第23章病毒感染的实验诊断
微生物检验学之病毒感染的实验诊断
病毒感染的实验诊断第一节概述一、病毒的基本性状病毒是一类非细胞型微生物，个体极小，可通过细菌滤器，需用电子显微镜观察。
仅含一种核酸作为遗传物质，外被蛋白质衣壳或还有包膜。
病毒只能在活细胞内寄生，以复制的方式进行增殖。
在临床微生物感染中，近75%的传染病是由病毒引起的。
（一）形态结构1.大小和形状病毒体极其微小，测其大小的单位用纳米表示。
根据其大小大致分为：大型病毒（200～300nm）、中型病毒（80～160nm）和小型病毒（18～30nm）。
病毒的形态大致可分为：球形或近似球形、杆状、子弹状、砖形、蝌蚪状等。
2.基本结构是指病毒的核心和衣壳两部分。
病毒的核心充满一种类型的核酸，即DNA或RNA，构成病毒的基因组。
此外，核心还含有少数功能蛋白，主要是病毒早期复制所需的一些酶。
病毒的衣壳是包围在核酸外的一层蛋白质，由一定数量的壳粒聚合而成。
衣壳可保护核酸免受核酸酶及其他理化因素的破坏。
3.辅助结构病毒的包膜是病毒成熟后以出芽方式释放包围在核衣壳外的宿主细胞成分。
包膜嵌有病毒编码的糖蛋白，具有病毒的特异性。
无包膜的病毒衣壳上也有些突出物。
（二）病毒的增殖病毒必须依赖宿主细胞，以特殊的自我复制方式进行增殖。
病毒的复制周期一般可分为吸附、穿入、脱壳、生物合成、组装与成熟、释放6个阶段。
若病毒进入细胞后的环境不利于它的复制，不能组装或释放有感染性的病毒颗粒，称为顿挫感染。
由于病毒基因组不完整或基因位点改变而复制出不完整无感染性的病毒，称为缺损病毒。
当两种不同的病毒或两株性质不同的同种病毒，同时或先后感染同一细胞或机体时，可发生一种病毒抑制另一种病毒增殖的现象，称为病毒的干扰现象。
干扰现象是机体非特异性免疫的一部分，是抗病毒免疫的重要内容。
除干扰现象外，当一个细胞受到两种或两种以上的病毒感染时，还可出现双重感染、互补、加强、表型混合与病毒杂交等现象。
（三）病毒的遗传和变异病毒在增殖过程中常发生基因组碱基序列的置换、缺失或插入，引起基因突变。
病毒感染的实验诊断
（二）标本的运送和保存
标本采集后注意无菌、冷冻、保湿、 立即送检。 分离培养病毒的标本要尽快送到实 验室处理和接种。如不能及时送检，可 在4℃冷藏数小时，如需较长时间保存则 应置-70℃。放置在-20℃，病毒容易灭 活，冻存液中需加入甘油或二甲亚砜等 作保护，避免反复冻融使病毒灭活。
为了抑制细菌生长通常在病毒传送 培养基（VTM）中加入抗生素如青霉素 100U/l和链霉素100μg/ml，为了抑制真 菌 的 生 长 加 入 2.5μg/ml 二 性 霉 素 B 或 40μg/ml制霉菌素。
（3）细胞培养的种类和方法 根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的不 同可分为三类： 1． 原代和次代细胞培养 离体的新鲜组织或器官，机械处理 胰蛋白
洗涤 吹打
酶消化
1-3次
加入营养液
单个细胞悬液
分装在培养
细胞计数 、调整细胞浓度
生长
瓶内培养
形成单层细胞，称为原代细胞培养
胰酶消化 转种新的培养瓶 细胞，称为次代细胞培养 形成单层
（2）对鸡胚的敏感性 不同病毒对鸡胚不同接种途径 敏感性不同。 直接法：如观察绒毛尿囊膜是 否有病灶 间接法：尿囊液、羊水做血凝 抑制试验等
（3） 病毒在细胞培养中的表现
① 细胞代谢类型改变：细胞代谢产酸可 导致培养液pH指示剂呈黄色，病毒 增殖抑制了细胞代谢，使培养液不变 色或变红。但腺病毒不抑制细胞代谢， 反而促进糖酵解增加产酸。 ② 细胞形态学变化 由病毒增殖所引起的细胞变化称为 细胞病变效应(cytopathic effect CPE)。
3．常见标本的采集方法
