实验一 培养基的配制与灭菌
实验一 培养基的制备消毒灭菌
(2) 装放待灭菌物品：将已包扎好的物品放入内桶。盖上锅盖，以两
两对称方式同时旋紧螺栓，勿使漏气。
(3) 加热排气：接通热源，同时打开排气阀，待见有大量水汽排出时，
维持3---5min，锅内空气排尽，关上排气阀。另外一种排气方法：先将排气 阀关闭，待加热升温内压达到5磅时再打开排气阀，等到压力表指针回到零， 关闭排气阀。
培养基的作用：微生物分离、培养、增殖、保藏及鉴定。
培养基配制原则
◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆
选择适宜的营养物质 营养物质浓度及配比合适 控制pH条件 控制氧化还原电位
原料来源的选择
根据培养目的不同调配
灭菌处理
2 消毒和灭菌的原理
★ 消毒与灭菌是确保 微生物纯培养 （由一个菌体
生长繁殖的群体）的最基本的实验技术。
高 压 蒸 汽 灭 菌 锅
a 方法：一般121℃（1kg/cm2或15磅/英寸2） 20-30min。 b 适用：耐高温物品如培养基，无菌水，培养皿。 c 注意事项：灭菌开始排净冷空气；
灭菌终了，自然缓慢降压回零；
灭菌结束，趁热取出物品。
三 实验操作步骤
分组操作：分6组，5人1组。
◆ ◆ ◆
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（第1~2组做，每组600ml） 马铃薯糖琼脂培养基（第3~4组做，400ml） 高氏1号培养基（第5~6组做，200ml）
每组需要做的其它工作
（1）每组包1ml吸管5支（塞棉花）（示范） 。 （2）每组包培养皿2包（每包6个） （示范）。 （3）每组装9ml无菌水5管。 （4）每组装20ml无菌水2瓶（50ml三角瓶，内有玻璃珠）。
（5）装锅灭菌。
高压蒸汽灭菌
(1) 灭菌前的准备：将高压蒸汽灭菌锅的内桶取出，向外锅内加入适
实验一培养基的配制与灭菌
实验一培养基的配制与灭菌一、目的掌握培养基母液的配制方法；培养基的配制和灭菌技术；不同质地实验用品的灭菌方法。
二、方法步骤1、母液配制一般大量元素、微量元素和其它成分分别配制成100－200倍母液，使用时按比例稀释即可。
配好的母液需贮存于2～4℃的冰箱中，定期检查有无沉淀和微生物污染，如果出现沉淀或微生物污染，则不能使用。
2、植物激素配制植物激素一般配制成浓度为0.1—1.0mg/ml的溶液，贮存在2～4℃下备用。
由于多数激素难溶于水，所以配制时应按下面步骤进行：IAA：先用少量95%乙醇使之充分溶解，再加蒸馏水定容至需要浓度的体积。
NAA：可溶于热水中，也可采用与IAA同样的方法配制。
2,4-D：先用少量1mol/L的NaOH溶液充分溶解，然后缓慢加入蒸馏水定容至需要浓度体积。
细胞分裂素类：KT和BA等细胞分裂素类物质均溶于稀盐酸，应先用少量1mol/L的HCl溶解后再稀释至需要浓度。
赤霉素：赤霉素的水溶液稳定性较差，一般用95%的乙醇配制成5～10mg/ml的母液低温保存，使用时再稀释。
3、培养基配制按实际配制培养基体积，取各母液的需要量加入一适当体积的烧杯或其它配制培养基的容器中，再加入实际配制培养基体积约2/3—3/4的蒸馏水，然后以每升所用蔗糖的量称取放入培养基并使其溶化。
用0.1mol/L的NaOH或0.1mol/L的HCl调整pH至5.6—5.8，以0.6%—0.8%的比例加入琼脂，并搅拌加热使琼脂完全溶化，用蒸馏水定容至终体积，混合均匀后分装于培养器皿中，然后进行高压灭菌。
4、培养基灭菌分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件为温度121℃，压力0.105MPa，灭菌时间与培养基容量的关系如下表所示。
培养基体积与灭菌时间的关系三、结果与分析1、培养基的母液配制情况。
2、培养基配制时的注意事项。
四、提交实验报告附：MS培养基配方。
实验一培养基的配制及灭菌
实验一培养基(d e)配制及灭菌培养基是人工配制(de)适合微生物生长繁殖或积累代谢产物(de)营养基质,用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物.各类微生物对营养(de)要求不尽相同,因而培养基(de)种类繁多.在这些培养基中,就营养物质而言,一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类.培养基(de)配制,一是要求在营养成分上能满足所培养微生物生长发育(de)需要,二是培养基在使用前不带菌,三是以灭菌后和保存过程中营养成分不发生变化.培养基(de)灭菌通常在培养基配制后进行,其目(de)是杀灭培养基中残存(de)微生物或活(de)生物残体,保证培养基在贮存过程中不变质,也防止其他生物对培养(de)污染.一、实验目(de)1．掌握实验室常用玻璃器皿(de)清洗、干燥和包扎方法.2．明确培养基(de)配制原理.3．掌握配制培养基(de)一般方法和步骤.4．了解湿热和干热灭菌(de)原理,并掌握有关(de)操作技术.二、实验原理灭菌是指杀灭物体中所有微生物(de)繁殖体和芽孢(de)过程.消毒是指用物理、化学或生物(de)方法杀死病原微生物(de)过程.灭菌(de)原理就是使蛋白质和核酸等生物大分子发生变性,从而达到灭菌(de)作用,实验室中最常用(de)就是干热灭菌和湿热灭菌.干热灭菌是利用高温使微生物细胞内(de)蛋白质凝固变性而达到灭菌(de)目(de).细胞内(de)蛋白质凝固性与其本身(de)含水量有关,在菌体受热时,当环境和细胞内含水量越大,则蛋白质凝固就越快,反之含水量越小,凝固缓慢.因此,与湿热灭菌相比,干热灭菌所需温度高（160～170℃）,时间长（1～2h）.但干热灭菌温度不能超过180℃.否则,包器皿(de)纸或棉塞就会烧焦,甚至引起燃烧.高压蒸气灭菌是将待灭菌(de)物品放在一个密闭(de)加压灭菌锅内,通过加热,使灭菌锅隔套间(de)水沸腾而产生蒸气.待水蒸气急剧地将锅内(de)冷空气从排气阀中驱尽,然后关闭排气阀,继续加热,此时由于蒸气不能溢出,而增加了灭菌器内(de)压力,从而使沸点增高,得到高于100℃(de)温度.导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌(de)目(de). 在同一温度下,湿热(de)杀菌效力比干热大.其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分,蛋白质较易凝固,因蛋白质含水量增加,所需凝固温度降低,二是湿热(de)穿透力比干热大,三是湿热(de)蒸气有潜热存在.这种潜热,能迅速提高被灭菌物体(de)温度,从而增加灭菌效力.培养基是人工配制(de)适合微生物生长繁殖或积累代谢产物(de)营养基质,用以提供微生物生长发育所需(de)物质条件.培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基和LB培养基,培养放线菌常用高氏I号培养基,培养霉菌常用蔡氏培养基或马铃薯葡萄糖培养基（PDA）,培养酵母菌常用麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖培养基（PDA）.