用pcr流程表
临床PCR检验流程记录表检验日期：检验项目： HBV-DNA 扩增仪中保存文件名使用说明：①严格按单一流向进行实验，即试剂准备区→标本制备区→扩增区，严禁逆向移动。
本记录表的流向亦遵循此流程；②各项工作执行后在相应项目前的方框内打“√”；③本记录表最后归档保存在PCR实验室扩增区的专用文件夹中，以备查找。
1. 操作步骤：1.2.1取n个1.5ml的灭菌离心管，作好标记。
（n=样本数+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照）1.2.2向上述离心管中分别加入25ul蛋白酶溶液。
1.2.3分别加入待测样本、HCV阴性对照、HCV临界阳性对照和HCV强阳性对照各200ul.1.2.4加入200ul新鲜配制的裂解液工作液，盖上盖子，振荡15秒，充分混匀。
（注意：不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中）。
1.2.556摄氏度温浴15分钟。
瞬时离心，以去除管盖上的滴液。
1.2.6加入250ul无水乙醇，盖上盖子，彻底混匀（振荡15秒）。
在室温下静置5分钟（15-25摄氏度）。
注意：如果环境温度超过25摄氏度，无水乙醇需预冷。
瞬时离心，以去除管盖上的滴液。
1.2.7将n个核酸提取柱放入收集管中，小心地将步骤1.2.6中的液体移入核酸提取柱中。
盖上盖子，6000*g离心1分钟。
倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
（如果离心后核酸提取柱中仍有部分液体，以更高的速度再次离心，确保提取柱中无残余的液体）1.2.8小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液1，盖上盖子，6000*g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
1.2.9小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液2，盖上盖子，6000*g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
1.2.10小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul无水乙醇，盖上盖子，6000*g离心1分钟，丢弃收集管，将提取柱放入新的收集管中。
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实用p c r流程表-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII临床PCR检验流程记录表检验日期：检验项目： HBV-DNA 扩增仪中保存文件名使用说明：①严格按单一流向进行实验，即试剂准备区→标本制备区→扩增区，严禁逆向移动。
本记录表的流向亦遵循此流程；②各项工作执行后在相应项目前的方框内打“√”；③本记录表最后归档保存在PCR实验室扩增区的专用文件夹中，以备查找。
检验日期：检验项目： HBV-DNA1. 操作步骤：1.2.1取n个1.5ml的灭菌离心管，作好标记。
（n=样本数+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照）1.2.2向上述离心管中分别加入25ul蛋白酶溶液。
1.2.3分别加入待测样本、HCV阴性对照、HCV临界阳性对照和HCV强阳性对照各200ul.1.2.4加入200ul新鲜配制的裂解液工作液，盖上盖子，振荡15秒，充分混匀。
（注意：不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中）。
1.2.556摄氏度温浴15分钟。
瞬时离心，以去除管盖上的滴液。
1.2.6加入250ul无水乙醇，盖上盖子，彻底混匀（振荡15秒）。
在室温下静置5分钟（15-25摄氏度）。
注意：如果环境温度超过25摄氏度，无水乙醇需预冷。
瞬时离心，以去除管盖上的滴液。
1.2.7将n个核酸提取柱放入收集管中，小心地将步骤1.2.6中的液体移入核酸提取柱中。
盖上盖子，6000*g离心1分钟。
倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
（如果离心后核酸提取柱中仍有部分液体，以更高的速度再次离心，确保提取柱中无残余的液体）1.2.8小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液1，盖上盖子，6000*g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
