3.原生质体技术
细胞工程___第四章原生质体与细胞融合用
五.原生质体鉴定
1)低渗爆破法：无壁吸水向外膨胀直至胀破，是无形 的。有部分细胞壁，则原生质体从破碎后留下的残 迹仍保持半圆形的细胞壁。
2)荧光染色法:将原生质体放大离心管中，加入0·7mo l/L甘露醇配置的0.05%~0.1%荧光增白剂溶液，染 色5-10Min ，离心、洗涤除去多余的染料，在荧光 显微镜下观察(波长3600-4400A0)。绿色光显示纤维 素的存在，发出红色光的没有纤维素的真正的原生 质体。
4、细胞质膜稳定剂
细胞质膜稳定剂，能防止质膜破坏，提高原生质 体的稳定性与活性，促进细胞壁形成及细胞分裂等。
常用质膜稳定剂有：
葡萄糖硫酸钾、MES、CaCl•2H2O、KH2PO4等。 MES:2-( N-morpholino) ethanesulfonic acid 2-( N-吗啉代)乙磺酸
作用：不但具有质膜稳定作用，还具有缓冲作用，调 节pH值。
(4)氧电极法:有活力的原生质体在光照下会进行光合 作用而放出氧气，在没有光照的条件下进行呼吸而 耗氧。因此，可以采用氧电极来测定氧的变化来原 生质体是否具有活力。
第二节 细胞融合
一、细胞融合的概念
细胞融合，也称原生质体融合，或体细 胞杂交。是指两种异缘（种间、属间）原生 质体，在诱导剂诱发下或电冲击下，发生膜 融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞， 进一步发育成杂种植物体。
甘露醇
0.6 M
CaCl•2H2O
0.5%
MES
5.0 mM
pH
5.8
6、原生质体的游离与纯化(以叶为例)
1）、原生质体的游离
酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将 去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在无 菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。如果去表 皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。 对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在 酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉， 留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。
高中生物选修3(浙科版)知识点总结
第一章基因工程一、工具酶的发觉和基因工程的诞生1、基因工程的概念：（1）广义的遗传工程：泛指把一种生物的遗传物质（细胞核、染色体脱氧核糖核酸等）移到另一种生物的细胞中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。
（2）基因工程：就是把一种生物的基因转入另一种生物体中，使其产生我们须要的基因产物，或者让它获得新的遗传性状。
基因工程的核心是构建重组DNA分子。
由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA 重组技术。
（3）基因工程诞生的理论基础：DNA是遗传物质的发觉过程、DNA双螺旋结构的确立、遗传信息传递方式的认定。
2、基因工程的基本工具（1）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）①来源：主要是从原核生物中分别纯化出来的。
②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能切割（使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开），因此具有专一性。
例如：某种限制性核酸内切酶能识别的序列是GAATTC,能在G和A之间切割DNA，如下图所示。
黏性末端黏性末端③结果：能将DNA分子切割成很多不同的片段。
备注：不同DNA分子用同一种限制性核酸内切酶切割形成的黏性末端都相同；同一个DNA分子用不同限制性核酸内切酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
（2）“分子缝合针”——DNA连接酶①作用：将具有末端碱基互补的2个DNA片段连接在一起（缝合磷酸二酯键）形成的DNA分子称为重组DNA 分子。
因此，DNA连接酶具有缝合DNA片段的作用，可以将外源基因和载体DNA连接在一起。
（3）“分子运输车”——载体——质粒①载体具备的条件：1）能在受体细胞中复制并稳定保存。
2）具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
3）具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
②最常用的载体——质粒：质粒在细菌中以独立于拟核之外的方式存在，是一种特殊的遗传物质，并具有自我复制实力的双链环状DNA分子。
植物原生质体的分离与融合(3)
细胞工程实验六植物原生质体的分离与融合实验概要本实验介绍了原生质体分离的方法及利用PEG原生质体融合的原理和方法。