根据培养目(de)不同,可分为固体培养基和液体培养基；此外,还有加富、选择、鉴别等培养基之分.就培养基中(de)营养物质而言,一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类.琼脂（Agar）只是固体培养基(de)支持物,一般不为微生物所利用.它在高温下熔化成液体,而在45℃左右开始凝固成固体.在配制培养基时,根据各类微生物(de)特点,就可以配制出适合不同种类微生物生长发育所需要(de)培养基. 培养基除了满足微生物所必需营养物质外,还要求有一定(de)酸碱度和渗透压.霉菌和酵母菌(de)pH偏酸；细菌、放线菌(de)pH为微碱性.所以每次配制培养基时,都要将培养基(de)pH值调到一定(de)范围.常用微生物培养基(de)配方如下：LB培养基配方（pH ）：胰蛋白胨（Tryptone） 10.0 g酵母提取物（Yeast extract） 5.0 g氯化钠（NaCl） 10.0 g琼脂粉（Agar） 20.0 g摇动容器直至溶质溶解,用5mol/L NaOH调pH至 ,用去离子水定容至1L,在压力下灭菌20min.牛肉膏蛋白胨培养基配方（pH）：牛肉膏 3.0 g胰蛋白胨（Tryptone） 10.0 gNaCl 5.0 g琼脂粉（Agar） 20.0 g去离子水 1000 mL高氏I号培养基配方（pH ）：可溶性淀粉 20.0 gNaCl 0.5 gKNO31.0 gK 2HPO43H2O 0.5 gMgSO47H2O 0.5 gFeSO47H2O 0.01g琼脂粉（Agar） 20.0 g去离子水 1000 mL马铃薯培养基配方（自然pH）：马铃薯（去皮） 200.0 g葡萄糖（或蔗糖）（Dextrose or glucose） 20.0 g琼脂粉（Agar） 20.0 g去离子水 1000 mL察氏培养基配方（自然pH）：蔗糖（glucose） 30.0 gNaNO32.0 gK 2HPO41.0 gKCl 0.5 gMgSO47H2O 0.5 gFeSO47H2O 0.01 g琼脂粉（Agar） 20.0 g去离子水 1000 mLYPD培养基配方（pH ）：酵母提取物（Yeast extract） 10.0 g蛋白胨（Peptone） 20.0 g葡萄糖或蔗糖（Dextrose or glucose） 20.0 g琼脂粉（Agar） 20.0 g去离子水 1000mL在压力下灭菌20min.三、实验材料牛肉膏蛋白胨、高氏I 号、LB 、PDA 、YPD 、察氏等各种培养基.四、仪器设备及用具1. 90mm 培养皿、吸管、试管、三角瓶、试管刷、硅胶塞、棉花、牛皮纸或报纸、包扎绳、去污粉、洗涤剂、烧杯、量筒、玻棒、牛角匙、pH 试纸（pH ～）、记号笔、麻绳、纱布等；2. 培养基分装器、天平、电磁炉、微波炉、电炉、石棉网、电热鼓风干燥箱、立式高压蒸汽灭菌锅.五、试剂无水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、马铃薯、蔗糖、可溶性淀粉、蛋白胨（Peptone ）、胰蛋白胨（Tryptone ）、酵母提取物（Yeast extract ）、NaCl 、琼脂粉、5mol/L NaOH 、1mol/L HCl 、KNO 3、K 2HPO 43H 2O 、MgSO 47H 2O 、FeSO 47H 2O 等.六、实验步骤1．洗涤用试管刷蘸取少量去污粉反复刷洗器皿2～3次；用自来水冲洗 2～3次；用少量去离子水荡洗 1～2次,控干水分.注意事项：①不能用有腐蚀作用(de)化学试剂,也不能使用比玻璃硬度大(de)物品来擦拭玻璃器皿；新(de)玻璃器皿应用2%(de)盐酸溶液浸泡数小时,用水充分洗干净.②用过(de)器皿应立即洗涤.③强酸、强碱、琼脂等能腐蚀、阻塞管道(de)物质不能直接倒在洗涤槽内,必须到在废物缸内.④洗涤后(de)器皿应达到玻璃壁能被水均匀湿润而无条纹和水珠.2．器皿包扎（1）培养皿：洗净(de)培养皿烘干后每5套（或根据需要而定）叠在一起,用牢固(de)纸卷成一筒,或装入特制(de)不锈钢桶中,然后进行灭菌.（2）吸管：洗净,烘干后(de)吸管,在吸口(de)一头塞入少许脱脂棉花,以防在使用时造成污染.塞入(de)棉花量要适宜,多余(de)棉花可用酒精灯火焰烧掉.每支吸管用一条宽约4～5cm(de)纸条,以 30～50℃(de)角度螺旋形卷起来,吸管(de)尖端在头部,另一端用剩余(de)纸条打成一结,以防散开,标上容量,若干支吸管包扎成一束进行灭菌,使用时,从吸管中间拧断纸条,抽出吸管.（3）试管和三角瓶：试管和三角瓶都需要做合适(de)棉塞,棉塞可起过滤作用,避免空气中(de)微生物进入容器.制作棉塞时,要求棉花紧贴玻璃壁,没有皱纹和缝隙,松紧适宜.过紧易挤破管口和不易塞入；过松易掉落和污染.棉塞(de)长度不小于管口直径(de)2倍,约2/3塞进管口.若干支试管用绳扎在一起,在棉花部分外包裹油纸或牛皮纸,再用绳扎紧.三角瓶加棉塞后单个用报纸包扎.3．烘干洗净(de)仪器控去水分,放在烘箱内烘干,烘箱温度为 105～110℃烘1小时左右.此法适用于一般仪器.对于急于干燥(de)仪器或不适于放入烘箱(de)较大(de)仪器可用吹干(de)办法.通常用少量乙醇、丙酮（或最后再用乙醚）倒入已控去水分(de)仪器中摇洗,然后用电吹风机吹至完全干燥.不急等用(de)仪器,可在蒸馏水冲洗后在无尘处倒置处控去水分,然后自然干燥.可用安有木钉(de)架子或带有透气孔(de)玻璃柜放置仪器.4．培养基(de)配置（1）牛肉膏蛋白胨培养基A、称量按培养基配方比例依次推确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCL放入烧杯中.牛肉膏常用玻棒挑取,放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶化后倒入烧杯,也可按在称量纸上,称量后直接放入水中,这时如稍微加热,牛肉膏便会与称量纸分离,然后立即取出纸片.蛋白胨很易吸湿,在称取时动作要迅速.另外,称药品时严防药品混杂,一把牛角匙用于一种药品,或称取一种药品后,洗净,擦干,再称取另一药品.瓶盖也不要盖错.B、融化在上述烧杯中先加入少于所需要(de)水量,用玻棒搅匀,然后,在石棉网上加热使其溶解.将药品完全溶解后,补充水到所需(de)总体积,如果配制固体培养基时,将称好(de)琼脂放入己溶(de)药品中,再加热溶化,最后补足所损失(de)水分.C、调节pH在未调pH前,先用精密pH试纸测量培养基(de)原始pH,如果偏酸,用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸测其pH,直至pH达.反之,用1mol/LHCL进行调节.对于有些要求pH较精确(de)微生物,其pH(de)调节可用酸度计进行.pH不要调过头,以避免回调而影响培养基内各离子(de)浓度.配制pH低(de)琼脂培养基时,若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌,则琼脂因水解不能凝固.D、过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤,以利某些实验结果(de)观察.