米根霉产糖化酶发酵条件的研究

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米根霉产糖化酶发酵条件的研究
作者：王新惠， 刘达玉， WANG Xinhui， LIU Dayu
作者单位：王新惠,WANG Xinhui(长江师范学院,生命科学与技术学院,重庆,408100)， 刘达玉,LIU Dayu(成都大学,食品加工四川省重点实验室,四川,成都,610106)
刊名：
中国酿造
英文刊名：CHINA BREWING
年，卷(期)：2009，(9)
被引用次数：0次
1.武金霞.张贺迎.张瑞英一种快速检测糖化酶活力的电泳活性染色方法[期刊论文]-中国酿造 2004(01)
2.王新惠.李再新.刘达玉米根霉糖化酶酶促反应条件的研究[期刊论文]-食品科技 2008(05)
1.期刊论文王新惠.李再新.刘达玉.马艳华.李建.WANG Xin-hui.LI Zai-xin.LIU Da-yu.MA Yan-hua.LI Jian米
根霉糖化酶酶促反应条件的研究-食品科技2008,33(5)
以米根霉(Rhizopus oryzae)为供试菌株采用DNS法测定糖化酶的酶活力,系统地研究由该菌株分泌的糖化酶的酶促反应条件,主要考察反应时间、不同底物、底物浓度、反应温度、底物pH及金属离子等因素对酶活力的影响.结果表明,该酶系具有较高的酶活力可达到90 U/mL.对碳链较长的底物表现出较强的酶活力,最适酶促温度50～55℃,最适pH5.0～5.5,Mg2+、Zn2+和Ca2+对该酶系有不同程度的激活作用,其中Mg2+激活效应最大,而Mn2+、Cu2+和
Fe2+对该酶系有不同程度的抑制作用,其中Mn2+的抑制作用最大.
2.学位论文方华绍兴黄酒麦曲中微生物的初步研究2006
本文采用3种培养基分离麦曲中的微生物，共得到16株丝状真菌。

真菌总菌落数达2.7×106个/g曲，伞枝犁头霉、米根霉、微小毛霉、米曲霉、烟曲霉占了所有分离真菌的89％。

比较了超声波法，Yatalase酶法和氯化苄法提取麦曲中微生物总DNA的效果后，采用氯化苄法作为提取麦曲样品中微生物总DNA的方法。

分析了绍兴地区3个黄酒厂麦曲样品中真菌的RISA图谱，建立3个麦曲RISA图谱的克隆文库，通过条带的测序得到3个麦曲样品的主要微生物均有伞枝犁头霉、酿酒酵母、微小毛霉、米曲霉、构巢裸孢壳。

同时，发现地域环境影响着麦曲中的优势微生物。

采用RISA指纹图谱技术分析了在制曲过程中麦曲中数量占优势的真菌变化的过程。

根据图谱条带的变化，发现在制曲过程中，麦曲中优势真菌先增加后下降。

初步研究了麦曲7株优势真菌的产酶情况，其中AspergillusoryzaeAO-01产α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶，活力分别为112.5u/g干曲、1359.4u/g干曲、817.6u/g干曲，能够用作为黄酒纯种酿造的菌株。

而其它的6株真菌由于液化酶和糖化酶不产或产量很低，不能有效地将淀粉原料分解为酵母能利用的葡萄糖。

在真菌混合培养对产酶的影响的研究中，结果显示除AspergillusoryzaeAO-01和AspergillusnigerAN-13混合培养时，蛋白酶活力提高了3.7倍。

其它真菌的混合培养物，对产酶的影响不大。

通过响应面分析法和典型性分析得出AspergillusoryzaeAO-01产糖化酶的最优发酵条件：培养时间
32.8h，培养温度31.2℃，固水比1∶1.24，预测糖化酶的最大酶活为1625.4u/g干曲。

