细胞免疫组化常用试剂配制
免疫组化实验步骤
免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0, 加水1000ml。
5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
理化实验配制方案
理化实验配制方案在进行理化实验时，不同的实验要求使用不同的试剂和药品，并且需要按照一定的比例和配制方法进行混合。
在进行实验前，正确的配制方案对于实验结果的准确性和可重现性非常重要。
本文将针对常见的理化实验，介绍一些常用的试剂配制方案。
pH缓冲溶液Phosphate Buffered Saline (PBS) 缓冲液PBS缓冲液是一种理化实验中常用的缓冲液，可以用于细胞培养、免疫组化等实验。
其配制方法如下：•向1L去离子水中加入8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4。
调节pH值至7.4。
•用0.22μm的无菌滤膜过滤，分装到无菌的50mL离心管中。
•灭菌，储存在4℃。
Tris-HCl缓冲液Tris-HCl缓冲液广泛用于生化实验和分子生物学实验中，其配制方法如下：•向800mL去离子水中加入Tris 11.1g, 调节pH值至所需值。
•加入到1L容量瓶中，用去离子水调至1L。
酶解液RIPA缓冲液RIPA缓冲液是广泛用于蛋白提取和酶解实验的缓冲液，其配制方法如下：•向1L去离子水中加入150mM NaCl、1% NP-40、0.5% sodium deoxycholate、0.1% SDS、50mM Tris-Cl pH 8.0、1mM EDTA。
•加入到1L容量瓶中，用去离子水调至1L。
Tris-HCl酶解液Tris-HCl酶解液是生化实验和分子生物学实验中常用的酶解液，其配制方法如下：•向1L去离子水中加入10mM Tris-HCl(pH8.2)、1mM EDTA、1% Triton X-100、0.1% SDS、50μg/ml Proteinase K。
•加入到1L容量瓶中，用去离子水调至1L。
其他试剂甲醛PBS固定液甲醛PBS固定液是常用的细胞固定液，可用于细胞培养、免疫组化等实验。
其配制方法如下：•向10ml PBS中加入1 ml 37%甲醛。
细胞免疫组化步骤
细胞免疫组化步骤（SABC法）实验准备：实验用品：移液枪、枪头、EP管、湿盒需要灭菌的东西：培养皿（可以是重复用的）、细胞爬片（多聚赖氨酸处理，并经过环氧乙烷消毒）、常规细胞培养物品。
试剂：细胞消化液、完全培养基、4%多聚赖氨酸、0.01M PBS（ph7.2-7.4）、3%H2O2（现配）、0.5%Txiton X-100、浓缩型SABC试剂盒（血清封闭液、二抗、三抗《SABC》）、苏木素、ddH2O、DAB显色试剂盒操作步骤：一、细胞爬片的制作1、细胞用消化液消化后，用完全培养基重悬（4-5ml）或者密度为1-5x106/ml2、在灭菌的培养皿中铺上3块细胞爬片（圆片），圆片间不要重叠3、取细胞悬液分别滴到圆片上，注意不要滴到圆片外，让细胞贴片30min左右4、30min后，在培养皿中补加完全培养液（轻微的加入，以免冲力将贴壁的细胞打下来），放于37°C，5%CO2培养箱中培养3h左右（让其贴壁更牢）。
二、组化前处理1、取出培养皿，用PBS漂洗2x2min（PBS可以不灭菌）2、4%多聚甲醛处理（室温）20min；3、PBS漂洗，3x2min；4、0.5%Txiton X-100 处理（室温）20min；5、PBS漂洗，3x2min；6、3%H2O2处理（室温）15min；7、PBS漂洗，3x2min；三、组化1、血清封闭：试剂盒中的血清封闭液，37°C，20min；2、取出甩干封闭液（不漂洗）；一抗（1：200）（PBS稀释），阴性对照用PBS代替一抗，37°C1-2h或4°C过夜；3、PBS漂洗，3x2min；4、二抗孵育：试剂盒中的生物素化...37°C，20min；5、PBS漂洗，3x2min；6、SABC孵育：湿盒内37°C，20min；7、PBS漂洗，3x4min；8、DAB显色：DAB试剂盒中的A、B、C三种试剂，我是按照500ul蒸馏水中各加4ul，混匀。
免疫组化(IHC)实验具体步骤及说明
免疫组化（IHC）实验具体步骤及说明一、试剂和溶液乙醇: 无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇抗原修复液: 0.01M 的柠檬酸钠缓冲液：58.82g 柠檬酸三钠及7.56g 柠檬酸溶于200ml 纯水，调pH 至6.0，纯水1:100 稀释为工作液3%过氧化氢-甲醇: 30%的过氧化氢与无水甲醇1:9 稀释10X PBS: 80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L 纯水，调pH 至7.4 洗涤液: 1×PBS：纯水稀释10× PBS；1× PBST：含0.05% Tween-20 的1×PBS（1×PBST）super block，生物素标记的UltraTek Anti-Polyvalent 二抗，酶标亲和素UltraTek HRP，DAB 显色试剂盒：Cat. KT1002a 抗体稀释液：3%BSA-PBS 0.5%盐酸-乙醇：0.5～1%盐酸，95.0-95.5%乙醇苏木素：苏木精2g 溶于250ml 无水乙醇，十六水合硫酸铝17.6g 溶与750ml 纯水，以上溶液充分混合，加入碘酸钠0.2g 和冰醋酸20ml二、实验步骤1.组织固定：烘箱温度65-75℃ 30min 或者65℃过夜；2.