时间分辨荧光分析法 - 副本

1.2 稀有元素双功能螯合剂 稀土元素作为金属离子,很难直接与抗原抗体结合,因此 在标记时需要有一种双功能基团的螯合物,它们分子内或带 氨基和羧基或带有异硫氰酸基和羧酸基,一端与稀土离子连 接,一端与抗原或抗体的自由氨基(组氨酸、酪氨酸) 连接。
1.3 增强溶液
免疫反应后所形成的复合物,在弱碱性缓冲液中经紫外 光激发所产生的荧光信号甚弱,这主要是因为水是稀土离子 经紫外光激发所产生荧光的淬灭剂。所以要加入一种增强 液。增强液一般由β-二酮体、三辛基氧化磷(TOPO)、 TritonX-100、醋酸和邻苯二甲酸氢钾(pH2.0 ~3.2)组 成。
材料与仪器
• 材料 黄曲霉毒素B1 、 二乙烯三胺五乙酸（DTPA）、
偶联牛血清白蛋白的黄曲霉毒素B1（AFB1-BSA）、
牛血清白蛋白（BSA）、辣根过氧化酶（HRP）、 福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂、96 孔微孔板、 亲和层析纯化的羊抗兔IgG 、Sephadex-G50 、 Eu3+标记盒（1244-302）、PD-10 等
会发射出波长相同或比吸收波长更长和的光，这种现象称
为光致发光。最常见的光致发光现象是荧光和磷光。

2.物质分子吸收光子能量而被激发，然后从激发态的最 低振动能级返回到基态时所发射出的光称为荧光 (fluorescence)。

3.根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和物
质含量测定的方法称为荧光分析法(fluorometry)。
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5.时间分辨荧光分析法（Time resolved
fluoroisnmuno assay,TRFIA）
• 是近十年发展起来的非同位素免疫分析技术，是目前最灵 敏的微量分析技术,其灵敏度高达10-19g/ml，较放射免疫 分析（RIA）高出3个数量级。它用镧系元素标记抗原或 抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术 测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨， 可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏 度。
AFB1的作用机制及对人体的危害
AFB1 干扰信息RNA 和DNA 的合成，是在翻译水平上
干扰了蛋白质生物合成，影响细胞代谢，因而它与人类及
动物的许多疾病存在着联系。 AFB1引起人的中毒主要是损害肝脏，发生肝炎, 肝区疼 痛，黄疸，肝硬化, 肝坏死乃至死亡，还可有心脏扩大、 痉挛、昏迷、胃肠道大出血等异常表现。长期食用被AFB1 污染的食物被认为是导致肝癌、胃癌、肠癌等疾病的主要 原因，也能诱发肾癌、乳腺癌及卵巢癌等。
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三、时间分辨荧光源自文库析技术简介
• TRFIA的基础试剂包括示踪剂、稀有元素双功能螯合剂、 分析缓冲液、增强溶液。 • 基本技术包括包被技术、标记技术、反应模式。
1.基础试剂：
1.1示踪剂的选择 所使用的稀土元素主要位于元素周期表中的 ⅢB族,包 括钪(scandium,SC)、钇(yttrium , Y)和镧系元素。到 目前为止,只有铕(europium , Eu)、铽(terbium ,Tb)、 钐(samarium ,Sm)、钕 (neodymium ,Nd)、镝 (dysprosium ,Dy)等5种被用作TRFIA示踪剂,尤以 Eu3 +常用。 示踪剂的使用 一般用Eu2O3制备成EuCl3,再经纯化和 常温真空抽干,然后干燥保存。
五、时间分辨荧光分析法在真菌毒素检测方 面的应用
1.真菌霉素概述
真菌毒素是由产毒真菌( 主要为曲霉属、青霉属及镰孢 属) 在适宜的环境条件下产生的具有很强毒性的二级代谢 产物，它主要对食品、农作物及饲料等污染很严重。 当前，最主要的真菌毒素主要有: 黄曲霉毒素、赭曲霉 毒素、伏马菌素、T-2 毒素、展青霉素、玉米赤霉烯酮和 脱氧雪腐镰刀菌烯醇等。 .