（1） 血液：以无菌手续抽取抗凝血10ml， 抗凝剂可选用100u/ml肝素钠。为了血清 学检查的需要，应抽取另一管5ml血液， 不抗凝送检。 （2） 脑脊液：以无菌手续抽取脑脊液 1~2ml，置无菌试管内，在冰浴中立 即送检。4℃可存放72h。
病毒感染的实验诊断
（2） 组织培养的类型
A 器官培养：如气管、肠段。器官保存了原功
能，用于分离某些有器官特异性的病毒。
B 组织块培养：如肝组织块培养肝炎病毒。
C 细胞培养（单层细胞培养）：现广泛使用的
组织培养技术。 医学ppt
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（3）细胞培养的种类和方法
根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的不 同可分为三类：
1． 原代和次代细胞培养
离体的新鲜组织或器官，机械处理
胰蛋白
洗涤
吹打
酶消化
加入营养液
单个细胞悬液
1-3次
细胞计数 、调整细胞浓度
分装在培养
生长
瓶内培养 形成单层细胞，称为原代细胞培养
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胰酶消化 转种新的培养瓶
形成单层
细胞，称为次代细胞培养
2． 二倍体细胞株
原代细胞多次连续传代后仍保持二倍体染 色体特性（即含23对染色体），称之为二倍体 细胞。传代细胞寿命一般为40~50代，大多数 为成纤维细胞,如人胚肺细胞。广泛用于病毒分 离和疫苗制备。
病毒感染的实验诊断
张德纯 教授 临床微生物教研室
医学ppt
1
病毒（Virus）是结构最简单、体积 最小的微生物。病毒感染十分常见，约 70%~80%的传染病由病毒感染所引起。 迄今已证实500多种病毒对人有致病性， 其中不少病毒危害极大，如最近流行的 SARS病毒。因此尽快获得病毒的实验诊 断，对控制病毒的传播、疾病的诊断和 防治具有重要的意义。
加8~10ml运送液立即送检。
（5） 含漱液 可用无菌生理盐水，让患者含漱几
次取得，与运送液等量混合。
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（6） 喉拭子：用生理盐水湿润的拭子采 取咽喉部表面，置运送液中，注意
27.病毒感染的实验室诊断
一、概述1.病毒的核心和衣壳为基本结构，以复制的方式进行增殖，只含有DNA或RNA，是非细胞型微生物2.病毒大小用纳米表示3.噬菌体是能引起细菌裂解的病毒4.应在患者急性期或发病早期采集标本，如不能立即处理和接种，可在4℃保存数小时，长时间保存需存放于零下70℃。
在运输培养基中应加入抗生素5.分离培养为诊断病毒感染的金标准二、呼吸道病毒1.流行性感冒病毒为单链RNA，易发生变异，致病性强2.流行性感冒病毒根据M蛋白不同，将病毒分为甲、乙、丙型。
甲型流感病毒根据NA和HA抗原不同又分为若干亚型3.腺病毒核心为双股DNA，具有双层衣壳4.麻疹病毒预防应接种减毒活疫苗，被动免疫可接种丙种球蛋白5.呼吸道合胞病毒三、肠道病毒1.肠道病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，抵抗力较强，可在污水及粪便中生存数月，由粪口-途径传播2.引起手足口病主要是柯萨奇病毒3.常用鉴别分型方法：①中和试验②补体结合试验③血凝抑制试验4.脊髓灰质炎病毒可导致脊髓灰质炎（小儿麻痹），以幼年儿童最为常见，可分为五症状感染、顿挫型、无麻痹型和麻痹型。
5.轮状病毒为球形，双层衣壳，无包膜。
常引起婴幼儿秋冬季腹泻，6.新型肠道病毒68、69、70、71型四、急性胃肠炎病毒1.生物学性状：轮状病毒呈球形，电镜下观察呈车轮状，核心含双链RNA2.临床意义：轮状病毒是引起婴幼儿急性腹泻的主要病因。
分为A组和B组。
A组感染以温带地区的秋冬季为主。