脱蜡：二甲苯浸泡三次，每次10 分钟；3.水化：依次经过无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇浸泡，每次5min；4.洗涤：自来水冲洗1 次，PBS 浸泡3min；5.抗原修复：放入稀释100 倍的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0) 中，高压锅煮沸10min，常温冷却30min；6.洗涤：纯水浸泡2 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；7.灭活酶：室温下3%过氧化氢-甲醇暗处处理切片15min；8.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；9.封闭：加入适当体积的super block（KT1002a Reagent A），37℃温箱孵育5min；10.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；11.一抗：加入反应体积为0.15ml，适合浓度的一抗, 37℃ 湿盒孵育60min。
免疫组化实验方法
免疫组化用户自备试剂：1．粘片剂APES 或POLY-L-LYSINE（博士德公司有售）。
2．免疫组化专用PBS（pH7.2-7.6）配法：1000ml 蒸馏水中加氯化钠8.5g, Na2HPO42.8g,NaH2PO4 0.4g。
如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。
3．0.01M 枸橼酸盐缓冲液：1000ml 蒸馏水中加枸橼酸三钠（C6H5Na3O7·2H2O）3g, 枸橼酸(C6H8O7·H2O ) 0.4g。
4．DAB显色试剂盒（博士德公司有售）。
A.石蜡切片热修复抗原染色程序:1. 载玻片防脱片剂处理:可选择APES 或Poly-Lysine。
捞片后置烤箱58-60 ℃30-60 分以使切片紧密粘附。
2. 切片常规脱蜡至水。
脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60 °C 恒温箱中烘烤20min。
然后按下列步骤进行：1) 组织切片置于二甲苯中浸泡3 次，每次10 min ；2) 无水乙醇中浸泡3 次，每次10 min ；3) 依次通过质量分数为95% 、70% 、50% 的梯度乙醇溶液，每次 10 min ；4) PBS 中浸泡10 min 。
3. 30%H2O2 1 份+蒸馏水10 份混合,室温5-10 分钟以灭活内源性酶。
蒸馏水（可用PBS）洗3 次。
4. 热修复抗原:将切片浸入0.01M 柠檬酸钠缓冲液（PH6.0）,电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10 分钟后，反复1-2 次。
冷却后PBS（pH7.2-7.6）洗涤1-2 次。
5. 滴加5%BSA 封闭液,室温20 分钟。
甩去多余液体, 不洗。
6. 滴加适当稀释的一抗（小鼠或兔IgG），37 ℃ 1 小时左右或20℃时2 小时左右。
也可4℃过夜。
PBS（pH7.2-7.6）洗2 分钟×3 次。
（一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。
一般来说，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2.水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7."2―7."4）：NaC137mmol/L，KCl2."7mmol/L ,Na2HPO44."3mmol/L, KH2PO41."4mmol/L.2．"0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6."0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0."4g。
3．0."5mol/L EDTA缓冲液（ph8."0）：700ml水中溶解186."1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph 8."0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8."0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH 8."0,加水1000ml。
5.酶消化液：a.0."1%胰蛋白酶:用0."1%CaCl 12(ph7."8)配制。
b.0."4%胃蛋白酶液：用0."1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7.风裱剂：a.甘油和0."5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9."0–9."5）等量混合b油和TBS(PBS)配制8．"TBS/PBS PH9."0–9."5,适用于荧光纤维镜标本;ph7."0-7."4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
细胞免疫组化(SABC法)