验证性实验证明在优化条件下，AspergillusoryzaeAO-01产糖化酶最高可达1645.1u/g干曲。

3.期刊论文张凤英.于博.马蕤.ZHANG Feng-ying.YU Bo.MA Rui米根霉F6的微波诱变-微波学报2007,23(z1)
本文利用微波诱变技术对产糖化酶米根霉菌F6进行诱变,结果筛选到一株糖化酶高产菌株F6-20d,不仅糖化酶活力提高了3.7倍,而且有很好的遗传稳定性.
4.学位论文杜木英西藏青稞酒发酵微生物及酿造技术研究2008
本论文以青稞和从拉萨市场购买的优良青稞酒曲为主要原料，应用传统微生物发酵技术结合现代纯种制曲发酵技术、现代分子生物学技术、现代仪器分析技术，采用理化指标分析结合感官评定技术，对两藏青稞酒曲及传统青稞酒的品质，青稞酒曲及青稞酒发酵过程中的微生物区系，优势发酵菌株的筛选和原生质体诱变，纯种制曲工艺，青稞酒纯种曲酿造工艺条件，青稞酒的纯种曲发酵与传统曲发酵过程中各成分的动态变化等方面进行了系统深入的研究。

在优势发酵菌株的选育，以纯种曲发酵技术生产青稞酒，改良传统西藏青稞酒的酿造工艺，提高青稞酒的品质等方面取得了较大的研究进展。

主要研究结果为：
1.应用理化分析、气-质联用和气相色谱并结合感官分析技术，对西藏青稞酒曲及传统青稞酒的品质进行了分析研究，得出青稞酒曲及传统青稞酒的品质特点如下：(1)西藏青稞酒曲属于小曲类型，外观形态不一、质量良莠不齐。

(2)传统青稞酒属于发酵酒范畴，各项理化指标值基本是在黄酒和清酒之间，传统优质青稞酒氨基酸含量110.912 mg/100mL，含有较丰富的矿物质和维生素B1，维生素B2，维生素C等；并从中检测出48种香气成分，包括醇，醛，酸，酯，酮类及少量酚等；香气值(含量/阈值)最大的是乙醛41.67，依次是乙酸40.38、异戊醇13.38、己酸4.65、乳酸乙酯3.07、正丁酸
2.94、乙酸乙酯2.65、β-苯乙醇2.14、3-羟基丁酮1.36，因此这9种成分对青稞酒的风味形成影响最大。

2.应用经典的微生物分离纯化鉴定技术结合现代分子生物学技术，对青稞酒曲及青稞酒发酵过程中的微生物区系进行了系统的研究，结果表明：
(1)从青稞酒曲中，鉴定了优势霉菌130株。

根霉属的有4种共81株，其中，米根霉(Rhizopus Dryzae)39株，黑根霉(Rhizopus nigricans)18株，华根霉(Rhizopus chinensis)15株,少根根霉(Rhizopus arrhizus)9株。

毛霉属有37株，其中18株为爪哇毛霉(Mucor javanicus)，11株为总状毛霉(Mucor racermosus)，8株为鲁氏毛霉(Mucor rouxians)，还有8株为犁头霉属(Absidia spp)。

其余丝状真菌的量非常少，分别属于曲霉属(Aspergillus spp.)，青霉属(Penicillium spp。

)，总状共头霉(Syncephalastrum racemosum)等。

经过初筛，复筛，青稞试饭等试验，筛选出糖化功能强的菌株
ZM2，糖化酶活力为520.27mg/h.g。

霉菌ZM2经ITS序列分析和构建系统发育树鉴定为米根霉(Rhizopus oryzae)。

(2)从青稞酒曲中，鉴定到属的优势酵母菌有580株，分别属于酵母属(Saccharomyces)、复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)、假丝酵母属(Candida)、毕赤氏酵母属(Pichia)、德巴利酵母属(Debaryomyces)及隐球酵母属(Cryptococcus)6个属。

其中，318株鉴定至种，分别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsisfibuligera)、清酒假丝酵母(Candida sake)、粉状毕赤氏酵母(Pichiafarinosa)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)和地生隐球酵母(Cryptococcus terreus)。

经TTC法和杜氏管法初筛，发酵法复筛，玉米糖化醪筛选，得至优良酵母菌株ZY2和糖化力较强的酵母ZY28。

酵母菌株ZY2在玉米糖化醪上产酒精度5.7％，121感与香气好，酸度正常。

酵母ZY28在青稞试饭试验中表现出浓郁愉悦的甜香、蜜香。

ZY2及ZY28经ITS序列分析和构建系统发育树分别鉴定为布拉酵母(Saccharomyces boulardii)与扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsisfibuligera)。

(3)从青稞酒曲中，鉴定了优势乳酸菌38株，分别属于乳杆菌属，链球菌属和片球菌属3个属。

其中有5株鉴定剑种，分别是粪链球菌(Streptococcus faecalis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidialactici)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)和米酒乳杆菌(Lactobacillus sake)。