B 组引起成人腹泻，无明显季节性五、逆转录病毒（一）人类免疫缺陷病毒1.HIV是获得性免疫缺陷综合征的病原体，病毒抵抗力较弱，56℃30min即可灭活2.①gag基因编码衣壳蛋白p24抗原②env基因编码包膜糖蛋白gp120和gp413.静脉吸毒、性生活混乱者易感4.初筛试验为①酶免法（EIA）②免疫荧光法（IFA）③凝集试验等确证试验为①免疫印迹试验（Westernblot）②放射免疫沉淀试验5.机体感染HIV后可产生多种抗体。
病毒感染的实验诊断PPT课件
功 能，用于分离某些有器官特异性的病毒。
B 组织块培养：如肝组织块培养肝炎病毒。
（3）细胞培养的种类和法
根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的 不同可分为三类：
1． 原代和次代细胞培养
离体的新鲜组织或器官，机械处理
胰
蛋白
洗 吹打
酶消化 单个细胞悬液
涤
加入营养液
1-3次
细胞计数 、调整细胞浓度
分
装在培养
生长
胰酶消化 形成单层
转种新的培养瓶
细胞，称为次代细胞培养
2． 二倍体细胞株
原代细胞多次连续传代后仍保持二倍 体染色体特性（即含23对染色体），称之为二 倍体细胞。传代细胞寿命一般为40~50代，大 多数为成纤维细胞,如人胚肺细胞。广泛用于 病毒分离和疫苗制备。
3．传代细胞系
来源于肿瘤细胞或细胞株传代过程的 变异细胞。细胞增殖特征和染色体均类似于肿 瘤细胞。不宜用于疫苗的制备，常用于病毒的 分离和鉴定。
（4）组织培养的特点
优点：A．来源广；B．不受机体免 疫因素影响，个体差异小，敏感范围广； C．易于观察病变；D．可用于病毒的分离、鉴 定、疫苗的制备；E．易管理，相对比较经济。
（4） 粪便标本 取2~4g粪便标本在无菌的容
器中，加8~10ml运送液立即送检。
（5） 含漱液 可用无菌生理盐水，让患者
含漱几次取得，与运送液等量混合。
（6） 喉拭子：用生理盐水湿润的拭子 采
中，注意
取咽喉部表面，置运送液
避免唾液污染。 （7）尿道拭子及尿液标本：尿道拭子伸
以获
入尿道4cm轻轻转动2~3次，
病毒分离培养
第23章病毒感染的实验诊断
第23章病毒感染的实验诊断第23章病毒感染的实验诊断一、教学大纲要求（1）标本的采集、处理与运送注意事项（2）病毒形态学检查方法（3）病毒的分离与鉴定程序及方法（4）病毒感染的快速诊断方法二、教材内容精要（一）标本的采集、处理与运送根据临床诊断及病期采集不同的标本，用于病毒学分离和鉴定的标本应在病程初期或急性期采集，要进行预处理才能用于接种和其他方法的检测。
病毒的抵抗力通常较弱，在室温下很快灭活，标本采集后应立即送到病毒实验室，暂时不能检查或分离培养时，应将标本放入冻存液并加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）以防止反复冻溶使病毒灭活，存放在-70℃低温冰箱内保存。
（二）病毒形态学检查1.光学显微镜仅用于大病毒颗粒（如痘类病毒）和病毒包涵体的检查。
2.电子显微镜检查法（1）电镜直接检查法某些病毒感染的早期，临床标本中就可出现病毒颗粒。
标本经粗提浓缩后用磷钨酸盐负染，电镜下直接观察，可发现病毒颗粒，获得诊断。
（2）免疫电镜检查法将病毒标本制成悬液，加入特异性抗体、混匀，使标本中的病毒颗粒凝集成团，再用电镜观察，可提高病毒的检测率。
本法比电镜直接检查法更特异，更敏感。
3.超过滤法用不同孔径的火棉胶滤膜过滤病毒悬液，将获得的滤液接种于组织细胞、实验动物或鸡胚，或用血凝试验来测定病毒是否通过滤膜，从而估计病毒的大小。
4.超速离心法根据病毒大小的不同，其沉降速度也不同。
可用超速离心法测得病毒的沉降系数（S），借以计算病毒的大小。
5.X线晶体衍射法根据X线衍射图谱，用数学方式处理来研究病毒结构亚单位和分子结构等。