细胞免疫组化（SABC法）步步看：细胞冻存够了，且状态良好！咋们就开始做细胞免疫组化吧！开始做实验了，先看要准备些什么吧！实验准备：实验用品：移液枪：1ml、200ul、10ul枪头：1ml、200ul、10ul枪头盒：1ml、200ul、10ulEP管：1.5ml湿盒需要灭菌的东西：培养皿（可以是重复用的）、细胞爬片（多聚赖氨酸处理，并经过环氧乙烷消毒）、常规细胞培养物品。
试剂：细胞消化液、完全培养基、4%多聚赖氨酸、0.01M PBS（ph7.2-7.4）、3%H2O2（现配）、0.5%Txiton X-100、浓缩型SABC试剂盒（血清封闭液、二抗、三抗《SABC》）、苏木素、ddH2O、DAB显色试剂盒操作步骤：一、细胞爬片的制作1、细胞用消化液消化后，用完全培养基重悬（4-5ml）或者密度为1-5x106/ml2、在灭菌的培养皿中铺上3块细胞爬片（圆片），圆片间不要重叠3、取细胞悬液分别滴到圆片上，注意不要滴到圆片外，让细胞贴片30min左右4、30min后，在培养皿中补加完全培养液（轻微的加入，以免冲力将贴壁的细胞打下来），放于37°C，5%CO2培养箱中培养3h左右（让其贴壁更牢）。
二、组化前处理1、取出培养皿，用PBS漂洗2x2min（PBS可以不灭菌）2、4%多聚甲醛处理（室温）20min；3、PBS漂洗，3x2min；4、0.5%Txiton X-100处理（室温）20min；5、PBS漂洗，3x2min；6、3%H2O2处理（室温）15min；7、PBS漂洗，3x2min；三、组化1、血清封闭：试剂盒中的血清封闭液，37°C，20min；2、取出甩干封闭液（不漂洗）；一抗（1：200）（PBS稀释），阴性对照用PBS代替一抗，37°C1-2h或4°C过夜；3、PBS漂洗，3x2min；4、二抗孵育：试剂盒中的生物素化...37°C，20min；5、PBS漂洗，3x2min；6、SABC孵育：湿盒内37°C，20min；7、PBS漂洗，3x4min；8、DAB显色：DAB试剂盒中的A、B、C三种试剂，我是按照500ul蒸馏水中各加4ul，混匀。
细胞培养常用试剂的配制
细胞培养常用试剂的配制日期：2012-04-13来源：未知作者：网友点击：239次相关专题∙细胞培养基的配制∙细胞培养专题∙万能缓冲液PBS器材与试剂干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等具体步骤1、水：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。
需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.2、PBS (也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗溶解定容：将药品(NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4%26middot;H2O 1.56g，KH2PO40. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。
用HCl或NaOH调PH到7.4。
移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。
注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
3、胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。
不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。
胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。
使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。
因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。
终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25%，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。
搅拌混匀，置于4℃内过夜。
用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。
免疫组化完整方法归总
免疫组化染色(免疫组织化学染色)一、染色前需要配制的溶液：○1柠檬酸盐缓冲液（抗原修复液）：✈储存液：A：4.2g柠檬酸C6H8O7·H2O用蒸馏水定容至200mlB：7.35g柠檬酸钠Na3C6H5NO3O7·2H2O用蒸馏水定容至250ml✈工作液：9mlA液+41mlB液+450mlDW=500ml。
（ph值应为6.0+0.1）○2Tris—Hcl (PH应为7.2)✈储存液：A：Tris液：Tris 4.85g 用蒸馏水定容至200mlB：Hcl ：体积分数35%Hcl1ml+99ml蒸馏水✈工作液：25mlA + 45 mlB + 30 ml蒸馏水（PH应为7.2 ）*○30.05%DAB：0.005g DAB + 10 ml Tris—Hcl （也即：0.005g DAB+ 2.5ml（Tris—Hcl）A液+4.5ml（Tris—Hcl）B+3ml蒸馏水）（应于-200C避光保存或避光现配现用，最好现配现用，否则可能在空气中因氧化而由无色变为棕色）*○4显色剂：0.05%DAB与H2O2（0.3%），即5ml 0.05%DAB中加一滴3%H2O2（0.05ml）{此步骤稍提前准备，现配现用}○5磷酸盐缓冲液配制（在此需用0.01 