筛选到一株戊糖片球菌ZB12作为后续研究菌株。

ZBl2经过16S rDNA序列分析和构建系统发育树，鉴定为戊糖片球菌，与常规生理生化反应的鉴定结果一致。

3.应用原生质体诱变技术对ZY2，ZM2进行UV+DES复合诱变，并经单因素实验和响应面法优化制曲工艺，研究结果如下：
(1)经UV+DES复合诱变ZY2的原生质体，得到突变株UV-DES-Y2，其产酒精能力比出发菌株ZY2提高了33.3％，发酵15Bx的麦芽汁，酒度可达
8.0％(v/v)；在耐热性，发酵能力，酒精耐受性，发酵温度范围，发酵速率和降糖速率方面均优于ZY2菌株。

以pH值3.5的葡萄糖豆芽汁与青稞粉按
1.0mL：
2.0g混合，接入15％的24h液体培养酵母UV-DES-Y2，32℃培养24～28h，30℃风干,得到酵母纯种曲2，菌数达9.2×108cfu/g。

(2)经UV+DES复合诱变ZM2的原生质体，得到高产糖化酶菌株UV-DES-M4，其产糖化酶活力达到846.27+79.24mg/h．G，比出发菌株ZM2提高了50.9％。

应用SAS8.2软件，通过响应面(Box-Behnken设计法)对霉菌制曲条件进行了优化，确定UV-DES-M4产糖化酶的最佳条件为：制曲温度为30.05℃，豆饼粉加入量为8.06％，接种量为1％，培养30h，得到纯种曲1，糖化酶活力高达895.32 mg/h·g。

(3)自然pH值的葡萄糖豆芽汁与青稞粉按1.0mL：2.0g混合，接入15％的24h液体培养酵母ZY28，25℃堵养30h，制得纯种曲3.
4.对青稞酒纯种曲酿造工艺条件进行了优化实验研究。

结果表明，青稞酒的最佳纯种曲发酵工艺条件为：选择“藏青320”青稞原料，淘洗干净后，浸泡或者不浸泡但加水1：2，进行常压蒸煮2 h，摊凉至35℃，接入青稞原料重量2％的纯种曲1.2％纯种曲2及1％纯种曲3，在28℃下发酵72h。

按此工艺得到的青稞酒，其理化指标和感官指标与传统曲发酵的青稞酒基本一致。

5.对青稞酒的纯种曲发酵与传统曲发酵过程中各成分的动态变化进行了研究，结果表明，青稞酒的纯种曲发酵过程中，表现出类似传统曲发酵过程中各成分的动态变化趋势，如pH值明显下降和酸度上升；发酵品温先缓升，再缓降，最高达36"C左右；还原糖含量和糖化酶活力值都在24h内显著增加(P<0.05)，达到最大值后逐渐下降：总糖含量呈显著性下降趋势，而酒精度显著增高(P<0.05)，纯种发酵的酒精度可达到10.3％，比传统发酵的提高57.7％；酒醅中酸性蛋白酶活力及氨态氮含量同时呈显著性增高(P<0.05)，24h后，蛋白酶活力及氨态氮含量逐渐降低：纯种发酵的青稞酒氨基酸含量只有80.923 mg/100mL，缺乏蛋氨酸。

5.期刊论文郝莹.王卫卫.王莉娟.官小明.董静.孙军陕北传统米酒曲中优势菌种的分离、纯化及鉴定-检验检疫
学刊2010,20(2)
为进一步提高陕北传统米酒的质量,保持或改善其风味,本研究对陕北传统米酒酒曲中的微生物进行分离、纯化、鉴定,并分析了微生物的数量分布.根据培养特性、菌体形态及生理生化检测进行菌种鉴定,得到24个不同属、种的微生物菌株;活菌计数结果显示霉菌和酵母菌为酒曲中的优势菌种,分别占总菌数的57%和38%.将分离所得微生物中17个种的优势菌株进行纯种培养,其中霉菌8株,酵母菌9株.并对8株霉菌所产生的α-淀粉酶和糖化酶活力进行比较研究,结果显示米根霉(Rhizopus oryzae),华根霉(Rhizopus chinensis),米曲霉(Aspergillus oryzae)相比另外5株霉菌表现出较高的酶活力,其α-淀粉酶活力分别为798U/g,672U/g,701 U/g;糖化酶活力分别为2641U/g,2321 U/g,2538U/g,可作为生产米酒的理想菌种.
6.期刊论文马蕤.朱江.张凤英.陈卫平.MA Rui.ZHU Jiang.ZHANG Feng-ying.CHEN Wei-ping湖北传统酒曲中优势
霉菌F14的鉴定-酿酒科技2007(9)
从湖北民间传统酒曲中分离得到1株霉菌F14,其糖化酶活力强,所酿的酒具有独特风味.对F14进行了菌落形态、菌体特征形态的观察及Pfeffer氏液培养等鉴定试验,F14具有假根、匍匐菌丝、孢囊孢子、菌丝无隔膜等根霉的典型形态特征;且在Pfeffer氏液中于28℃、37℃条件下培养生长,在45℃条件下不生长.鉴定确定该菌株为米根霉种(Rhizopus oryzae).
7.学位论文叶磊小曲中优良根霉的分离筛选及产酶条件研究2009
我国小曲资源丰富，构成了一个巨大的微生物菌种库，里面蕴藏着许多质量优良的菌种。