一般无特殊要求(de)情况下可以省去（本实验勿需过滤）.E、分装按实验要求,可将配制(de)培养基分装人试管内或三角烧瓶内（见图3-1）.a液体分装：分装高度以试管高度(de)l/4左右为宜.分装三角瓶(de)量则根据需要而定,一般以不超过三角瓶容积(de)一半为宜,如果是用于振荡培养用,则根据通气量(de)要求酌情减图1-1培养基(de)分装A漏斗分装装置；B自动分装装置.1铁架；2漏斗；3孔胶管；4弹簧夹；5玻璃；6流速调节；7装量调节；8开关少；有(de)液体培养基在灭菌后,需要补加一定量(de)其他无菌成分,如抗生素等,则装量一定要准确.b固体分装：分装试管,其装量不超过管高(de)1/5,灭菌后制成斜面.分装三角烧瓶(de)量以不超过三角烧瓶容积(de)一半为宜.c半固体分装：试管一般以试管高度(de)1/3为宜,灭菌后垂直待凝.在分装过程中,应注意不要使培养基沾在管（瓶）口上,以免沾污棉塞而引起污染.F、加塞培养基分装完毕后,在试管口或三角烷瓶口上塞上棉塞（或硅胶塞及试管帽等）,棉塞(de)作用有二：一方面阻止外界微生物进入培养基,防止由此而引起(de)污染；另一方面保证有良好(de)通气性能,使培养在里面(de)微生物能够从外界源源不断地获得新鲜无菌空气.因此棉塞质量(de)好坏对实验(de)结果有着很大(de)影响.一只好(de)棉塞,外形应象一只蘑菇,大小、松紧都应适当（见图3-2）.加塞时(de)棉塞(de)总长度(de)3/5应在口内,2/5在口外.图1-2 棉塞(de)制作G 、包扎加塞后,将全部试管用麻绳捆好,再在棉塞外包一层牛皮纸,以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞,其外再用一道麻绳扎好.用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期.三角烧瓶加塞后,外包牛皮纸,用麻绳以活结形式扎好,使用时容易解开,同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期.（2）高氏I 号培养基配制方法A 、称量和溶化：按配方先称取可溶性淀粉、放入小烧杯中,并用少量冷水将淀粉调成糊状,再加入少于所需水量(de)沸水中,继续加热,使可溶性淀粉完全溶化.然后再称取其他各成分依次逐一溶化.对微量成分FeSO 47H 2O 可先配成高浓度(de)贮备液按比例换算后再加入,方法是先在100mL 水中加入1g(de)FeSO 47H 2O 配成0.01g/mL,再在1000mL 培养基中加1mL(de)mL(de)贮备液即可.待所有药品完全溶解后,补充水分到所需(de)总体积.如要配制固体培养基,其溶化过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制方法.B 、调pH 、分装、包扎：灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制方法.（3）LB 培养基配制方法准确称量胰蛋白胨（Tryptone ）10g,酵母提取物（Yeast extract ）5g,氯化钠（NaCl ） 10g 放入一烧杯中,摇动容器直至溶质溶解,加入15～20g 琼脂粉,用5 mol/L NaOH 调pH 至,用去离子水定容至1L,分装,灭菌20min.（4）马铃薯培养基配制（PDA ）取去皮马铃薯200g,切成小块,放入1500mL(de)烧杯中煮沸30min,注意用玻棒搅拌以防糊底.然后用双层纱布过滤,取滤液加糖（酵母菌用葡萄糖,霉菌用蔗糖）,加热煮沸后加入琼脂,继续加热融化并补足失水.再按前所述,进行分装、加塞、包扎、灭菌20min.（5）察氏培养基配制方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制.（6）YPD培养基配制方法同LB培养基配制.5. 灭菌（1）高压蒸气灭菌A、首先将内层锅取出,再向外层锅内加入适量(de)去离子水,使水面与三角搁架相平为宜.B、放回内层锅,并装入待灭菌物品（各种玻璃器皿、培养基等）.注意不要装得太挤,以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果,三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触,以免冷凝水淋湿包口(de)纸而透人棉塞.C、加盖,并将盖上(de)排气软管插入内层锅(de)排气槽内.再以两两对称(de)方式同时旋紧相对(de)两个螺拴,使螺栓松紧一致,勿使漏气.D、通电加热,并同时打开排气阀,使水沸腾5min,以排除锅内(de)冷空气.待冷空气完全排尽后,关上徘气阀,让锅内(de)温度随蒸气压力增加而逐渐上升.当锅内压力升到所得压力时,控制热源,维持压力至所需时间.E、灭菌所需时间到后,切断电源,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表(de)压力降至“0”时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品.（2）干热灭菌A、装入待灭菌物品将包好(de)待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电烘箱内,关好箱门.B、升温接通电源,拨动开关,打开电烘箱排气孔,旋动恒温调节器至绿灯亮,让温度逐渐上升.当温度升至100℃时,关闭排气孔.在升温过程中,如果红灯熄灭,绿灯亮,表示箱内停止加温,此时如果还未达到所需(de)160～170℃温度,则需转动调节器使红灯再亮,如此反复调节,直至达到所需温度.C、恒温当温度升到160～170℃时,借恒温调节器(de)自动控制,保温2h.D、降温切断电源、自然降温.E、开箱取物待电烘箱内温度降到70℃以下后,打开箱门,取出灭菌物品.6. 无菌捡查将灭菌培养基放入37℃(de)温室中培养24～48h,以检查灭菌是否彻底.注意事项：由于纸张和棉花在180℃以上时,容易焦化起火,所以干热灭菌(de)温度切勿超过180℃；由于油纸在高温下会产生油滴,滴到电热丝上易着火,所以进行干热灭菌(de)玻璃器皿严禁用油纸包装；由于温度(de)急剧下降,会使玻璃器皿破裂,所以烘箱(de)温度只有下降到60℃以下,才可打开烘箱门；烘箱内物品不宜放得太多,以免影响空气流通,而使温度计上(de)温度指示不准,造成上面温度达不到,下面温度过高,影响灭菌效果.七、思考题1. 为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要(de)温度高,时间长2. 在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题,为什么3. 在配制培养基(de)操作过程中应注意些什么问题为什么4. 培养基配好后为什么必须立即灭菌如何检查灭菌后培养基是否无菌5. 你配制(de)高氏I号培养基有沉淀产生吗说明产生或未产生(de)原因.6. 细菌能在高氏I号培养基上生长吗为了分离放线菌,你认为应该采取什么措施。
微生物实验
①标 本
③ 孔径 光栏
⑤ 光轴中心调节 螺钉
③ 视场 光栏
N.A聚=(0.6-0.8)N.A物