1.2.9小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液2，盖上盖子，6000*g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
PCR实验操作程序
PCR实验操作程序1. 在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按下列操作程序加样：反应物加样顺序体积(μl) 终浓度去离子水1 29.410×Buffer B 2 5 1×4×dNTP混合物3 5 各200μmol/LMgCl2 4 3 1.5mmol/L有义引物5 2.6 0.25μmol/L反义引物6 2.6 0.25μmol/L模板7 2 0.1μgTaqDNA聚合酶8 0.4 1unit2. 用微量可调加样器和一次性Tip向每一管中加50μl矿物油。
每加一管换一次Tip。
3. 振荡每只管，然后短暂离心。
4. 将管放到预热的热循环中，按下列程序开始循环：预变性94℃4分钟1次变性94℃1分钟退火37-65℃1分钟延伸72℃1分钟循环30次终延伸72℃7分钟1次保存4℃5. 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析结果。
电泳条件：60-80V,15-20分钟。
6. 紫外分析仪检查电泳结果。
四、讨论1.假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有Taq酶抑制剂，②在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
③模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，有可能是模板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性对照的DNA模板配合检查模板质量。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
实用pcr流程表
临床PCR检验流程记录表检验日期：检验项目：HBV-DNA 扩增仪中保存文件名使用说明：①严格按单一流向进行实验，即试剂准备区→标本制备区→扩增区，严禁逆向移动。
本记录表的流向亦遵循此流程；②各项工作执行后在相应项目前的方框内打“√”；③本记录表最后归档保存在PCR实验室扩增区的专用文件夹中，以备查找。
检验日期：检验项目：HBV-DNA检验日期：检验项目：HBV-DNA1. 操作步骤：1.2.1取n个1.5ml的灭菌离心管，作好标记。
（n=样本数+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照）1.2.2向上述离心管中分别加入25ul蛋白酶溶液。
1.2.3分别加入待测样本、HCV阴性对照、HCV临界阳性对照和HCV强阳性对照各200ul.1.2.4加入200ul新鲜配制的裂解液工作液，盖上盖子，振荡15秒，充分混匀。
（注意：不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中）。
1.2.556摄氏度温浴15分钟。
瞬时离心，以去除管盖上的滴液。
1.2.6加入250ul无水乙醇，盖上盖子，彻底混匀（振荡15秒）。
在室温下静置5分钟（15-25摄氏度）。
注意：如果环境温度超过25摄氏度，无水乙醇需预冷。
瞬时离心，以去除管盖上的滴液。
1.2.7将n个核酸提取柱放入收集管中，小心地将步骤1.2.6中的液体移入核酸提取柱中。
盖上盖子，6000*g离心1分钟。
倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
（如果离心后核酸提取柱中仍有部分液体，以更高的速度再次离心，确保提取柱中无残余的液体）1.2.8小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液1，盖上盖子，6000*g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
1.2.9小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液2，盖上盖子，6000*g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
1.2.10小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul无水乙醇，盖上盖子，6000*g离心1分钟，丢弃收集管，将提取柱放入新的收集管中。
pcr实验室流程表
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确保样本采集的准确性和完整性。
pcr操作流程
PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