本文以收集的传统小曲为样本，分离并纯化其中的根霉
，筛选得到了ERh203和ERh505两个优良菌株，同时研究了其产酶特点，优化了制曲条件，并完成了对菌株的鉴定工作。

实验结果如下：
(1)通过对8种传统小曲样品的分析发现：曲2糖化力和液化力最高，蛋白酶活力也较高，而曲5具有最高的蛋白酶活力，糖化力和液化力也相对较高，从这两种小曲中分离纯化并得到了12株根霉。

通过制曲和糯米试饭试验，比较了各菌株的产酶特点，筛选出了ERh203和ERh505两株优势根霉。

同时发现，这两株根霉都具有一定的产酒精能力，这也是优良根霉的重要特点之一。

(2)单因素试验表明，培养时间对两株根霉产酶有较大的影响，培养3-4天有利于根霉的生长和酶活力的提高。

同时，温度也影响着根霉的产酶情况，在30℃时，糖化酶和液化酶活力较高，而蛋白酶活力则在26℃下培养时却达到最大值。

在pH5.2-pH7.0之间，根霉产酶活性比较稳定。

在麸皮培养基中添加一定量的玉米粉能显著提高根霉的产酶能力，当玉米粉浓度为8％-12％时，酶活力都有不同程度的增加。

ERh203在玉米粉浓度为8％时，糖化酶活力和液化酶活力都达到最大，分别为919.37 mg/h·g-1和648.64 mg/h·g-1，分别增加了6.7％和5.4％，蛋白酶活力在添加12％玉米粉时达到最大值860.74μg/min·g-1，增加了5.9％。

(3)正交试验结果表明：培养温度、培养时间、玉米粉浓度对菌株ERh203产糖化酶、液化酶和蛋白酶的活性的影响显著。

对糖化酶的影响顺序是培养温度＞培养时间＞玉米粉浓度，最佳条件是培养温度30℃、培养时间3d和添加玉米粉浓度8％。

对液化酶的影响是培养时间＞培养温度＞玉米粉浓度，最佳条件是温度30℃、时间3d和玉米粉浓度8％。

对蛋白酶的影响是培养时间＞培养温度＞玉米粉浓度，最佳条件是培养温度28℃、培养时间4d和玉米粉浓度12％。

(4)通过显微镜下菌落形态，如菌丝、假根、孢子囊、孢囊孢子、厚垣孢子等的观察和测量，结果为：ERh203是藻状菌纲(Phycomycetes)毛霉目(Mucorales)毛霉科(Mucoraceae)根霉属(Rhizopus Ehrenberg)中的米根霉(Rhizopus oryzae Went et Prinsen Geerlings)，ERh505是藻状菌纲(Phycomycetes)毛霉目(Mucorales)毛霉科(Mucoraceae)根霉属(Phizopus Ehrenberg)中的河内根霉(Rhizopus tonkinensis Vuill)。