操作步骤如下: (1）可变光栏的中心对准聚光镜的中心。如果可变光栏的水
平是固定的，则装配时已保证它与聚光镜合轴，不必调整;如果可 变光栏的水平位置可以移动，则应把可变光栏关到最小，使它的 中心孔对准聚光镜下方的透镜中心。
实验一培养基的配置、灭菌与无菌操 作技术
1、明确培养基的配制原则，掌握配制培养基的一般方法 和步骤； 2、掌握玻璃器皿的洗涤和包扎方法，了解玻璃器皿的灭 菌方法和原理； 3、了解几种常用灭菌方法的基本原理及应用范围； 4、掌握高压蒸汽灭菌技术，。
微生物学实验所用的器皿，大多要进行消毒、灭 菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包 装方法均有一定的要求。清洁的玻璃器皿是实验 得到正确结果的先决条件，包扎方法要能保证防 止污染杂菌。空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若 用湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎。
为什么要将培养基倒置培养？
显微镜概述 微生物的个体微小，必须借助显微镜才能观察到。因
此，显微镜就成为微生物学研究工作者不可缺少的基本工 具。所以，了解显微镜的种类、结构、功能和正确地掌握 不同显微镜的使用方法是很有必要的。
显微镜可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。光学 显微镜有普通光学显微镜、相差显微镜、微分干涉差显微 镜、暗视野显微镜、紫外光显微镜、偏光显微镜和荧光显 微镜。下面主要介绍普通光学显微镜。
一、目的要求 1.学习显微镜的结构、功能和使用方法。 2.学习并掌握油镜的原理和使用方法。 3.学习微生物涂片、染色的操作技术；
4.掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法；
5.掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。
实验一 培养基的制备与灭菌
实验一培养基的制备与灭菌一、实验目的1. 了解配制培养基的一般方法和步骤;掌握牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯葡萄糖(蔗糖)培养基的制备方法。
2. 了解灭菌的原理，掌握高压蒸气灭菌的操作方法。
二、实验器材1. 药品:牛肉膏;蛋白胨;氯化钠;葡萄糖(蔗糖);琼脂;1N NaOH;1N HCl等。
2. 仪器及其他:试管;锥形瓶;量杯;玻璃棒;漏斗;纱布;棉花;报纸;天平或台秤;马铃薯;电炉;铝锅;灭菌锅等。
三、实验方法(一)配制培养基的基本过程:(1)称量:按照培养基配方，称取各种原料放于锅中;(2)溶解:锅中加入所需水量(自来水)，加热溶解。
要不断搅拌，以免糊底烧焦，最后加水补足失去的水分;(3)调pH值:按配方要求调节;(4)过滤:用过滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求，此步可以省去。
(5)分装:按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。
分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。
分装量:斜面培养基装入的培养基约为试管高度的l/5,1/4，灭菌后制成斜面。
分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。
(6)加棉塞:试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。
制作棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入圆孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。
也可借用玻璃棒塞入，也可以用折叠卷塞法制作棉塞(见图)。
棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。
棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，以瓶、管不下落为准。
棉塞的2/3应在管内，上端露出1/3，便于提拔。
如制作时不慎沾上培养基则不可再用。
(7)包扎:加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。
若培养基分装于试管中，则应以7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。
然后用笔注明培养基名称、组别、日期。
实验一 MS培养基配制和灭菌
实验一MS培养基配制和灭菌一．目的和要求：1. 学会MS培养基的制作方法;2. 掌握高压灭菌的方法和基本操作。
二、仪器与试剂1. 仪器：灭菌锅、解剖刀、枪状镊子、烧杯（500ml）、培养皿、移液管等2. 试剂：MS的Macro-e、Micro-e、有机母液、Fe盐、肌醇蔗糖，琼脂粉，1N NaoH 和1N HCl三、方法步骤（一）配方设计: 以MS为基本培养基（mg/L）（二）配制培养基(1)溶化琼脂：量取300ml左右蒸馏水，加入4.8g琼脂粉，加热溶解直至完全融化。
(2) 各种母液的吸取：Macro-e 50mlMicro-e 1ml有机成分1mlFe盐5ml肌醇10ml加在一起，倒入烧杯（1L)（3）加入糖:称取30g 蔗糖，溶于溶有琼脂的300ml 蒸馏水中。
（4）根据实验设计，量取生长调节剂:加在一起，倒入烧杯。
（5）定容:加蒸馏水（用量杯）。
（6）调节pH至，用pH试纸进行测定，用1molHcl或1Mol NaoH调节。
（7）分装:30～40 ml/瓶6，培养基勿碰三角瓶口。
（8）用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。
（三）灭菌：用高压蒸汽消毒器灭菌，其压力为～,温度为120～126℃，保持15~20 min。
具体操作步骤：1. 加水；2. 把包扎好的培养基装入高压锅；3. 盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀；4. 加热；5. 排除冷空气；6. 排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到1Kg位置时，开始计算灭菌时间，一般在1Kg 压力(121℃)下灭菌15~20 分钟即可，但要注意保持稳定压力。
7. 灭菌时间达到20 分钟后，停止加热，待压力自动降到0磅时，打开放气阀，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出。
四.作业1. 总结配制培养基的注意事项。
2. 制作培养基前为何要提前配制母液实验二短柄五加无性系建立一．目的和要求：1.学习并掌握外植体的消毒方法及具体操作;2. 掌握无菌操作技术。
实验一 MS培养基的配制和灭菌
（七）倒出、沥去最后一次清洗用水，开始进行植 物材料的切割及接种。