但标本必须为结晶，可用于无包膜病毒的研究。
（三）病毒的分离与鉴定1.病毒分离培养实验室分离培养病毒的方法主要有三种：动物接种、鸡胚接种和组织培养。
根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的不同，可分为：原代和次代细胞培养，二倍体细胞培养，传代细胞培养。
2.病毒在培养细胞中增殖的指标（1）细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。
病毒感染的实验室诊断(4)
病毒感染的实验室诊断（4）四、特异性抗体的检测特异性抗体的检测病毒感染后通常诱发针对病毒一种或多种抗原免疫应答，特异性抗体效价升高或lgM抗体出现有辅助临床诊断的价值。
(一)补体结合试验(CF) CF分二个阶段：1.抗原与抗体(一个为已知，一个为待检)混合，加入定量补体，若抗原与抗体相对应，则补体被消耗；2.在上述混合物中加入溶血素致敏的绵羊红细胞，若补本已与抗原抗体复合物完全结合，没有剩补体存在，那么绵羊红细胞不会溶血，结果为阳性，说明待检标本中有特异性存在，出现阳性结果时血清标本最高稀释度为抗体的效价。
反之为阴性结果。
由于补体结合抗体产生早，消失快，适于诊断病毒近期感染。
(表80-5)。
)。
取血时期血清稀释倍数及试验结果抗体效价1：21：41：81：161：321：641：128发病2～3内血清+++----1：8发病2～3周后血清+++++--1：32**此例的抗体效价升高4倍，有诊断意义。
(二)中和试验(NT) 在活体或活细胞内测定病毒被特异性抗体中和、而失去致病力的试验。
试验时：①须先测出病毒的半数致死量(LD50)或半数感染量(ID50)；②随即取活病毒与被试血清按不同比例混合，放置1～2小时让其充分中和；③将病毒与血清混合液注入各组动物、鸡胚或组织细胞培养管内培养；④根据动物、鸡胚死亡数或细胞病变的管数，计算出百分比(%)，然后再计算这些试验对象中的半数免于死亡或免于致病所需要的最少量血清(或最大量的病毒)，就是该血清的中和抗体效价(称为50%终点的中和效价)。
诊断病毒性疾病时，须取病人双份血清同时做对比试验，病后血清的中和抗体效价也必须超过病初血清4倍以上，才能确诊(表23-6)。
用此法鉴定病毒时，须将病毒分别与免疫血清及血清正常血清(对照)混合做对比试验，免疫血清比正常血清多中和50～100倍剂量的病毒，才能断定是该病毒。
、表80-6 病人双份血清的病毒中和试验结果(组织细胞培养的中和试验)试验病毒(用100个TCLD50)①病人血清(取血时期)活病毒+稀释血清对细胞致病②50%终点血清中和抗体效价③ (血清稀释倍数) 1：51：101：201：401：801：160甲病毒病初(2日)000000++++++++++++++++++10(1：10)病后(20日)000000000000000000++++++80(1：80说明：①TCID50=组织培养半数感染剂量。
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第23章病毒感染的实验诊断
一、教学大纲要求
（1）标本的采集、处理与运送注意事项
（2）病毒形态学检查方法
（3）病毒的分离与鉴定程序及方法
（4）病毒感染的快速诊断方法
二、教材内容精要
（一）标本的采集、处理与运送
根据临床诊断及病期采集不同的标本，用于病毒学分离和鉴定的标本应在病程初期或急性期采集，要进行预处理才能用于接种和其他方法的检测。
病毒的抵抗力通常较弱，在室温下很快灭活，标本采集后应立即送到病毒实验室，暂时不能检查或分离培养时，应将标本放入冻存液并加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）以防止反复冻溶使病毒灭活，存放在-70℃低温冰箱内保存。