mol/l磷酸盐缓冲液）✈储存液：A液：磷酸二氢钠溶液 6.24gNaH2PO4·2H2O溶于蒸馏水并稀释至200mlB液：磷酸氢二钠溶液17.9gNa2HPO4·12H2O溶于蒸馏水并稀释至250ml✈工作液：9.5 ml A + 40.5 ml B + 8.5gNaCl 以蒸馏水定容至1000ml （工作液用时370C预热）○6HCl-乙醇：1ml体积分数为36%的盐酸与99ml70%纯乙醇混合○73%双氧水：购买的双氧水基本上为此浓度（若需配制，最好现用现配，40C避光保存）○8适当比例一抗（山羊血清）配制✈一抗可分别稀释为50倍（即1份抗体<20ul>与49份PBS<980ul>混合）、100倍（即1份抗体<10ul>与99份PBS<990ul>混合）、200倍（即1份抗体<5ul>与199份PBS<995ul>混合）。
免疫组化详细配方及步骤
免疫组化液体配制
1.封闭液（0.3％H2O2溶液）：
2. 洗涤液（0.1M磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2－7.4））现在洗液改用蒸馏水
3.柠檬酸抗原修复液(pH6.0)
A液
免疫组化步骤
1．石蜡切片常规脱蜡至水。
2．切片浸入0.3％H2O2封闭液置于摇床封闭15分钟，蒸馏水摇洗3min×3遍；
3．抗原修复：
A：高压修复(有时易掉片)：加热修复液至沸腾后降功率至800瓦，将切片放入加盖,至喷气开始计时2分半后停止加热。
置空气或水浴中缓慢冷却40分钟，温度降至室温左右时开锅洗涤，蒸馏水摇洗3min×3遍；
B：酶抗原修复，切片蜡笔划圈，滴加酶消化液50-100ul。
37℃消化60分钟（掌握时间）后蒸馏水摇洗3min×3遍。
4．滴加稀释后的一抗50-100ul（依据组织大小计算），湿盒37℃1小时，或4度过夜。
5. 蒸馏水洗涤3min×3遍。
；
6. 滴加二抗复合物，每张切片50-100ul，室温60分钟。
7. 蒸馏水摇洗3min×3遍，等待显色；
8. DAB配制：B液和C液按50：1混合配制后，加到玻片组织上显色，显微镜下观察至阳性结果出现而背景尚未着色时及时中止显色，蒸馏水反复冲洗（勿直接冲洗组织，防止脱片）；
10．苏木素复染15min后冲洗，盐酸酒精分化至淡蓝色后冲洗，温水反蓝5min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
注意：操作中的任何一个步骤不应出现切片表面干燥的现象，否则容易出现阴阳脸或者假阴性。
免疫组化实验室用液配制方法
免疫组化实验室用液配制方法（比较全）一、缓冲液1. 0.01MPBS(PH7.2)液NaCl 8gNa2HPO4 1.15gKH2PO4 0.2g （NaH2PO4）加双蒸水至 1000ml2. 0.05MTBS(PH7.4)液Tris(三羟甲基胺基甲烷) 12.1gNacl 17.5g加双蒸水至 1500ml在搅拌下加浓HCL至PH7.4，再加双蒸水至2000ml。
3. 0.02MTBS（PH8.2）液Tris 4.84gNacl 17.5gBSA 2.0gNaN3 1.0g加双蒸水至 1500ml在搅拌下加浓HCL至PH8.2，再加双蒸水至2000ml。
（BSA—牛血清白蛋白；NaN3—叠氮钠，为防腐剂）。
4. 0.05MTB液（PH7.6）先配制0.05MTB液：Tris 60.75g1N HCL 约420ml双蒸水至1000ml配制方法：先以少量双蒸水（300ml）溶解Tris，加入HCL后，再用1N HCL或1N NaOH将PH值调至7.6，再加双蒸水至1000ml。
用时将0.5MTB稀释10倍，即为0.05MTB液（PH7.6）液。
5. 0.05M醋酸缓冲液（PH3.5）先配制0.1M的醋酸和醋酸钠溶液0.1M醋酸液：冰醋酸 5.75ml双蒸水加至1000ml0.1M醋酸钠液：醋酸钠 13.61g双蒸水 1000ml再配制0.1M醋酸缓冲液：混合即可0.1M醋酸 210ml0.1M醋酸钠 790ml用时将0.1M的醋酸缓冲液稀释5倍，即为0.05M醋酸缓冲液（PH5.2）。
6. 枸橼酸缓冲液（1）PH3.5枸橼酸 2.55g枸橼酸钠 2.35g双蒸水加至100ml（2）PH6.021.01g枸橼酸加入蒸馏水1000ml 0.1M枸橼酸29.41g枸橼酸钠加入蒸馏水1000ml 0.1M枸橼酸钠使用时取0.1M枸橼酸9ml和0.1M枸橼酸钠41ml，再加入蒸馏水450ml，即配成0.01M的枸橼酸缓冲液（PH6.0±0.1）。
免疫组化常用溶液的配制
免疫组化常用溶液的配制l、PBS磷酸盐缓冲液（PH7.4）配制：NaCL 8gKCL 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO40.24g将上述各种试剂溶于800ml水中，用HCL(1N)或NaOH(1N)将pH值调至7.4，加水至1000ml即可。
2. TBS:Tris缓冲液配方:(0.5M pH7.6)Tris(三羟甲基氨基甲烷) 12.1gNaCl 17.5g浓HCL 约7ml双蒸水加至2000mlTris缓冲液配制方法:先以少量双蒸水（300~500ml）溶解Tris，加入7mlHCL后，用HCl（IN）或NaOH（IN）将pH调至7.6，最后双蒸水加至2000ml。
此液为储备液，4℃冰箱中保存。
TBS配方:Tris-HCI缓冲液（0.5M pH7.6）100mnlNaCI 8.5~9g(0.l 5mol/)双蒸水加至1000mlTBS配制方法:先以少量双蒸水溶解NaCl，再加入Tris-HCl缓冲液，最后加双蒸水至1000ml，充分摇匀。