逐一取出经上述灭菌处理的植物材料，置于 下面垫有经灭菌处理的培养皿（或小白瓷碟）的无 菌纱布或滤纸上，左手拿小镊子，右手拿解剖刀， 切除各切段或切块上被灭菌剂毒坏的部分。如有必 要，也可再行切分。在完成切割后，将解剖刀和小 镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭 菌之后放回原处，以便待冷却后下一切割再用。
4
一、实验目的： 熟悉外植体材料的预处理，掌
握其消毒和接种方法。
二、方法步骤： 预处理 →酒精消毒→消毒剂消毒
5
（一）对采来的植物材料进行适当的预处理。除去 不需要的部分，将所需部分切割至适当大小，置自 来水龙头下流水冲洗几分钟至几小时，主要视植物 材料清洁程度而定。这在污染严重时特别有用。
（二）用洗衣粉水（1~2角匙洗衣粉/100 ml水）等 浸洗上述植物材料约5 min，再用自来水冲净洗衣粉 水。这是进一步减少污染的处理。
10
（八）接着，左手拿培养瓶，将培养容器口外壁在 靠近酒精灯外焰处转燎数秒，以将其可能带有的微 生物等固定于原处；在酒精灯焰附近处，用右手拇 指与食指配合将瓶塞打开，并将其夹于左手无名指 与最小指之间；再将培养瓶口在酒精灯焰上轻转灼 烧灭菌；以右手拇指与食指配合，用大镊子夹紧一 外植体准确送入培养容器，并将其轻轻地半插入固 体培养基；将大镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒 精灯焰上灼烧灭菌之后放回原处，以便待冷却后下 一操作再用；将培养瓶口及瓶塞分别在酒精灯焰上 小心地轻转灼燎数秒；盖好瓶塞，旋紧，将其置于 超净工作台的适当位置。
混合：分别加入一定量的贮备液I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和 生长调节物质及其它特殊补加物，再加蒸馏水直至 需配培养基的终体积。
调pH值：充分混合后，0.1mol/L的NaOH调节培养 基的pH值至5.8。
培养基的配制与灭菌的实验原理
培养基的配制与灭菌的实验原理1. 培养基的配制1.1 配制的基本概念好啦，各位小伙伴，今天我们要聊聊培养基的配制，听上去是不是有点小复杂，但别急，让我们一起来简单搞懂这玩意儿。
培养基呢，就是我们用来培养微生物的“餐桌”，给它们提供一切所需的营养，好让它们在实验室里像“锅里煮的饺子”一样，茁壮成长。
要想培养基配制得恰到好处，就得搞清楚它的成分，这些成分一般包括碳源、氮源、矿物质、维生素等等，基本上就是“食材”的大合集。
我们会根据不同的微生物选择不同的“食谱”，这样才能让它们在我们的“餐桌”上大快朵颐。
比如，细菌特别喜欢在“营养琼脂”这个大餐上打滚，而真菌则偏爱“马铃薯葡萄糖培养基”，就像你喜欢披萨，他喜欢汉堡一样。
1.2 配制步骤说到配制过程，可得细细说说。
这可不是随便往一盆里搅几下就完事儿的事儿。
首先，我们得准备好各种原料，按照规定的比例把它们混合在一起。
像是“调味料”，我们也得精确计算，比如要加多少克的氨基酸，多少克的糖类，精确得就像给蛋糕配方量糖一样。
混合好了之后，还得将它们溶解在水里，搅拌的时候可别急，慢慢搅拌，避免出现“结块”的情况。
然后，接下来就要将混合液加热，通常是用高温高压的方式来杀死液体中的所有微生物，这一步就像是在做“清汤”，得彻底干净。
2. 灭菌的必要性2.1 为什么要灭菌那么，为啥培养基在配制好后还得做一轮灭菌呢？这就好比是咱们在吃饭前，要把手洗干净一样。
灭菌的目的是为了杀死所有可能的细菌、真菌和其他微生物，确保它们不会在咱们的培养基里横行霸道，影响实验结果。
试想一下，如果咱们的培养基里还有其他微生物，那就像是餐桌上多了几个“讨厌的客人”，它们不仅抢走了微生物的“食物”，还可能把“餐厅”弄得一团糟。
灭菌的过程，就是通过高温、高压或化学药品，把所有可能的干扰因素一网打尽，确保微生物的培养环境是“干净整洁”的。
2.2 常用的灭菌方法谈到灭菌，常用的方法有几种。
最常见的就是高压蒸汽灭菌，这种方法就像是给培养基做“深层清洁”，通过高温高压杀死所有微生物。
培养基的配制与灭菌实验报告
培养基的配制与灭菌实验报告实验名称：培养基的配制与灭菌实验
实验目的：了解培养基的配制方法和灭菌技术，掌握实验操作
技能，培养实验室操作能力。
实验原理：
1. 培养基配制
培养基的配制是在一定比例下将各种营养成分混合组成的，包
括碳水化合物、胺基酸、氮源、矿物质等，以提供生长和繁殖细
菌所需的条件。
2. 灭菌
细菌培养需要具备无菌环境，因此必须对培养基进行灭菌处理。
实验中常用的灭菌方法包括高压蒸汽灭菌和紫外线灭菌。
实验器材和试剂：
1. 水浴锅
2. 培养瓶和试管
3. 称量硬度高的玻璃容器
4. 试剂：琼脂、提取物、蔗糖、酵母提取物、胆汁、NaCl，
实验步骤：
1. 培养基配制
按照比例将各种营养成分混合，加入含有一定含量的蔗糖和酵母提取物的琼脂，再加入一定量的胆汁和NaCl，配制成固体培养基。
将琼脂和提取物等放入庞大的试管中；配合无水熔点管等研磨出来的溶液进行试管的分离悬胶操作，所得的琼脂可以冷藏保存。
2. 灭菌
将培养基装入培养瓶中，放入水浴锅中加热，使水温达到100℃左右，进行高压蒸汽灭菌。
灭菌后将培养基放置在无菌环境中，
待其温度降至40℃左右，即可使用。
实验结果和分析：
实验结果表明，配制的培养基已可以暂存和使用，经过高温蒸
汽灭菌可以达到无菌效果。
实验结论：
本实验灭菌技术和培养基配制方法是现代微生物学实验检测的
基础，熟练掌握这些操作技能可以提高实验室操作能力，为实验
的顺利开展提供有力保障。
培养基的配制与灭菌技术
培养基的配制与灭菌技术⼀、培养基的配制与灭菌技术培养基是将微⽣物⽣长繁殖所需要的各种营养物质，⽤⼈⼯的⽅法配制⽽成的⽤于培养微⽣物的营养基质。
培养基种类很多，不同的微⽣物所需培养基不同。
就培养基中营养物质的来源可分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。
按培养基特殊⽤途可分加富培养基，选择培养基、鉴别培养基。
按培养基制成后的物理状态可分为固体培养基，液体培养基和半固体培养基。
固体培养基是在液体培养基中加⼊1.5 %-2.0 %琼脂作凝固剂; 半固体培养基则加⼊0.5 %-0.8 %的琼脂。
⼀般培养基除含有⼤量⽔分外, 还含有碳素、氮素、⽆机盐类和维⽣素等。
此外, 由于徽⽣物⽣长繁殖必须在最适的酸碱度范围内, 才能表现出最⼤的⽣命活⼒, 因此应根据不同种类的徽⽣物. 将培养基调节到⼀定的pH值范围。
培养基配制后还必须进⾏灭菌, 灭菌是指杀死或消灭所有微⽣物, 包括营养体、孢⼦和芽孢。
灭菌的⽅法很多，可分为物理⽅法与化学⽅法两⼤类。
物理⽅法包括湿热灭菌、⼲热灭菌、紫外线灭菌、过滤除菌等; 化学⽅法主要是利⽤化学药品对接种室空间、⽤具和其它物体表⾯进⾏灭菌与消毒。
消毒⼀般是指消灭有害微⽣物的营养体和病原菌。
(⼀) 培养基的配制⽅法⼀般培养基的配制⽅法如下 (各种天然培养基的配制⽅法略有不同)：l. 按照配⽅的组分及⽤量先分别称量并配成液体；2. 根据要求调到⼀定的酸碱度(pH值)；3. 若要制成固体则加⼊2%琼脂并加热融化；4. 根据需要的数量分装⼊试管或三⾓瓶中, 加上棉塞或盖上纱布；5. 包扎好灭菌后备⽤。
