养细胞过程所用的试剂简介

1.pbs缓冲液
PBS是磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline）一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。

它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广；而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。

如有需要PBS还可以补加1 mmol/L CaCl2和0.5 mmol/L MgCl2，以提供双价阳离子。

注：PBS不是磷酸缓冲液（phosphate buffer solution，PB）
配制方法为：
称取磷酸二氢钾(KH2PO4)，磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，氯化钠(NaCl)，氯化钾(KCl)，吐温－20 ，加水。

PBS:Phosphate Buffered Saline
PBS 1L配方pH7.4：磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g，
磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，
氯化钠(NaCl)：8g，
氯化钾(KCl)0.2g，
加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L 保存方法
高温高压灭菌后置于4摄氏度冰箱保存待用。

PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 2mmol/L
PBS缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用，具体试剂一般也有不同的比例配方，在针对性上就有了更好的效果。

1x PBS缓冲液就是0.01M的PBS,可直接使用,2x PBS就是2倍浓度,使用时稀释一倍使用。

0.1M的PBS一般不用来配置缓冲液,用于其它用处。

作用
PBS是磷酸缓冲盐溶液的简称，不仅伪狂犬病毒要用它稀释，一般的有活性的生物制剂都要用它来稀释。

原因就是它具有盐平衡、可调整的适宜pH缓冲作用，蒸馏水不具有盐平衡作用，可以破坏生物蛋白的结构及生物特性；生理盐水不具有调整pH的作用，对完整的、具有活性的物质不能保证其在最适条件下参与生物反应，所以使用PBS是首选。

PBS也不是万能的，有的生物活性物质需要的条件比PBS还要高，就需要在平衡缓冲液中加入更多的成分，维持最佳的条件保证生物活性物质保持其最完整的特性
2.DMEM培养液
DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。

与MEM 比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低于4500mg/L）和低糖型(低于1000mg/L)。

高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等
DMEM是dulbecco's modified eagle medium的缩写，所以其特点主要包括以下：
（1）氨基酸含量为依格尔培养基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等；
（2）维生素含量为依格尔培养基的4倍；
（3）含有糖酵解途径中的重要物质——丙酮酸；
（4）含有微量的铁离子。

DMEM(A) 细胞培养基（粉末型）成份{不需要自己配}
序号化合物名称含量(mg/L)序号化合物名称含量(mg/L)
1 无水氯化钙 .2H
2 O 265.00 18 L-丝氨酸42.00
2 硝酸铁 .9H 2 O 0.10 19 L-苏氨酸95.00
3 氯化钾400.00 20 L-色氨酸16.00
4 无水硫酸镁97.67 21 L-酪氨酸72.00
5 氯化钠6400.00 22 L-缬氨酸94.00
6 无水磷酸二氢钠109.00 23 D-泛酸钙 4.00
7 丁二酸75.00 24 酒石酸胆碱7.20
8 丁二酸钠100.00 25 叶酸 4.00
9 L-盐酸精氨酸84.00 26 肌醇7.20
10 L-盐酸胱氨酸63.00 27 烟酰胺 4.00
11 甘氨酸30.00 28 核黄素0.40
12 L-盐酸组氨酸42.00 29 盐酸硫胺 4.00
13 L-异亮氨酸105.00 30 盐酸吡哆辛 4.00
14 L-亮氨酸105.00 31 葡萄糖1000.00
15 L-盐酸赖氨酸146.00 32 丙酮酸钠110.00
16 L-甲硫氨酸30.00 33 酚红9.30.00
17 L-苯丙氨酸66.00
该类培养基广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养;如A9、3T6、BALB/3T3、COS-1、COS-3、COS-7、L6、WEHI-3b等细胞系的培养。

3.胰蛋白酶
胰蛋白酶在细胞培养中的作用
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。

不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。

胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH 为8.0 、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。

使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。

因Ca2+ 、Mg2+ 和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+ 、Mg2+ 的BSS ，如：D-Hanks 液。

终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

4.MTT
MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在540 或720nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济。

此法中的MTT 浓度为5mg/ml。

因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保
存即可。

在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。

5.冷冻细胞中用的DMSO（二甲基亚砜）
在细胞冻存中的应用
二甲基亚砜是一种重要的渗透型细胞保护剂。

在深低温（零下200度）保存细胞时冻存过程中，为防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤，有必要使用含有DMSO冷冻保护剂。

DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。

深低温时二甲基亚砜的细胞毒性受到抑制。

复苏时动作要快，尽快洗掉二甲基亚砜，否则会造成对细胞严重的毒性。

二甲基亚砜（DMSO）是目前最好的细胞冻存保护剂，但也是一种以细胞毒性很大的化学试验剂。

研究结果表明，培养液中DMSO浓度为10%时，细胞生长抑制率近100%；1‰浓度时抑制率为35%，即使是0.04‰的浓度，DMSO对细胞的生长也有不利的影响。

另外注意
DMSO存在一定的毒性作用，用的时候要避免其挥发，要准备1%-5%的氨水备用，皮肤沾上之后要用大量的水洗以及稀氨水洗涤.
最为常见的为恶心、呕吐、皮疹及在皮肤、和呼出的气体中发出大蒜、洋葱、牡蛎味。

吸入：高挥发浓度可能导致头痛，晕眩和镇静。

皮肤：能够灼伤皮肤并使皮肤有刺痛感，如同所见的皮疹及水泡一样。

若二甲基亚砜与含水的皮肤接触会产生热反应。

要避免接触含有毒性原料或物质的二甲基亚砜溶液，因其毒性不为人所知，而二甲基亚砜却可能会渗入肌肤，在一定条件下会将有毒物质带入肌肤。

吸收：吸收危险性很低。