以下是PCR 的基本操作流程：
准备反应体系：
在无菌条件下，准备PCR反应管，其中包含待扩增的DNA模板、引物（前向引物和反向引物）、核酸酶短片段、缓冲液、酶（聚合酶）和DNA聚合酶反应所需的核苷酸。
Denaturation（变性）：
将PCR反应管置于热源中，提高温度至约94-98摄氏度。
高温会使DNA双链解开，将DNA模板分离成两个单链。
Annealing（退火）：
将PCR反应管从高温降温至适合引物与DNA结合的温度（通常在50-65摄氏度之间）。
引物与DNA模板上的互补序列结合形成稳定的引物-模板复合物。
Extension（延伸）：
将PCR反应管温度升高至DNA聚合酶的最适温度（通常在68-72摄氏度之间）。
DNA聚合酶会利用引物-模板复合物的末端作为起始点，向3'方向合成新的DNA链。
在延伸过程中，核酸酶短片段会降解旧的DNA链，以便DNA聚合酶能够在其上进行合成。
循环反应：
Denaturation、Annealing和Extension构成了一轮PCR循环。
PCR循环会在一段时间内重复进行多次，通常进行20-40个循环。
每一轮PCR循环都会使DNA模板扩增成两倍。
结果分析：
PCR反应结束后，可使用凝胶电泳等方法对扩增产物进行分析。
凝胶电泳可以根据扩增产物的大小和数量，确定PCR反应的效果和扩增DNA片段的特性。
实用pcr流程表完整
实用pcr流程表(可以直接使用，可编辑实用优秀文档，欢迎下载）临床PCR检验流程记录表检验日期：检验项目： HBV-DNA 扩增仪中保存文件名使用说明：①严格按单一流向进行实验，即试剂准备区→标本制备区→扩增区，严禁逆向移动。
本记录表的流向亦遵循此流程；②各项工作执行后在相应项目前的方框内打“√”；③本记录表最后归档保存在PCR实验室扩增区的专用文件夹中，以备查找。
1. 操作步骤：1.2.1取n个1.5ml的灭菌离心管，作好标记。
（n=样本数+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照）1.2.2向上述离心管中分别加入25ul蛋白酶溶液。
1.2.3分别加入待测样本、HCV阴性对照、HCV临界阳性对照和HCV强阳性对照各200ul.1.2.4加入200ul新鲜配制的裂解液工作液，盖上盖子，振荡15秒，充分混匀。
（注意：不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中）。
1.2.556摄氏度温浴15分钟。
瞬时离心，以去除管盖上的滴液。
1.2.6加入250ul无水乙醇，盖上盖子，彻底混匀（振荡15秒）。
在室温下静置5分钟（15-25摄氏度）。
注意：如果环境温度超过25摄氏度，无水乙醇需预冷。
瞬时离心，以去除管盖上的滴液。
1.2.7将n个核酸提取柱放入收集管中，小心地将步骤中的液体移入核酸提取柱中。
盖上盖子，6000*g离心1分钟。
倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
（如果离心后核酸提取柱中仍有部分液体，以更高的速度再次离心，确保提取柱中无残余的液体）1.2.8小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液1，盖上盖子，6000*g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
1.2.9小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液2，盖上盖子，6000*g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
1.2.10小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul无水乙醇，盖上盖子，6000*g离心1分钟，丢弃收集管，将提取柱放入新的收集管中。
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临床PCR检验流程记录表
检验日期：检验项目： HBV-DNA 扩增仪中保存文件名
使用说明：①严格按单一流向进行实验，即试剂准备区→标本制备区→扩增区，严禁逆向移动。
本记录表的流向亦遵循此流程；②各项工作执行后在相应项目前的方框内打“√”；③本记录表最后归档保存在PCR实验室扩增区的专用文件夹中，以备查找。
检验日期：检验项目： HBV-DNA
检验日期：检验项目： HBV-DNA
1. 操作步骤：
1.2.1取n个的灭菌离心管，作好标记。
（n=样本数+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性
对照+1管HCV临界阳性对照）
1.2.2向上述离心管中分别加入25ul蛋白酶溶液。
1.2.3分别加入待测样本、HCV阴性对照、HCV临界阳性对照和HCV强阳性对照各200ul.