配制斜⾯培养基的⼀般操作步骤为：称量→溶解→调pH值→加琼脂→过滤→分装→加棉塞→包扎→灭菌→摆斜⾯→⽆菌检查。
(图9-7)(⼆) 培养基及常⽤器⽫的灭菌培养微⽣物常⽤的玻璃器具主要有试管、三⾓瓶、培养⽫、吸管等, 在使⽤前必须先进⾏灭菌, 使容器中不含任何杂菌；培养微⽣物⽤的营养基质(培养基), 在接⼊纯种前也必须先⾏灭菌, 使培养基呈⽆菌状态。
微生物实验一、培养基的配制与灭菌
培养基的配制与灭菌一、实验目的1. 了解一般培养基配制原理，掌握培养基常规配制程序。
2. 了解培养基配制过程各环节的要求和注意事项，掌握实验室各种灭菌技术及玻璃器皿的包装方法。
二、基本原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料，主要含有微生物生长繁殖所必需的碳源、氮源、无机盐、生长因子及水分，并要求具有适宜的pH值、合适的渗透压等。
由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料各有差异，但一般配制程序却大致相同。
三、实验材料1. 器皿及材料天平、称量纸、钥匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、橡胶塞、试管架、三角瓶、移液管、洗耳球、培养皿、玻璃棒、烧杯、剪刀、酒精灯、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、电炉、灭菌锅等。
2. 药品试剂蛋白胨、牛肉膏、NaCl、琼脂、水、1mol/LNaOH溶液、1mol/LHCl溶液。
四、实验流程称药品→溶解→调pH值→加琼脂融化（补水，固体培养基用）→过滤（可省略）→分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板→无菌检查。
五、操作步骤1. 称量药品根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。
蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
2. 溶解用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。
待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。
（如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。
）3. 调节pH用1mol/L NaOH或1mol/L HC1溶液调至所需pH。
注意pH值不要调过头，以免回调，否则会影响培养基内各离子浓度。
4. 溶化琼脂琼脂加入后，置电炉上一边搅拌一边加热，直至琼脂完全溶化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热)。
注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。
5. 过滤分装有时需用滤纸或纱布趁热过滤，以利于观察结果。
培养基的配制及灭菌
培养基的配制及灭菌一．实验目的1.三角瓶，培养皿，试剂瓶，试管，枪尖盒等仪器的清洗。
2.三角瓶棉塞的制作，三角瓶，吸管，培养皿，试剂瓶，试管，枪尖盒的包装与灭菌。
3.高温蒸汽灭菌原理的学习。
4.LB和MacConkey培养基的制作与灭菌。
二．实验原理1.高温灭菌的原理：由于培养基配置过程中并非是无菌操作，所以要通过立即灭菌来防止配制过程中混入的杂菌利用培养基中的营养物质进行繁殖从而破坏培养基的性能。
高压蒸汽灭菌是生物试验应用最广，效果最好的一种湿热灭菌法。
在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。
在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。
在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
注意：①使用高压蒸汽灭菌前一定要完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。
否则在同一压力下，锅内实际温度和理想温度就会有差距，不能达到最好灭菌效果。
②在使用灭菌锅前切勿忘记加水，水加至与三角搁架相平，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。
③使用完后要等到压力降为零再打开锅盖，否则会因为锅内外压力不平衡而导致棉塞蹦出造成污染，也容易伤害到操作者。
2.培养基的配置原理：微生物的生长依赖于可利用的营养物质和适宜的生长环境。
培养基是用于培养，转移，贮存微生物的固体，半固体或液体的营养物质。
培养基中含有微生物所需的全部营养物质，包括碳源、氮源、能源、无机盐、水分和生长因子。
适宜的pH对微生物的生长是必不可少的。
培养基的物理状态有三种：液体、半固体和固体。
这些培养基的主要区别是在固体和半固体培养基里面加了固化剂------琼脂。
当将琼脂加入溶液中时，在98℃能融化成有一定粘性的液体。
并在42℃凝固。
琼脂具有的特性有：不易被微生物降解；接近无色等。
对于固体培养基需要加入琼脂量约为 1.4%~1.6%，半固体培养基加入约0.6%~0.8%。
培养基在配制过程中容易受到污染，因此必须进行灭菌，同时不能将培养基中的营养物质破坏。
实验-培养基的制备和灭菌
原料称量 溶解 定容 调节pH （加琼脂熔化） （过滤澄清）
分装 塞棉塞、包装 灭菌
培养基的制备和灭菌
注意事项
1. 配制培养基前先算好需要量，杜绝浪费； 2. 原料称量中，快接近终点时，用左手轻轻拍打右手手
腕，将少量药品振落，以免过量； 3. 牛肉膏用玻璃棒称取； 4. 成分中如含有磷酸盐和钙盐应分开溶解，否则会产生
生胨培养基：（%）
➢ 牛肉膏 0.5
➢ 蛋白胨 1.0
➢ NaCl
0.5
➢ pH 7.2-7.4
每组：
肉汤蛋白胨培养基：100mL
肉汤固体斜面（琼脂 1.3%）—— 3支 1-4号
肉汤固体三角瓶（琼脂1.0%）——1瓶 80mL/250ml瓶
沙保固体三角瓶（琼脂1.8%）——1瓶
在同样的条件下，为什么湿热灭菌的效果 好于干热灭菌？
高压蒸汽灭菌后，为什么排气不能过猛？ 为什么须待降到零磅才能打开锅盖取出物 件？
为什么配制好的培养基须立即灭菌？
培养基的制备和灭菌
培养基配方与实验安排
沙保培养基：（%） ➢ 葡萄糖 4.0 ➢ 蛋白胨 1.0 ➢ pH 5.4-5.8（自然）
干热灭菌 火焰灼烧：适用于接种环等金属用具 热空气灭菌 ：160℃～170℃灭菌2h 射线灭菌：一般用于无菌室灭菌 湿热灭菌：高压蒸汽灭菌
培养基的制备和灭菌
实验步骤之灭菌
高压蒸汽灭菌 灭菌条件：一般温度为121℃（压力1kg/cm2 ）
下,维持15～30 min。 高压蒸汽灭菌原理是水的沸点随着压力的增加
培养基的制备和灭菌
高压蒸汽灭菌注意事项
1. 灭菌完毕后，用排气阀排气不能太猛， 否则，压力骤降，导致锅内液体剧烈沸 腾，打湿棉塞，容易造成染菌；
实验一培养基的配制与灭菌