时间分辨荧光分析法及其应用
目录
• 一、时间分辨荧光分析法的基本概念 • 二、时间分辨荧光分析法基本原理与优点 • 三、时间分辨荧光分析技术简介 • 四、时间分辨荧光分析法的应用 • 五、时间分辨荧光免疫分析技术在真菌毒素检测 方面的应用
• 六、展望
一、基本概念：

1.有些物质受到光的照射时，除吸收某种波长的光之外还
2.真菌毒素的测定方法 • 目前，真菌毒素的测定方法有 TLC 法、HPLC 法等， 这些方法都不同程度地存在着样品前处理过程复杂、毒性 大、所需时间长等缺点。由于其他荧光物质、色素、结构 类似物对检测产生干扰，必须通过液-液萃取进行净化处 理，操作烦琐，有机试剂用量大，提取效率低，环境污染 严重。
各国的标准
世界卫生组织推荐食品、饲料中AFB1的含量不能超过
15μg/kg，在婴儿食品中不能检出;欧盟国家的规定更加
的严格，规定了日常生活食用品中的 AFB1的含量不得超 过2μg/kg，总量不超过4μg/kg，最近已将部分食品中的 AFB1的含量限定在0.1μg/kg 以内。 我国对 AFB1的污染和控制也非常重视，在1982年颁布 了粮油和发酵食品中的AFB1允许量标准。规定大米、食用 油中AFB1的含量不超过10μg/kg，其他粮食、豆类及发 酵食品的含量不能超过5μg/kg。
2.在微生物方面的应用 由于TRFIA的方法灵敏度高,在1979年它的理论形成后, 研究重点放在试剂开发和利用上； 1982年研制出用于测定风疹病毒抗体TRFIA的试剂； 1986年开创快速诊断流感的TRFIA方法； 2002年有关于同时检测弓形体IgM和IgA抗体TRFIA方法. 3.分子生物学的应用 标记的链霉亲合素2生物素探针,则会使核酸杂交整个过 程变得快速、简单。目前,稀土元素标记探针技术已用于检 测HIV、检测前列腺特异性抗原( PSA)的mRNA、腺病毒 DNA、肺炎链球菌DNA和HLA227等位基因,获得了满意 的结果。
4.在激素方面的应用 用TRFIA检测人血清胰岛素含量;检测了hCG;血清中的 甲状腺激素;国外还用它检测动物的激素; TRFIA分析血清、EDTA抗凝血浆和柠檬酸钠抗凝血浆 激素含量差别,发现只有在分析促甲状腺激素(TSH)、胰岛 素 (Ins)、TT3、雌二醇 (E2)、Testo (睾酮) 和Prog(孕 酮) 时柠檬酸钠抗凝血浆与血清有差别。 现在TRFIA已经取代RIA、EIA等方法,检测项目涉及甲 状腺激素、性腺激素、下丘脑分泌的激素、胰岛素、胃泌 素等各个方面。
二、时间分辨荧光分析法基本原理与优点
1.原理
TRFIA 是用镧系金属离子作为示踪物标记蛋白质、
多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,与其螯合剂、 增强液(有一部分不需要) 在待反应体系(如:抗原抗体免疫反 应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应 细胞的杀伤反应等) 发生反应后,用时间分辨荧光仪测定最后 产物中的荧光强度,根据荧光强度和相对荧光强度比值,推测 反应体系中分析物的浓度,达到定量分析的目的。
2.基本技术：
2.1 包被技术 TRFIA包被技术,是保持其灵敏度重要因素,因此在包被 抗体之前,往往要对抗体进行纯化,以提高抗体的包被量和 均一性。国内外最早的使用的包被的缓冲体系为pH9.6的 碳酸盐缓冲液,90年代后改为柠檬酸缓冲液,pH为4.5 ,效 果明显优于碳酸盐缓冲系统。 2.2 标记技术 抗原或抗体标记时,铕离子首先要作为标记物标记到抗原 或抗体上。标记时不同蛋白质的反应性依赖于蛋白表面的 游离氨基酸数目和蛋白质特异等电点。一般来说,游离氨基 酸数目越大,蛋白质的特异等电点越高,蛋白质易与螯合剂 反应,从而产生较高的标记率,但其标记比率与免疫反应不 成正比关系。镧系离子Eu3 +可用来标记核酸探针。
• 仪器 紫外吸收测定仪DU-650 ，酶标测定仪3550-UV
全自动TRFIA 检测仪AutoDELFIA 1235
AFB1-TRFIA 检测方法的建立：
采用时间分辨荧光技术建立了高灵敏的黄曲霉毒素
B1( AFB1) 间接竞争免疫分析法( AFB1-TRFIA) 。以
AFB1-BSA 为免疫原免疫新西兰大白兔制备抗AFB1抗体； AFB1 与辣根过氧化酶的联结物（AFB1-HRP）包被96 孔
3.固相抗原制备 将AFB1-HRP 用50 mmol/LNa2CO3-NaHCO3 pH9.6 缓冲液稀释至0.5mg/L的包被液, 96 孔微孔板各孔加 100μL，4℃放置过夜。弃去包被液，冲洗三次，加150 μL 含2 g/L 明胶的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜。弃去 封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。 4.Eu3+-羊抗兔抗体的制备 取溶解于50mmol/L PBS pH7.0 的5g/L 羊抗兔抗体 1-2mL，经PD-10柱转换缓冲条件，收集蛋白峰，经紫外 吸收分析定量(1.46A280—0.74A260)，用洗脱液稀释羊抗 兔抗体至2g/L。取500-1000μL稀释后的抗体，加入含 0.2-0.4mg 的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四 乙酸的小瓶中反应。Sepharose CL-6B 柱层析之后， A280 监测收集蛋白峰。
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酶联免疫分析法（ELISA）灵敏、且快速、低成本，但 ELISA是一种定性或半定量的方法，当选择的不同单克隆 抗体，会造成结果存在一定的误差，所以这种定量，相对 不太准确。
TRFIA 具有排除其他荧光干扰，灵敏度高，一次可以测 多个样品的优势，将成为检测真菌毒素的主要方法.