3. 枸椽酸盐缓冲液（Citrate buffer）:储存液:0.lM枸橡酸溶液:称取21.0lg柯橡酸（C6H8O7.H2O）溶于1000ml蒸馏水中。
0.lM枸橡酸钠溶液:称取29.41g枸橡酸钠C6H5Na3O7.2H2O)溶于1000ml蒸馏水中，工作液:取9ml A液和4Iml B液加入450ml蒸馏水中，溶液pH 值应为6.0±0.14. 胰酶（TrypsIn）:胰蛋白酶消化液:取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml0.05%或0.1% PH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可。
5.胃酶（Pepsin）——0.4％胃蛋白酶：胃蛋白酶400mg溶于100ml的0.1N HCL中即可。
6. DAB(3，3-二氨基联苯胺):6mg DAB溶于l0ml 0.05mol/L TBS（0.05M pH7.6）,再加入0.1ml浓度为3%的H2O2，过滤掉沉淀物，即可。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris 碱，用1N的HCl调至pH8.0, 加水1000ml。
5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
免疫组化的基本步骤
免疫组化步骤1.4%多聚甲醛常规灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中过夜。
蜡块制作。
切片，贴片。
0.01MKPBS清洗5min×3后；2.加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01MKPBS 100ml＋30%过氧化氢）30min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS清洗5min×3；3.加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100＋0.01MKPBS 100ml）30min，以增加细胞的通透性，0.01MKPBS清洗5min×3；4.加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS 100ml＋叠氮纳0.08g）稀释的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗体，0.01MKPBS洗5min×3；5.加入0.01MKPBS稀释的二抗，室温孵育2h。
0.01MKPBS洗5min×3；6.加入ABC复合物之类的抗体，室温孵育2h，0.01MKPBS洗5min×3；蒸馏水迅速冲三次；7.加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min，可不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS终止反应；8.梯度酒精脱水之后，封片，拍照。
免疫组化主要步骤1.洗载玻片:将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中,目的是为了是载玻片上的硅胶等除去,同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整,便于组织吸附,然后置于清水中清洗,除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4(大约冲一个小时左右),再将载玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。
2.包埋组织:先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。
免疫组化（IHC）实验具体步骤及说明
免疫组化（IHC）实验具体步骤及说明免疫组化（IHC）实验具体步骤及说明一、试剂和溶液乙醇: 无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇抗原修复液: 0.01M 的柠檬酸钠缓冲液：58.82g 柠檬酸三钠及7.56g 柠檬酸溶于200ml 纯水，调pH 至6.0，纯水1:100 稀释为工作液3%过氧化氢-甲醇: 30%的过氧化氢与无水甲醇1:9 稀释10X PBS: 80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L 纯水，调pH 至7.4 洗涤液: 1×PBS：纯水稀释10× PBS；1× PBST：含0.05% Tween-20 的1×PBS（1×PBST）super block，生物素标记的UltraTek Anti-Polyvalent 二抗，酶标亲和素UltraTek HRP，DAB 显色试剂盒：Cat. KT1002a 抗体稀释液：3%BSA-PBS 0.5%盐酸-乙醇：0.5～1%盐酸，95.0-95.5%乙醇苏木素：苏木精2g 溶于250ml 无水乙醇，十六水合硫酸铝17.6g 溶与750ml 纯水，以上溶液充分混合，加入碘酸钠0.2g 和冰醋酸20ml二、实验步骤1.组织固定：烘箱温度65-75℃ 30min 或者65℃过夜；2.脱蜡：二甲苯浸泡三次，每次10 分钟；3.