实验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。
其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。
由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。
其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。
测定原生质体的活性有多种方法。
荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。
一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。
它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原生质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇（PEG）法、高钙高pH法和电融合法；聚乙二醇（PEG）作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高钙高pH法进行清洗，使原生质体融合得以完成。
聚乙二醇（PEG）诱导如何的机理：聚乙二醇（PEG）由于含有醚键而具有负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当聚乙二醇（PEG）分子足够长时，可作为临近原生质表面之间的分子桥而使之粘连、聚乙二醇（PEG）也能连接钙等阳离子，钙可在一些负极化基团和聚乙二醇（PEG）之间形成桥，因而促进粘连。
从而引起原生质体融合：高钙高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时渗透压冲击也可能起作用。
原生质体分离纯化后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。
《植物组织培养技术》试题六答案
《植物组织培养技术》试题六答案一、名词解释（每题3分，共15分）1、植物组织培养：是指在无菌条件下，将植物的离体器官、组织、细胞以及原生质体，应用人工培养基，创造适宜的培养条件，使其长成完整小植株的过程。
2、驯化：试管苗移植前可将培养瓶移到自然光照下锻炼3～10d，让试管苗接受自然光的照射，感受自然温度的昼夜温差现象，使其壮实，然后再开瓶移植，经过较低温、湿度的处理，以适应自然温、湿度条件。
3、接种：在无菌条件下，用灼烧过的镊子将外植体放到培养基上的操作过程。
4、细胞悬浮培养：是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。
5、脱毒苗：是指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物内的存在表现阴性反应的苗木。
二、填空题（每空1分，共20分）1、植物组织培养的发展分为三个阶段：萌芽阶段、奠基阶段和快速发展和应用阶段。
2、在固体培养时琼脂是使用最方便、最好的凝固剂和支持物，一般用量为6-10g／L 之间。
3、常用的化学灭菌剂有酒精、氯化汞、次氯酸钠等。
4、愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式、和胚状体方式。
5、茎尖培养根据培养目的和取材大小分为茎尖分生组织培养和普通茎尖培养两种类型。
前者主要是对茎尖长度不超过0.1mm，最小只有几十微米的茎尖进行培养，目的是获得无病毒植株；后者是对几毫米乃至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养，目的是加快繁殖速度。
6、分子生物学鉴定脱毒苗的主要方法：①双链RNA法(dsRNA)和②互补DNA(cDNA)检测法。
7、花药培养前的预处理:低温冷藏是最常用的方法。
8、原生质体的纯化方法有：离心沉淀法、漂浮法和界面法。
三、选择题（每题1分，共10分）1、植物组织培养实验室不包括（ D ）。
A、准备室B、无菌操作室C、培养室D、显微实验室2、离体叶培养中，消毒后的叶片应整理切割成（ C ）大小。
A、3×3mmB、4×4mmC、5×5mmD、6×6mm3、（ D ）是植物离体培养常用的主要糖类。
河南大学药用植物学重点及名词解释
名词部分1.后含物：一般是指细胞原生质体在代谢过程中产生的非生命物质的总称，包刮淀粉、菊糖、蛋白质、脂肪和脂肪油、晶体。
2.生理活性物质：是指能对细胞内生化反应和生理活动起调节作用的物质的总称，包刮酶、纤维素、植物激素和抗生素等。
3.原生质体：是指细胞内所有有生命物质的总称，包刮细胞质、细胞核、质体、高尔基体、线粒体、核糖体、溶酶体等，是细胞的重要组成成分，细胞的代谢活动都在这里进行。
4.真果：由心房发育形成的果实。
5.假果：除心房外，花的其他部位如花被、花柱或花序轴也参与形成的果实。
6.攀援根：攀缘植物由茎上生出的，能攀附于其他物体上，使茎向上生长的根。
7.不完全叶：缺少叶片、叶柄或托叶中的任何一部分的叶。
8.单性花：仅有雌蕊或仅有雄蕊的花，其中仅有雌蕊的花称雌花，仅有雄蕊的花称雄花。