实验一培养基的配制与灭菌一、目的学习并掌握培养基配制及灭菌的方法二、原理（一）培养基在植物组织培养过程中，外植体生长所必需的营养成分和生长因子，主要由培养基提供不同材料对培养基的要求不尽相同，适当地设计和选用培养基，对组织培养取得成功是至关重要的。
培养基通常包括下列成分（表1）表1培养基的组成成分及其作用配制培养基可以直接称量，但为了减少称量麻烦和提高称量的准确性，通常都按配方浓度的若干倍称量，配制成一系列的母液置于冰箱保存，用时按比例稀释。
一般要配下列母液：1、微量元素母液：除铁盐外的其它微量元素盐类的混合液，通常配成1000×2、有机化合物母液：通常配成100×3、铁盐母液：铁盐与其它无机物成分混合易沉淀，须单独配制。
浓度为1000×4、激素母液：各种激素单独配制成母液，浓度从0.1mg到1.0mg/ml不等。
5、10×大量元素母液：培养基除激素、糖、琼脂外，其他成分混合配成10倍液，分装后置于冰箱冷冻格保存。
用时取适量该母液，加入激素、糖、琼脂、水等配成常用培养基。
(二) 培养基的灭菌：培养必须保证绝对无菌，否则因其营养丰富，细菌、真菌极易滋生，而导致外植体死亡。
灭菌方法下列几种：1．高温高压灭菌法：将培养基放入高压锅内，在1210C、108KPa(1.1k g/cm2)的压力下持续约20分钟。
2、过滤除菌法：带菌的溶液通过孔径为0.22μm(或更小)的微孔过滤器装置后，杂菌阻隔留在滤膜上，而溶液进入无菌空瓶内，从而达到除菌的目的。
此法用于不能以高温高压灭菌的培养液或酶液的除菌。
3. 60Coγ射线法：用γ射线过量照射以灭菌。
可用于大量灭菌，但设备昂贵。
三、仪器设备及用具(一)仪器设备万分之一电子天平百分之一电子天平超净工作台高压锅酸度计磁力搅拌器及搅拌子不锈钢过滤器玻璃蒸馏水器家用冰箱(二)用具烧杯：100ml×1，500ml×1 ；量筒：100ml×1，250ml×1磨口试剂瓶：100ml×1，500ml×1；带盖试剂瓶：500ml×2三角瓶：100 ml×1，250 ml×1药匙、称量纸、牛皮纸、棉花塞、橡筋：若干(三)试剂1N HCL 02N KOH 蔗糖（分析纯）琼脂粉N6大量：KNO3 CaCl2·2H2O MgSO4·7H2O KH2P O4 (NH4)2SO4B5微量：KI H3BO3MnO4·H2O ZnSO4·7H2O Na2MoO4·2H2OCuSO4·5H2O CoCL2·6H2O Na2EDTA FeSO4·7H2OB5有机：盐酸硫胺素盐酸吡哆醇烟酸肌醇谷氨酰胺水解酪蛋白脯氨酸2、4－D 6-BA NAA五、实验步骤（一）配母液1、B5微量元素母液（1000×/100ml）：按配方的1000倍用万分之一天平依次称量，搅拌溶解(溶解一种后再加另一种)后定容。
培养基的配制和灭菌实验报告（共8篇）
培养基的配制和灭菌实验报告(共8篇) 培养基的制备与灭菌实验报告(详细)一、实验题目：培养基的制备与灭菌二、实验目的：1、明确培养基的配置原则，掌握配置方法。
2、了解灭菌的原理，学习掌握灭菌器的使用方法。
三、实验器材：1、药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、水、琼脂。
2、仪器：三角瓶、培养皿、试管、线绳、棉花、烧杯、报纸、移液管、试管架、铁针、量筒。
四、实验原理：1、培养基的制备包括一下几种成分：（1）水分：主要成分。
（2）N源：包括无机氮和有机氮。
（3）C源：主要是含碳有机物、碳氢化合物等。
（4）无机盐：如NaCl、KH2PO4等。
微量元素：Cu、K、Mg、S、P、Zn。
有些还需要添加“生长因子”，通常是维生素类、某些氨基酸或核酸等。
2、培养基配置的原则根据不同的培养对象及培养目的，选用不同的培养基，但有机物总量不得超过15%，盐类一般不超过1%。
培养基有以下分类：按成分：天然培养基、合成培养基、半合成培养基按状态：固体培养基、半固体培养基、液体培养基按用途：基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基培养基配好后应立即灭菌，防止营养物质中的微生物富集。
3、灭菌：用理化手段杀灭一切微生物的营养体，包括芽孢和孢子，在实验中应对所有仪器、操作场所、药品及培养基灭菌或消毒。
（1）高压蒸汽灭菌：将物品放入封闭的加压灭菌器，加热使灭菌锅套间的水沸腾产生蒸汽，将冷空气排尽，压力上升，使水沸点变高，导致菌体蛋白质变性，一般0.1MPa、121℃、15~30min 可以彻底灭菌，本次实验灭菌20min。
若是含糖培养基，110℃、30min。
（2）干热灭菌：微生物细胞内蛋白质因高温而凝固变性。
因高温，所以含水量小，不利于蛋白质受热变性，所以温度高，时间长。
（3）紫外灭菌：诱导胸腺嘧啶二聚体形成抑制DNA复制。
（4）过滤除菌：实验室中用微孔滤膜（孔径一般为0.22μm）。
除病菌需更小。
五、实验步骤：1、牛肉膏蛋白胨培养基的制备依次准确称取0.5g牛肉粉、1.0g蛋白胨、0.5gNaCl放入烧杯，加入100mL水，用玻璃棒搅匀溶解，移入三角瓶，并加入1.5g琼脂。
培养基的制备与灭菌
培养基的制备与灭菌
1. 培养基的制备
制备培养基需要先准备好各种化学试剂，并按照配方将其称量、混合。
通常情况下，培养基的配方会包括以下成分：碳源、氮源、矿物质、维生素等。
其中，碳源可以是葡萄糖、蔗糖等简单的单糖或复糖；氮源可以是氨基酸、蛋白胨等；矿物质可以是磷酸盐、镁盐、钙盐等；维生素可以是叶酸、核黄素等。
将配制好的各种化学试剂按照配方溶解在蒸馏水中，制得液体培养基。
根据不同的需求，还可以将液体培养基加入琼脂糖等凝胶剂制成固体培养基。
2. 培养基的灭菌
培养基的灭菌是为了保证培养基中不含有任何杂菌或细菌，避免其对微生物学实验结果产生影响。
常用的灭菌方法有以下几种：
(1) 煮沸法：将液体培养基放入自减压锅或常压锅内进行煮沸，时间一般为20-30分钟，可杀死绝大多数的细菌和孢子。
(2) 高压灭菌法：将液体培养基放入压力灭菌锅内，压力升至1.5kg/cm2，温度达到121℃，时间一般为15-20分钟。
(3) 紫外线灭菌法：将液体培养基放入紫外线灯下，辐照时间一般为30-60分钟，可以杀灭一部分的细菌和孢子。
(4) 过滤灭菌法：利用过滤膜过滤液体培养基，可杀灭微小的细菌和病毒。
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铁盐
有机物质 2,4-D
200倍液
100倍液 1.0 mg/ml
5 ml
10ml 1ml
——
5 ml
10ml ——
5 ml
10ml 1ml
NAA
KT 蔗糖
1.0 mg/ml
1.0 mg/ml 30 g
0.2ml
1.0ml 30 g
——
—— 30 g
0.1ml 30 g
琼脂
pH值
8g
5.8
8g
5.8
8g
五、作业要求：完成实验报告，回答下面的思考题 1、根据以下所给母液浓度、蔗糖和琼脂量，配制烟草愈伤组织诱 导和培养的培养基（MS1），按MS配方（Murashige and Skoog, 1962）计算各种母液吸取量或药品的直接称量量。 2、简述高压蒸气灭菌的步骤；培养基采用高压蒸气灭菌应注意哪 些事项？
药品名称
母液倍或母 液浓度 （mg/ml）
配制1 L培养基 配制0.25 L培养基所需母液量(ml) 所需母液量(ml) 或质量（g） 或直接称量量（g） MS 1 MS 2 MS 3