水化：依次经过无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇浸泡，每次5min；4.洗涤：自来水冲洗1 次，PBS 浸泡3min；5.抗原修复：放入稀释100 倍的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0) 中，高压锅煮沸10min，常温冷却30min；6.洗涤：纯水浸泡2 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；7.灭活酶：室温下3%过氧化氢-甲醇暗处处理切片15min；8.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；9.封闭：加入适当体积的super block（KT1002a Reagent A），37℃温箱孵育5min；10.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；11.一抗：加入反应体积为0.15ml，适合浓度的一抗, 37℃ 湿盒孵育60min。
免疫组化几种溶液的配制方法
❖1、PBS: ❖取ZLI-9061 PBS溶于1000ml的蒸馏水中，
混匀，测pH值应在7.2-7.4之间，若偏离此 范围，请用0.1N的HCL或NaOH调整。
❖2、TBS： ❖2.1 Tris缓冲液配方： ❖（0.5 M pH7.6）Tris（三羟甲基氨基
甲烷）60.57g1N HCL约420ml双蒸水加至
酶溶液和三滴试剂2胰酶稀释液均匀混合（1:3 稀释），则可直接滴加使用。胰酶的最终浓度 可以根据使用者的要求进行调整，浓度范围可 以从0.05%（1:10稀释）至0.25%（1:1稀释）。
❖4.2 ZLI-9010胰蛋白酶： ❖取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml 0.05%或
0.1% pH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可。
（用量为10ml/ml）
❖9、Blotto A： ❖常规使用1×PBS，5% milk，0.05%
Tween 20。
❖10、Blotto B： ❖与Phosphotyrosine抗体共用，1×PBS，
1% milk，0.05% Tween 20。部分实验中
milk可完全去除，但可能引起背景增高。
（C6H8O7·H20）溶于1000ml蒸馏水中。
❖B. 0.1M枸橼酸钠溶液：称取1g枸橼
酸钠（C6H5Na3O7·2H20）溶于1000ml蒸馏水 中。
❖3.2 工作液： ❖取9ml A液和41ml B液加入450ml蒸馏水中，
溶液pH值应为6.00.1
4、胰酶（Trypsin）：
❖4.1 ZLI-9011胰蛋白酶消化液： ❖常用浓度为0.125%，即使用前将一滴试剂1胰
5、胃酶（Pepsin）： ❖4%胃蛋白酶，用0.1mol/L HCL配制。
免疫组化实验步骤及配方
8.5%-10%血清封闭30min（0.01MPBST配制）；
9.一抗过夜，一抗用PBST稀释；
10.0.01MPBS洗10min×3次，二抗3孵育小时；
11.0.01MPBS洗10min×3次，HRP-亲和素3小时；
12.0.01MPBS洗10min×3次，DAB显色12-18min。
6.DAB液：以0..1MPB配制，DAB浓度0.05%，H2O2浓度0.03%。
注：1).H2O2临用时再加；
2).用DAB染后用0.01MPB洗。
7.30%蔗糖：150g蔗糖
500mL4%多聚甲醛
注：可同时沉糖后固定。
8.封闭液：10%山羊血清（做免疫荧光时另加0.1%BSA）。
免疫组化常用试剂配制
1.0.1MPB:14.5gNa2HPO4·12H2O
500mLH2O
1.5gNaH2PO4·2H2O
2.0.1MPBS:50.01MPBST:100mL0.01MPBS
10滴TritonX-100
4.INHCL:盐酸：水=1：10
5.4%多聚甲醛：13.6gKH2PO4
3.6gNaOH
40g多聚甲醛
1000mLH2O
注：1).需要60°C加热溶解，过滤使用；
2).多聚甲醛每次比需要多称10g，以弥补后面过滤的损失；
3).现将多聚甲醛溶于1000mL水中，然后一边加热搅拌一边缓慢加入多聚甲醛的助溶剂NaOH，待NaOH和多聚甲醛都完全溶解后再加入KH2PO4，溶后过滤备用。
免疫组化步骤
1.多聚甲醛灌流取材，多聚甲醛后固定，30%多聚糖溶液沉糖;
2.冰冻切片（1d-14d脊髓>=20μm;14d-28d>=10μm;DRGd=10μm）
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免疫细胞化学常用试剂
一、固定剂
大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。
但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。
某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。
因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。
目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。
在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。
