分子实验总结

实验一、植物基因组DNA的提取

原理:用低温机械研磨和高浓度、SDS等破坏细胞壁及膜，使蛋白变性使DNA与蛋白分离，用一定浓度的溶液将DNA提取出来，用高浓度乙醇沉淀DNA，氯仿/异戊醇等去除杂质，RNase降解核酸，得到纯度较高的DNA样品。

注：①真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步，首先是机械法破细胞抽提；然后去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染；最后纯化出DNA，由于真核细胞基因组较大，在操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对DNA的剪切，从而获得相对完整的DNA。②十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。注意事项：

（1）叶片磨得越细越好。

（2）移液器的使用。

（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

1、所用耗材洗净后使用，防止DNA的交叉污染。

2、植物材料尽量选用幼嫩组织，材料保存要在-80℃下。

3、所用器皿-20℃预冷，材料剪下后立即放到液氮中。

4、研磨要充分，切勿干磨，保持材料的超低温状态。

5、加酒精沉淀时要迅速混匀，减少DNA与杂质的共沉淀。

6、氯仿/异戊醇应在通风橱内操作。

7、提取液的pH值要调准确。

思考题：

1、提取的DNA，用TE溶解不了怎么办？

（1）蛋白没有除干净：①在转移上清的时候不要吸的那么彻底，尽量不要把沉淀吸上来。

②多用苯酚除除蛋白，不溶解肯定是杂质是蛋白。

（2）DNA量很大，加的TE太少，完全溶解不了。

2、实验结果如何，是否达到了预期的效果，和传统的有机提取是否有优越性？根据材料的特点选用合适的提取方法。

①纯净的DNA为白色纤维状。

②若带有颜色，则是有少量色素分子附着，70%乙醇能洗去部分杂质。

③转移上清时，不要吸到中间层的杂质。

④加RNase将RNA降解，电泳时看不到RNA片段。

⑤纯度高的DNA在适量TE中较易溶解，否则杂质含量太高。

⑥完整性好的DNA电泳图上显示一条亮带，下部无拖尾现象

实验二、大肠杆菌质粒DNA的提取

原理：质粒(Plasmid) ：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。

①碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱

性条件下，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。

②碱性条件下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。

溶液I

作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase 作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

溶液II

作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。

SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为

R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase 去除RNA时）受到干扰。

溶液III

作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀，K＋可中和DNA。

NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）

作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA 分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）

注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。

无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀

TE缓冲液：溶解DNA

注意事项：用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！！！

1.提取过程中应尽量保持低温。

2. 由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐热的特性,使用时应先对该酶液进行热处理(80℃ 1小时),使DNA酶失活。