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3.实例分析：黄曲霉毒素B1的时间分辨荧光免疫分析
2.3 反应模式 常用的有双位点夹心法和固相抗体竞争法。 2.3.1 双位点夹心分析法使用针对被测物上不同抗原决定簇 的两个单克隆抗体,一个用Eu3 +标记,另一个包被固相载体, 经过免疫反应形成免疫复合物后,再将Eu3 +从复合物上完 全解离下来,在Eu3 +的增强液中与另一种螯合剂结合,在协 同剂的作用下,形成一个Eu3 +包裹于其内部的微胶囊(胶态 分子团) 。它在激发光作用下能发射出很强的荧光信号,其 强弱与待测抗原(或抗体) 含量相关。该法用于测定蛋白质 类大分子化合物。 2.3.2 固相抗体竞争法是对一些小分子半抗原化合物,因分 子质量小,不能直接进行固相包被,如多肽、甲状腺激素类 和一些药物等,都必须经过化学耦联剂与载体蛋白质进行共 价键结合,然后可包被聚苯乙烯微量滴定条孔壁,制成固相 抗原.
四、时间分辨荧光分析法的应用
1.在免疫学的应用 1.1 测定细胞因子:细胞因子不仅仅参与免疫应答反应,而且
在肿瘤、炎症发生和发展过程中起重要作用。因此,准确测
定细胞因子含量,对于了解它们病理生理作用是十分重要的。 1.2 测定补体:补体成分在多种自身免疫性疾病中起作用,临 床上常检测补体C3来评价免疫系统的功能。
板为固相抗原，与游离AFB1 共同竞争有限的抗AFB1 抗
体；用稀土离子Eu3+标记的羊抗兔抗体进行示踪。
反应过程图
方法
1.抗AFB1 多克隆抗体的制备 先用弗氏完全佐剂1.2 mL 与1mg AFB1-BSA充分混 合，形成抗原乳化剂。在兔子背部多位点地进行皮下注射， 之后每隔1—2 周再用弗氏不完全佐剂与AFB1-BSA 充分 混匀后多次免疫。在免疫4次后，从兔子的耳缘静脉抽血， 分离血清，用免疫双扩散法进行抗体效价的鉴定。免疫6 次后，从兔子心脏采血，分离血清。 2.黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶（AFB1-HRP）的制备 AFB1 为小分子化合物，本身难以吸附到微孔板上，要 先与蛋白结合后才可以包被到微孔板上形成固相抗原， AFB1 无活泼基团，要先活化AFB1，合成黄曲霉毒素B1羧甲基肟（AFB1-0xime），引入羧基再偶联HRP。
时间分辨荧光免疫原理图
2.优点
• TRFIA 技术具有酶标记分析技术和同位素标记技术的 优点: 具有灵敏度高、特异性强、稳定性好，且测定范围 宽，试剂寿命长，操作简便和非放射性等特点： 镧系离子与螯合剂形成螯合物后，Stokes 位移能够达 到 200 nm 以上，很容易分辨激发光和发射光，从而激 发光干扰就可以排除。 镧系元素与通常的荧光物质相比较，镧系元素离子螯合 物荧光的衰变时间要长的多，为传统荧光的 103～106倍。 镧系离子与双功能螯合剂螯合后，可形成稳定的螯合物， 稳定性非常高，生产出的产品保质期可以长达 2 年。
黄曲霉毒素（Aflatoxins）是由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillusparasiticus）的某些 菌株产生的。黄曲霉毒素有四种类型：B1，B2，G1 和G2。 另外还从牛奶中分离出黄曲霉毒素的两种代谢产物M1、 M2。黄曲霉毒素常存在于花生、核桃等坚果中，在大豆、 稻谷、玉米、通心粉、调味品、牛奶、奶制品、食用油等 制品中也经常被发现。黄曲霉毒素被世界卫生组织 （WHO）的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物，是一种毒 性极强的剧毒物质，在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1 （AFB1）最为多见，其毒性和致癌性也最强，AFB1 的毒 性比氰化钾大10 倍，比砒霜大68 倍。