1.2.4加入200ul新鲜配制的裂解液工作液，盖上盖子，振荡15秒，充分混匀。
（注意：
不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中）。
1.2.556摄氏度温浴15分钟。
瞬时离心，以去除管盖上的滴液。
1.2.6加入250ul无水乙醇，盖上盖子，彻底混匀（振荡15秒）。
在室温下静置5分钟
（15-25摄氏度）。
注意：如果环境温度超过25摄氏度，无水乙醇需预冷。
瞬时离心，以去除管盖上的滴液。
1.2.7将n个核酸提取柱放入收集管中，小心地将步骤1.2.6中的液体移入核酸提取柱
中。
盖上盖子，6000*g离心1分钟。
倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
（如果离心后核酸提取柱中仍有部分液体，以更高的速度再次离心，确保提取柱中无残余的液体）
1.2.8小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液1，盖上盖子，6000*g离心1分
钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
1.2.9小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液2，盖上盖子，6000*g离心1分
钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
1.2.10小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul无水乙醇，盖上盖子，6000*g离心
1分钟，丢弃收集管，将提取柱放入新的收集管中。
1.2.1120000*g高速离心3分钟，彻底去除乙醇。
1.2.12丢弃收集管，将核酸提取柱放入干净的离心管中，打开提取柱的盖子，
56摄氏度温浴3分钟，以彻底去除残余的液体。
将核酸提取柱放入另一干净的离心管中，小心打开提取柱的盖子，加入60ul洗脱液（请将洗脱液加到膜的中央），盖上盖子，室温静置5分钟。
20000*g高速离心1分钟收集滤出液，做好标记，4摄氏度保存备用。
提取的病毒核酸应在2小时内用于PCR 扩增，或在-70摄氏度下可以保存一个月。
2. 扩增试剂准备（PCR前准备区）
从试剂盒中取出HCV RT-PCR反应液、Enzyme Mix , 在室温下融化后，2000*g离心5秒。
设所需要的PCR反应管数（玻璃毛细管）为n（n=样本数+1管空白对照+1管HCV 阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照+4管HCV定量标准品），每个测试反应体系配制如下表：
计算好各试剂的使用量，加入到一适当体积试管中，充分混匀均匀后2000*g离心10秒，向各玻璃毛细管中分装15ul，转移至样本处理区。
3.加样（样本处理区）
吸取10ul样本处理步骤1.2.13中收集得到的RNA溶液及HCV定量标准品分别加入到上述反应管中（空白对照直接加入10ul洗脱液），盖紧反应管管盖，连同Roche专用金属反应管套放在离心机中，于2000*g离心10秒，将毛细管转移到检测区。
将毛细管排放好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。
4. RT-PCR反应（检测区）
循环条件设置
反应体系为25ul.具体设置方法请参照各仪器使用说明书。
4.2仪器检测通道选择
选择F1检测通道：HCV内对照（IC）选择F2检测通道。
4.3样本的设定
在扩增开始前条件设定时，将HCV定量标准品设为“Standard”并输入试剂盒内给定浓度值，待检样本和对照品设定为“Unknown”。
结果分析条件设定
1.对HCV的曲线和HCV内对照（IC）的曲线进行分别分析。
2.分析方式选择Fit Points，基线调整选择Arithmetic,阈值（threshold）设定原则
以阈值线刚好超过正常HCV阴性对照曲线的最高点，且正常HCV阴性对照病毒滴度为ml为准。
具体设置方法请参照各仪器使用说明书。
质控标准
1.将HCV定量标准品1-4的浓度值输入，仪器将自动以HCV定量标准品的浓度值为横坐
标，以其实际测得的外标Ct值为纵坐标给出标准曲线，标准曲线的拟和度绝对值应大于等于，四个HCV定量标准品的Ct值都应<，否则视为定量结果无效。
2.HCV阴性对照、空白对照HCV RNA应为ml；HCV强阳性对照HCV RNA应为++07IU/ml；
HCV临界阳性对照应为++05 IU/ml；且HCV阴性对照、HCV临界阳性对照中HCV内对照（IC）的Ct值都应小于等于33，否则此次实验视为无效。
所有实验从样本处理开始重做。
结果判断
1.检测样本中+03 IU/ml小于等于HCV RNA小于等于+07 IU/ml，测定结果有效，可直
接报告相应的浓度值。
2.检测样本中HCV RNA大于+07 IU/ml，可按实际测得值报告相应的病毒滴度，亦可将
该样本用正常人血浆按10倍梯度稀释到本试剂盒定量检测线性范围内后重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正。
3.检测样本中ml小于HCV RNA小于+03 IU/ml，且HCV内对照（IC）的Ct值都应小于
等于33，表明病毒载量较低，可直接报告浓度值，但注明该病毒滴度量仅供参考。
4.检测样本中HCV RNA等于ml，且HCV内对照（IC）的Ct值都应小于等于33，应报告
为小于试剂盒最低检测限。
5.检测样本中HCV内对照（IC）的Ct值大于33或Ct值为无数值，且HCV RNA小于等
于+03 IU/ml（包含ml或无数值）时，则此样本的定量结果视为无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。