（二）病毒形态学检查
1.光学显微镜
仅用于大病毒颗粒（如痘类病毒）和病毒包涵体的检查。
2.电子显微镜检查法
（1）电镜直接检查法
某些病毒感染的早期，临床标本中就可出现病毒颗粒。
标本经粗提浓缩后用磷钨酸盐负染，电镜下直接观察，可发现病毒颗粒，获得诊断。
（2）免疫电镜检查法
将病毒标本制成悬液，加入特异性抗体、混匀，使标本中的病毒颗粒凝集成团，再用电镜观察，可提高病毒的检测率。
本法比电镜直接检查法更特异，更敏感。
3.超过滤法
用不同孔径的火棉胶滤膜过滤病毒悬液，将获得的滤液接种于组织细胞、实验动物或鸡胚，或用血凝试验来测定病毒是否通过滤膜，从而估计病毒的大小。
4.超速离心法
根据病毒大小的不同，其沉降速度也不同。
可用超速离心法测得病毒的沉降系数（S），借以计算病毒的大小。
5.X线晶体衍射法
根据X线衍射图谱，用数学方式处理来研究病毒结构亚单位和分子结构等。
但标本必须为结晶，
可用于无包膜病毒的研究。
（三）病毒的分离与鉴定
1.病毒分离培养
实验室分离培养病毒的方法主要有三种：动物接种、鸡胚接种和组织培养。
根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的不同，可分为：原代和次代细胞培养，二倍体细胞培养，传代细胞培养。
2.病毒在培养细胞中增殖的指标
（1）细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。
（2）红细胞吸附
（3）干扰现象
（4）细胞代谢的改变
3.新分离病毒的鉴定
（1）病毒核酸类型的测定用RNA酶及DNA酶可鉴定出病毒核酸的类型。
另外，DNA病毒受5-氟尿嘧啶的抑制，而RNA病毒不受影响。
用此方法亦可区分DNA与RNA病毒。
（2）理化性状的检测对脂溶剂的敏感性：有包膜的病毒（如正粘病毒、副粘病毒、逆转录病毒等）含有脂类，对乙醚、氯仿和胆盐等脂溶剂均敏感，经作用后病毒失去感染性，而无包膜的病毒对脂溶剂有抵抗。
耐酸性试验：肠道病毒与鼻病毒均属于小RNA病毒科，均耐乙醚。
但前者可耐pH3，而后者在pH3~5环境中很快被灭活，故可将两者相区别。
（3）血清学鉴定病毒型别的最后鉴定必须依靠血清学方法。
将分离的病毒与已知的诊断血清作各种试验进行鉴定。
（四）病毒的血清学检测
血清学试验是诊断病毒感染和鉴定病毒的重要手段，也是研究病毒的主要方法之一。
血清学试验的方法很多，最常用的如中和试验、补体结合试验、血凝及血凝抑制试验等。
1.中和试验
中和试验是病毒型特异性反应，是指应用特异性抗体中和病毒的致病性或感染性的试验。
将病人血清与一定量的已知病毒混合，作用一定时间后，接种于实验动物、鸡胚或细胞培养中，观察病毒的致病作用是否被中和而不出现感染指标。
以此判断病人血清中有无特异性抗体存在。
本法特异性高，但操作比较复杂，费时。
主要用于鉴定病毒；分析病毒抗原的性质；测定免疫血清的抗体效价和疫苗接种后的效果；测定病人血清中的抗体，用于诊断病毒性疾病。
2.补体结合试验
特异性病毒抗原和相应的抗体结合形成免疫复合物时能结合补体。
本实验操作繁琐，特异性较
中和试验低，但补体结合抗体出现早，消退快，有助于早期诊断。
主要用于流行病学调查；病毒病的诊断；疫苗使用后人群抗体情况调查；检测病毒抗原；鉴定病毒属。
3.血凝及血凝抑制试验
血凝试验和血凝抑制试验为型特异性反应，其原理为某些病毒或病毒血凝素能选择性地引起个别种类的哺乳动物的红细胞发生凝集，当加入相应的特异性抗体时，这种凝集现象即被抑制。
主要用途为发现与鉴定病毒；诊断病毒病；病毒分型；免疫机体后抗体效价的测定；浓缩病毒；病毒抗原分析（某些病毒可用交叉血凝抑制试验分析抗原成分）；病毒株变异相的测定等。
