实用pcr流程表

临床PCR检验流程记录表

检验日期：检验项目： HBV-DNA 扩增仪中保存文件名

使用说明：①严格按单一流向进行实验，即试剂准备区→标本制备区→扩增区，严禁逆向移动。本记录表的流向亦遵循此流程；②各项工作执行后在相应项目前的方框内打“√”；③本记录表最后归档保存在PCR实验室扩增区的专用文件夹中，以备查找。

1. 操作步骤：

1.2.1取n个1.5ml的灭菌离心管，作好标记。（n=样本数+1管HCV阴性对照+1管HCV

强阳性对照+1管HCV临界阳性对照）

1.2.2向上述离心管中分别加入25ul蛋白酶溶液。

1.2.3分别加入待测样本、HCV阴性对照、HCV临界阳性对照和HCV强阳性对照各200ul.

1.2.4加入200ul新鲜配制的裂解液工作液，盖上盖子，振荡15秒，充分混匀。（注意：

不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中）。

1.2.556摄氏度温浴15分钟。瞬时离心，以去除管盖上的滴液。

1.2.6加入250ul无水乙醇，盖上盖子，彻底混匀（振荡15秒）。在室温下静置5分钟

（15-25摄氏度）。注意：如果环境温度超过25摄氏度，无水乙醇需预冷。瞬时离心，以去除管盖上的滴液。

1.2.7将n个核酸提取柱放入收集管中，小心地将步骤1.2.6中的液体移入核酸提取柱

中。盖上盖子，6000*g离心1分钟。倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。（如果离心后核酸提取柱中仍有部分液体，以更高的速度再次离心，确保提取柱中无残余的液体）

1.2.8小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液1，盖上盖子，6000*g离心1分

钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。

1.2.9小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液2，盖上盖子，6000*g离心1分

钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。

1.2.10小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul无水乙醇，盖上盖子，6000*g离心1

分钟，丢弃收集管，将提取柱放入新的收集管中。

1.2.1120000*g高速离心3分钟，彻底去除乙醇。

1.2.12丢弃收集管，将核酸提取柱放入干净的1.5ml离心管中，打开提取柱的盖子，

56摄氏度温浴3分钟，以彻底去除残余的液体。

1.213 将核酸提取柱放入另一干净的1.5ml离心管中，小心打开提取柱的盖子，加入60ul

洗脱液（请将洗脱液加到膜的中央），盖上盖子，室温静置5分钟。20000*g高速离心1分钟收集滤出液，做好标记，4摄氏度保存备用。提取的病毒核酸应在2小时内用于PCR扩增，或在-70摄氏度下可以保存一个月。

2. 扩增试剂准备（PCR前准备区）

从试剂盒中取出HCV RT-PCR反应液、Enzyme Mix , 在室温下融化后，2000*g离心5秒。设所需要的PCR反应管数（玻璃毛细管）为n（n=样本数+1管空白对照+1管HCV 阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照+4管HCV定量标准品），每个测试反应体系配制如下表：

计算好各试剂的使用量，加入到一适当体积试管中，充分混匀均匀后2000*g离心10秒，向各玻璃毛细管中分装15ul，转移至样本处理区。

3.加样（样本处理区）

吸取10ul样本处理步骤1.2.13中收集得到的RNA溶液及HCV定量标准品分别加入到上述反应管中（空白对照直接加入10ul洗脱液），盖紧反应管管盖，连同Roche专用金属反应管套放在离心机中，于2000*g离心10秒，将毛细管转移到检测区。将毛细管排放好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。

4. RT-PCR反应（检测区）

4.1 循环条件设置

反应体系为25ul.具体设置方法请参照各仪器使用说明书。

4.2仪器检测通道选择

选择F1检测通道：HCV内对照（IC）选择F2检测通道。

4.3样本的设定

在扩增开始前条件设定时，将HCV定量标准品设为“Standard”并输入试剂盒内给定浓度值，待检样本和对照品设定为“Unknown”。

结果分析条件设定

1.对HCV的曲线和HCV内对照（IC）的曲线进行分别分析。

2.分析方式选择Fit Points，基线调整选择Arithmetic,阈值（threshold）设定原则

以阈值线刚好超过正常HCV阴性对照曲线的最高点，且正常HCV阴性对照病毒滴度为0.0IU/ml为准。具体设置方法请参照各仪器使用说明书。

质控标准

1.将HCV定量标准品1-4的浓度值输入，仪器将自动以HCV定量标准品的浓度值为横坐

标，以其实际测得的外标Ct值为纵坐标给出标准曲线，标准曲线的拟和度绝对值应大

于等于0.980，四个HCV定量标准品的Ct值都应<38.0，否则视为定量结果无效。

2.HCV阴性对照、空白对照HCV RNA应为0.0IU/ml；HCV强阳性对照HCV RNA应为

5.0E+05-1.0E+07IU/ml；HCV临界阳性对照应为1.0E+03-1.0E+05 IU/ml；且HCV阴

性对照、HCV临界阳性对照中HCV内对照（IC）的Ct值都应小于等于33，否则此次实验视为无效。所有实验从样本处理开始重做。

结果判断

1.检测样本中1.0E+03 IU/ml小于等于HCV RNA小于等于5.0E+07 IU/ml，测定结果有

效，可直接报告相应的浓度值。

2.检测样本中HCV RNA大于5.0E+07 IU/ml，可按实际测得值报告相应的病毒滴度，亦

可将该样本用正常人血浆按10倍梯度稀释到本试剂盒定量检测线性范围内后重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正。

3.检测样本中0.0IU/ml小于HCV RNA小于1.0E+03 IU/ml，且HCV内对照（IC）的Ct

值都应小于等于33，表明病毒载量较低，可直接报告浓度值，但注明该病毒滴度量仅供参考。

4.检测样本中HCV RNA等于0.0IU/ml，且HCV内对照（IC）的Ct值都应小于等于33，

应报告为小于试剂盒最低检测限。

5.检测样本中HCV内对照（IC）的Ct值大于33或Ct值为无数值，且HCV RNA小于等

于1.0E+03 IU/ml（包含0.0IU/ml或无数值）时，则此样本的定量结果视为无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。

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