8.期刊论文王小红.王莹.赵山.陈福生.WANG Xiaohong.WANG Ying.ZHAO Shan.CHEN Fusheng孝感凤窝酒曲中根霉
的分离及特性研究-中国酿造2008(7)
采用马丁孟加拉红培养基对孝感凤窝酒曲中的根霉进行分离,得到2株根霉M1和M2的糖化酶活力分别达到2015.48mg/h·g和2125.61 mg/h·g.经形态学鉴定,它们分别是黑根霉(Rhizopu nigricans)和米根霉(Rhizopus oryzae).同时,将这2株根霉分别接入糯米饭中进行发酵,测定酒酿的糖化酶活力、还原糖含量、总酸和总糖,并对酒酿进行了感官评定.
9.期刊论文于博.董开发.张凤英.Yu Bo.Dong Kaifa.Zhang Fengying广东肇庆传统酒曲优势霉菌的分离及鉴定-
中国食品学报2007,7(1)
为对广东肇庆传统小曲的优势霉菌进行鉴定,以该小曲的稀释液涂布于麦芽汁平板上,分离、纯化得到菌株F6,然后观察F6的培养特征和菌体形态特征,做普氏(Pfeffer)培养液等鉴定试验,并与目前应用广泛的菌株Q303的生长特征进行对比.结果表明:F6具有假根、匍匐茎、孢囊孢子、菌丝无隔膜等根霉的典型形态特征,且在普氏培养液中28℃和37℃下能生长,在45℃下不能生长.与Q303相比,F6的孢子囊梗和菌丝更短,在麦芽汁培养基表面上生长会起皱褶,气生菌丝稀疏,有极少的孢子囊.广东肇庆传统小曲的优势霉菌F6为米根霉种(Rhizopus oryzae).F6糖化酶活力强,所酿之酒具有独特风味.
10.学位论文刘磊优良根霉菌和酵母菌的选育及其在黄酒中的应用研究2008
黄酒生产用的小曲是利用自然界的根霉及酵母在原料上混合培养,故难控制根霉和酵母按预定比例生长,更难控制每批成曲质量的一致性,而以麸皮为原料制纯种根霉曲,制曲时将纯种的根霉和酵母分开培养,然后按一定比例配成酿酒用的酒曲,不仅能节约大量的上等大米和中药材,而且酒曲还具有良好的发酵性能。

本研究从各黄酒生产地收集到的优质酒曲中分离筛选出优良根霉菌和酵母菌,以此制作纯种根霉曲,确定最佳的黄酒生产发酵工艺,具体研究内容和结论如下：
从5种不同的酒曲中分离出5株根霉菌,通过比较发现1号根霉产液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力及试饭糖化力较高,分别是：36u/g、
3614.3u/g、58.2u/g、5932mg/(g·h);并优化了1号根霉的产酶条件,得出最佳的产酶条件是：温度30℃、料水比1:1.6、(NH4)2SO4的添加量0.5％,在该条件下1号根霉产糖化酶活力提高了6.6％,试饭糖化力提高了1.8％,分别是：3852.3u/g、6041 mg/(g·h)。

从5种不同的酒曲中分离出了10株酵母菌,并观察了它们的细胞形态和群体形态特征。

通过对10株酵母菌的比较发现,1号酵母和8号酵母在28℃下的发酵力较强,产酒精分别为7.91％、7.31％；在温度高达42℃时仍可进行发酵,产酒精分别为3.51％、3.01％；在10％的乙醇浓度下能进行一定的发酵；产酒精分别为3.01％、2.61％；在凝聚性的比较中,1号酵母和8号酵母的分别是0.65、0.62。

1号酵母和8号酵母在发酵能力、抗高温能力、耐乙醇能力及凝聚性等方面优于其它酵母,从而筛选出了两株性能优良的黄酒生产酵母菌株。

纯种根霉曲的最佳配方是1号根霉与1号酵母的配比为8: 2。

通过比较发现纯种根霉曲的贮藏性能好,经过8个月的贮藏,原料出酒率仍高达171％,酒精
度达到9.45％。

通过纯种根霉曲发酵与黄酒酸败的对比分析发现,纯种根霉曲有抵抗杂菌能力强,起酵早,糖化发酵快,产酒精高等特点。

显微镜下观察发现纯种根霉曲的孢子稠密,菌丝粗壮。

确定了纯种根霉曲发酵生产黄酒的最佳工艺是：浸米时间8～10h,发酵温度28℃,发酵时间7d,用曲添加量1.5％,杀菌条件是80℃、15min。

在最佳工艺条件下,用纯种根霉曲酿出来的酒色泽橙黄清亮、香气浓郁、口感鲜甜爽口,含总酸4.08g/L、总糖158g/L、酒精度12.30％,达到了国家对甜黄酒的优级要求。

经鉴定,1号酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),1号根霉是米根霉(Rhizopus oryzae)。

本文链接：/Periodical_zgnz200909025.aspx
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