4.凝胶免疫扩散试验
以半固体琼脂糖为支架所进行的抗原、抗体的沉淀反应。
本方法简便，特异性与敏感性均较高，而且衍生出对流免疫电泳和火箭电泳等更为敏感的检测技术。
此法在病毒性疾病中主要用于诊断HBV 与乙型脑炎病毒等感染。
（五）病毒的分子生物学检测
1.分子杂交技术
分子杂交是利用放射性核素或非放射性核素标记的已知特异性核酸片段作为探针，检测标本中与探针有相同序列的目的核酸，常用的杂交方法：
（1）斑点杂交
（2）固相杂交技术
（3）原位分子杂交
（4）Sorthern印迹
（5）Northern印迹
（6）分支DNA技术
2.聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）
PCR是一种选择性体外酶促扩增DNA或RNA片段的方法，其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。
常用技术有：
（1）巢式PCR
（2）半巢式PCR
（3）逆转录PCR（RT-PCR）
（4）多重PCR
（5）原位PCR
（6）定量PCR
(7)RNA捕获
(8)免疫PCR
3.凝胶电泳技术
核酸和蛋白质等生物大分子的分子量大小、所带电荷等存在差异，使其在电场中表现为泳动速度的不同，在介质中形成各自不同的条带，而使其分离开。
凝胶电泳技术是常用的分离鉴定核酸、蛋白质等生物大分子方法之一，可直接用于如轮状病毒、呼肠病毒等病毒的检测和病毒PCR产物检测等。
凝胶电泳根据所用载体不同又可分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等，根据电泳槽不同可分为圆盘电泳、垂直板电泳和水平电泳，前者已很少被使用。
（1）琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖作载体，常采用水平电泳分离、鉴定核酸。
（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳用于蛋白质和分子量在1kb以下核酸分离鉴定，分连续和不连续电泳。
（六）病毒感染的快速诊断
1.形态学检查
2.病毒抗原的检测
（1）免疫荧光技术
直接对标本或接种的组织培养进行早期抗原检测，可用标记荧光素的特异抗体直接从标本中检查病毒抗原（直接法），也可用未经标记的特异抗体先与标本中可能存在的抗原结合，然后加入荧光素标记的抗特异性抗体的免疫血清（一般为IgG型的抗体），使荧光抗体与特异性抗体结合，以检测标本中已与特异抗体结合的病毒抗原（间接法）。
此法检测迅速、特异性高，但需有荧光抗体及荧光显微镜等设备。
（2）固相放射免疫测定
首先将特异性抗体吸附到微量反应板孔底部的塑胶小球或其他固相系统上，与待检的病毒抗原结合，洗涤后再加标记放射性同位素的特异性抗体，做成标记复合物，用γ-计算器检测。
（3）酶免疫技术
此法可检测多种病毒及其抗体，主要是酶免疫组化法和酶联免疫吸附试验法（ELISA）。
前者又称免疫过氧化物酶染色，用酶标记的特异性抗体直接检测标本中的抗原，此法不仅能定性抗原，并能在显微镜下观察其定位和分布情况；ELISA是用酶标记的抗体或抗抗体来检测标本的病毒抗原或血清抗体。
酶标抗体可被待检的抗原抗体固定在微孔反应板上，当加入的酶作用底物后则出现底物被酶分解的显色反应。
此法克服了固相免疫法的缺点，其试剂安全、易保存、操作简便，而且其敏感性与特异性均与固相放免法相似。
（4）其他技术
如发光免疫分析技术、胶体金标记的免疫层析技术等。
3.早期抗体检测
检测病毒特异性IgM抗体可诊断急性感染，特别是IgM抗体的存在对证实孕妇感染风疹病毒尤为重要。
目前IF法、固相放免法和ELISA法都已应用于IgM的检测，但应注意类风湿因子（IgM）的干扰。
4.病毒核酸检测。