1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）
试剂：多聚甲醛40g
0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml
配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。
该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。
另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠
试剂：A液：多聚甲醛40g
蒸馏水400ml
B液：Na2HPO4·2H2O16.88g
蒸馏水300ml
C液：NaOH 3.86g
蒸馏水200m
配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH 或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。
该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。
该固定剂较温和，适于组织的长期保存。
组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。
3．Bouin’s液及改良Bouin’s液
试剂：饱和苦味酸
40%甲醛250ml
冰醋酸50ml
配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。
冰醋酸最好在临用前加入。
改良Bouin’s液即不加冰醋酸。
该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。
但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。
此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。
4．Zamb oni’s(Stefanini’s)液
试剂：多聚甲醛20g
饱和苦味酸 150ml
Karasson-Schwlt’s PB至1000ml
配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt’s PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt’s磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。
该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。
我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。
固定时间为6～18h。
5．PLP液PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液
（Periodate-Lysine-paraform-alde－hyde fixative）
试剂：过碘酸钠
赖氨酸盐酸盐（或盐酸赖氨酸）：
多聚甲醛
蒸馏水
配制方法：
（1）贮存液A（0.1mol/L赖氨酸-0.5mol/l Na3PO4,pH7.4）：称取赖氨酸盐酸盐1.827g溶于50ml蒸馏水中，得0.2mol/L的赖氨酸盐酸盐溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，将pH调至7.4，补足0.1mol/L的PB至100ml，使赖氨酸浓度也为0.1mol/L,4℃冰箱保存，最好两周内使用。
此溶液的渗透浓度为300mOs mmol/L/kg。
（2）贮存液B（8%多聚甲醛溶液）：称8g多聚甲醛加入100ml蒸馏水中，配成8%多聚甲醛液（方法见前）。
过滤后4℃冰箱保存。
（3）临用前，以3份A液与1份B液混合，再加入结晶过碘酸钠（NaIO4），使NaIO4终浓度为2%。
由于AB两液混合，pH从约7.5降至6.2，故固定时不需再调pH值。
固定时间为6～18h。
该固定剂较适于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
其机制是借助于过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氨基与醛基结合，从而与糖形成交联。
由于组织抗原绝大多数都是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定剂有选择性地使糖类固定，这样既稳定了抗原，又不影响其在组织中的位置关系。
Mclean和Nakane等认为，最佳的混合是：含0.01mol/L的过碘酸盐、0.075mol/L的赖氨酸、2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸缓冲液。
6．Karnovsky’s液（pH7.3）
试剂：多聚甲醛30g
25%戊二醛80ml
0.1mol/L PB 至1000ml
配制方法：先将多聚甲醛溶于0.1mol/L PB中，再加入戊二醛，最后加
0.1mol/L的PB至1000ml，混匀。
该固定剂适于电镜免疫细胞化学，用该固定液在4℃短时固定，比在较低浓度的戊二醛中长时间固定能更好地保存组织的抗原性和细微结构。
固定时最好先灌注固定，接着浸泡固定10～30min，用缓冲液漂洗后即可树酯包埋或经蔗糖溶液后用于恒冷切片。