分子生物学综合实验报告

分子生物学综合试验报告

综合实验Ⅰ.Southern杂交

（质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、

地高辛标记的Southern杂交）

一.实验目的

1.学习Southern杂交的原理及操作方法。

2.学习碱裂解法提取质粒的原理。

3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。

4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。

二.实验原理

利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。

PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。

DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。

地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通

过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。

三．实验准备

1.实验材料：

含质粒的大肠杆菌DH5α，LB液体培养基， LB平板培养基

2.实验试剂：

Taq DNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2），dNTP，引物（P1、P2），溴乙啶 (EB) ，点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油，目的基因及载体， 2×ligation 缓冲液， T4 DNA连接酶， 0.1mol/L CaCl2，氨苄青霉素（100mg/mL）， TBE电泳缓冲液（5×）， DIG Random Labeling Mix （高效），Anti-DIG-AP Conjugate， BCIP/NBT Stock Solution，Blocking Reagent。20×SSC：0.3M 柠檬酸钠，3M NaCl，2×SSC：0.03M 柠檬酸钠，0.3M NaCl， 0.2M EDTA，变性液：0.5N NaOH，1.5M NaCl，中和度：0.5M Tris-HCl、pH7.4、3M NaCl，Standard buffer：5×SSC、0.1%(w/v) N-Lauroylsarcosine, 0.02% (w/v) SDS, 1% Blocking Reagent，Standard buffer+50% formamide，Anti-DIG-AP碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体，BCIP/NBT储备液，冲洗液：0. 1M Tris-HCl，0.15 M NaCl. pH=7.5，封闭液：1%Blocking Reagent/ 0.1M Tris-HCl，0.15M NaCl，显色缓冲液：0.1mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH=9.5， TE缓冲液：10mM Tris-HCl，

1mM EDTA，pH 8.0，2%，LB固体培养基（添加amp的终浓度为100μg/ml，添加arabinose为培养基的0.2%），溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，TE缓冲液，无水乙醇和70%乙醇。

3.实验仪器：

微量移液器，1.5ml离心管，DNA吸附柱，DNA收集管，台式离心机，电泳仪，凝胶成像系统，恒温水浴箱，PCR仪，培养皿，超净工作台，硝酸纤维素膜或尼龙膜。

四．试验方法

1.质粒的提取：

①培养细菌

将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上，37℃培养24小时，然后从

平板上挑取单菌落，接种于5ml液体培养基中，37℃培养12小时。

②提取步骤

●取1.5 mL 过夜培养的菌液，加入离心管中，6000rpm离心1min，尽量吸除上清，重复两次

●向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL 溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

●向离心管中加入250μL 溶液P2，温和翻转多次使菌体充分裂解。

●向离心管中加入350μL 溶液P3，温和翻转多次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min。

●将上一步收集的上清液转移到吸附柱CP3 中，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心1Min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中。

●向吸附柱CP3 中加入600μL 漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中。

●重复操作步骤6。

●将吸附柱CP3 放入收集管中，12,000rpm离心2min。

●将吸附柱CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μL 洗脱缓冲液EB，室温放置2 min，12,000rpm离心1min 将质粒溶液收集到离心管中。

③琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA

2.聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA：

DNA