大量元素 微量元素 铁盐 有机物质 2,4-D NAA KT 蔗糖 琼脂 pH值
10倍液 100倍液 200倍液 100倍液 1.0 mg/ml 1.0 mg/ml 1.0 mg/ml 30 g 8g 5.8
5.8
——
5.8
1）在烧杯内放入一定量的蒸馏水，用量筒或移液枪按上述表 格内配方加入各种母液及激素。 2）加入蔗糖30g，待蔗糖溶解后（可搅拌）加水定容至1L。 3）调节PH值，用酸度计测量PH值至5.8，常用1mol/l的HCl或 NaOH调整。 4）在MS1和MS2中加入琼脂8g，加热溶解，溶解过程中不断 搅拌，加热时烧杯口上盖上锡箔纸，防止水分过度蒸发。 5）分装：将配好的培养基及时分装到小三角瓶中，防止凝固 ，每瓶约30ml-40ml（约覆盖瓶底），分装时不要沾壁口。 6）封口：用封口膜将将三角瓶封口。
四、实验内容 （一）MS培养基母液的配制 1、大量元素母液的配制（配1L） 无机盐中大量元素母液，按照培养基配方的用量，把各种 化合物扩大10倍，分别用50ml烧杯称量，用蒸馏水溶解，必要 时加热。溶解后，倒入1000ml容量瓶中，最后用蒸馏水定容。 在混合定容时，必须最后加入氯化钙，因为氯化钙与磷酸二氢 钾能形成难溶于水的沉淀。将配好的混合液倒入细口试剂瓶中 ，贴好标签。配制培养基时，每配1000ml培养基，取大量元素 母液100ml。
化合物名称
每升培养基用量
扩大10倍称量
备注
（mg/L）
NH4NO3 KNO3 KH2PO4 MgSO4●7H2O 1650 1900 170 370
（g/L）
16.5 19.0 1.7 3.7
每升培养基取母
液100ml
CaCl2●2H2O
440
4.4
2、微量元素母液的配制（配0.5 L） 无机盐中微量元素母液，按照培养基配方的用量，把各种 化合物扩大100倍，分别用50ml烧杯称量，用蒸馏水溶解，必 要时加热。溶解后，倒入500ml容量瓶中，最后用蒸馏水定容 。
扩大100倍称量
（mg/0.5L） 100
备注
Thiamine-HCl（VB1）
Pyridoxine-HCl(VB6) Nicotinic acid(烟酸) Inositol（肌醇）
0.4
0.5 0.5 100
20
25 25 5000 每升培养基
取母液10ml
5、植物生长调节剂（激素）母液的配制 配制生长素类，如2,4-D、萘乙酸、吲哚乙酸等，应先用少 量（1-2ml）的乙醇溶解，然后用蒸馏水定容；配制细胞分裂 素时，先用少量的1N HCl或1N NaOH溶解，然后用蒸馏水定 容。最终各种激素母液浓度应均为1mg/ml。
化合物名称 每升培养基用量
（mg/L） MnSO4●4H2O 22.3
扩大100倍称量
（mg/0.5L） 1115
备注
ZnSO4●7H2O
H3BO3 KI Na2MoO4●2H2O CuSO4●5H2O CoCl2●6H2O
8.6
6.2 0.83 0.25 0.025 0.025
430
310 41.5 12.5 1.25 1.25 每升培养基取母液 10ml
（g/0.5L）
3.725 2.785 每升培养基取母 液5ml
4、有机物母液的配制（配0.5 L） MS培养基中，有机物为甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫氨素 （V-B1）、盐酸吡哆素（V-B6），常常配成1000倍或100倍母 液。本实验将有机物配成100倍母液。
化合物名称 每升培养基用量
（mg/L） Glycine（甘氨酸） 2.0
注：MS基本培养基包括大量元素、微量元素、铁盐、有机物 质、蔗糖。
培养基配制：
药品名称 母液倍或母液浓度 配制1 L培养基所需母液量(ml)或直接 （mg/ml） MS 1 大量元素 微量元素 10倍液 100倍液 100ml 10ml 称量量（g） MS 2 100ml 10ml MS 3 100ml 10ml
3、铁盐母液的配制（配0.5 L） 目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物， 必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定， 不易发生沉淀。常常配成200倍母液，溶解时可加热。
化合ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ名称
每升培养基用量
扩大200倍称量
备注
（mg/L）
Na2EDTA FeSO4●7H2O 37.25 27.85
实验一
植物培养基的制备与灭菌
一、实验目的 1、学习和了解培养基母液的配制方法。 2、掌握培养基的配制方法。 3、学习和了解培养基、器皿和相关设备的灭菌方法。
二、主要实验用具和仪器设备 烧杯（1000ml、500ml、100ml、50ml）、量筒（2000ml 、1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml、25ml、10ml）、 容量瓶（1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml、25ml）、 试剂瓶（1000ml、500ml、200ml、100ml、50ml）、玻璃棒 、油性标记笔、移液枪（5ml、1ml、200µl、100µl）、对应的 枪头、培养基瓶（1000ml、500ml、200ml）等。 电子天平（感量为0.1mg、10mg）、pH计、灭菌锅、微 波炉、磁力搅拌器、电磁炉、超净工作台等。 三、实验药品 按培养基配方准备。1N NaOH、1N HCl。
2、配培养基时大量体积的溶液可以用量筒（选 择合适的量程），少量的用移液枪，用完后调 回最大量程；每取完一种母液必须换枪头，防 止交叉污染。 3、每10人1组，每组选择配1种培养基，每种 培养基配1L。 以上培养基pH值在灭菌前调至5.8。
（三）培养基的灭菌 培养基中含有大量的有机成分，特别是糖含量较高，是各种 微生物生长和繁殖的极好场所。而植物材料需要在无菌条件下培养 很长时间，如果培养基被微生物污染，便达不到培养的预期结果。 因此培养基的灭菌是植物组织培养中十分重要的环节。培养基灭菌 的方法有多种，本实验用的是高压蒸气灭菌法。 方法步骤：1.检查是否缺水，水面必须没过加热丝2.灭菌前打开放 气阀，不动安全阀3.放入培养基，对准螺丝并旋紧，接通电源4.排 尽冷空气后关闭放气阀，待压力达到0.1kpa时开始计时20min 5.到时间后关闭电源，自然冷却，待压力恢复到0附近时放气，松 开螺丝，取出培养基。 注意事项：1.排尽冷空气2.注意水面3.自然冷却到0kpa4.螺丝不要 旋的过紧5.放入的培养基体积合适
以上各种母液必须用蒸馏水配制，然后保存在冰箱（4℃） 中，一般可保存几个月，当发现沉淀或霉团时，则不能继续使 用。
（二）MS培养基的配制 1、培养基配方 MS1： MS基本培养基 + 2,4-D 1.0 mg/L+ KT 0.1 mg/L+琼脂8g/L （烟草愈伤组织诱导和培养） MS2： MS基本培养基 + NAA 0.2 mg/L+ KT 1.0 mg/L+琼脂8g/L （烟草苗的微繁殖） MS3： MS基本培养基+ 2,4-D 1.0 mg/L（烟草细胞悬浮培养）