9.气生根：由茎上生出的，不深入土中而暴露在空气中的不定根。
10.完全叶：同时具有叶片、叶柄和托叶的叶。
11.两性花：同时具有雄蕊和雌蕊的花。
12.保卫细胞：比周围的表皮细胞要小，是生活细胞，有明显的细胞核，并含有叶绿体。
13.腺毛：是指能分泌挥发油、树脂、粘液等物质的毛茸，由多细胞构成，由腺头和腺柄两部分组成。
14.周皮：当次生生长开始时，初生保护组织表皮层破坏，植物体相应形成次生保护组织一周皮，周皮是复合组织，由木栓层、木栓形成层、栓内层三部分组成。
15.厚壁组织：细胞都具有全面增厚的次生壁，大多为木质化的细胞壁，壁常较厚，有明显的层纹和孔纹，细胞腔较小，成熟细胞没有原生质体，为死亡细胞。
包刮纤维和石细胞。
16.边材：在木质茎（木材）横切面靠近形成层边缘颜色较浅，质地较松软的部分称边材，具有输导作用。
17.心材：在木质茎（木材）横切面中心颜色较深，质地较坚固称心材，中心一些细胞常积累代谢产物。
18.复叶：一个叶柄上生出2个或2个以上叶片的叶。
有三出复叶、掌状复叶、羽状复叶、单身复叶。
19.叶序：是叶在茎枝上的排列顺序或方式称叶序。
原生质体
原生质体：是细胞内有生命的物质的总称，包括细胞质、细胞核、质粒、线粒体、高尔基体、核糖体、溶酶体等，它是细胞的主要部分，细胞的一切代谢活动都在这里进行。
构成原生质体的物质基础是原生质（无色半透明、具有弹性、略比水重、有折光性的半流动亲水胶体）。
它的基本化学成分是蛋白质、核酸、类脂和糖等，其中蛋白质与核酸为主的复合物是最主要的化学组成。
细胞后含物：细胞原生质体在代谢过程中产生的非生命物质。
1.淀粉：葡萄糖分子聚合而成的长链化合物，它是细胞中碳水化合物最普遍的储藏形式，在细胞中以颗粒状态（淀粉粒）储存在植物的根、茎及种子等器官的薄壁细胞的细胞之中。
形成淀粉粒的核心称为脐点，然后环绕着脐点形成许多明暗相间的同心轮纹呈层纹。
单粒：每个淀粉粒只有一个脐点；复粒：每个淀粉粒具有2个以上的脐点2.菊糖3.蛋白质4.晶体：植物细胞生理代谢过程中产生的废物，常见的有两种类型：草酸钙结晶和碳酸钙结晶（1）草酸钙结晶：植物体在代谢过程中产生的草酸和钙盐结合而成的晶体。
可以减少过多的草酸对植物所产生的毒害，被认为具有解毒作用。
单晶、针晶、蔟晶、砂晶、柱晶（2）碳酸钙结晶：状如一串悬垂的葡萄，通常呈钟乳体状态存在，又称钟乳体细胞壁：由原生质体分泌的非生活物质（纤维素、果胶质和半纤维素）细胞壁分成胞间层、初生壁和次生壁1.胞间层：又称中层由一种无定形、胶状的果胶类物质所组成果胶质能溶于酸、碱溶液，又能被果胶酶分解2.初生壁：由原生质体分泌的物质（主要是纤维素、半纤维素和果胶类）添加在胞间层的内方。
纤维素是构成初生壁的框架，而果胶类物质、半纤维素以及木质素、角质等填充与框架中。
3.次生壁：次生壁是在细胞停止生长以后，在初生壁内侧继续积累的细胞壁层。
它的成分主要是纤维素和少量的半纤维素，生长后期常含有木质素次生壁是在细胞成熟时形成，到了原生质体停止活动，次生壁也就停止沉积。
植物细胞一般都有初生壁，但不是都有次生壁。
植物的组织：分生组织、薄壁组织、保护组织、机械组织、输导组织、分泌组织薄壁组织：亦称基本组织在植物体内担负着同化、贮藏、吸收、通气等营养功能，又称营养组织通常是生活细胞，细胞壁薄，有纤维素和果胶质构成保护组织：又分为初生保护组织（表皮）和次生保护组织（周皮）（一）表皮1.毛茸：由表皮细胞特化而成的突起物，具有保护、分泌物质、减少水分蒸发（1）腺毛：能分泌挥发油、树脂、黏液等物质的毛茸，分为腺头和腺柄，具有分泌作用。
《植物体细胞杂交技术》 讲义
《植物体细胞杂交技术》讲义一、什么是植物体细胞杂交技术在现代生物技术的领域中，植物体细胞杂交技术宛如一颗璀璨的明珠，为植物育种和品种改良开辟了全新的途径。
植物体细胞杂交技术，简单来说，就是将两个来自不同植物的体细胞，在一定的条件下融合成一个杂种细胞，然后将这个杂种细胞培育成新的植物体的技术。
这可不是简单地把两个细胞放在一起，而是涉及一系列复杂而精细的操作步骤，需要借助先进的科学手段和技术设备。
二、植物体细胞杂交技术的原理植物体细胞杂交技术的原理基于细胞膜的流动性和细胞的全能性。
细胞膜的流动性使得两个不同植物的体细胞能够相互融合，形成一个新的细胞。
而细胞的全能性则保证了融合后的杂种细胞具有发育成完整植株的潜力。
细胞全能性是指每个细胞都包含着生物体生长、发育所需的全部遗传信息，在适当的条件下，能够发育成一个完整的个体。
三、植物体细胞杂交技术的操作步骤1、原生质体的制备首先，要从植物细胞中去除细胞壁，得到原生质体。
去除细胞壁通常使用酶解法，常用的酶有纤维素酶和果胶酶。
这一步骤需要在适宜的条件下进行，以确保原生质体的活力和完整性。
2、原生质体的融合得到纯净的原生质体后，接下来就是让它们融合。
目前常用的融合方法有物理法和化学法。
物理法包括离心、振动、电激等；化学法一般使用聚乙二醇（PEG）诱导融合。
3、杂种细胞的筛选和培养融合后会形成多种类型的细胞，需要筛选出杂种细胞。
筛选的方法有很多，比如根据细胞的形态、生理特性等进行筛选。
筛选出的杂种细胞要进行培养，为其提供适宜的营养和环境条件，促使其分裂和生长。
4、杂种植物的再生和鉴定经过培养，杂种细胞会逐渐发育成愈伤组织，再分化出芽和根，最终形成完整的杂种植物体。
但这还不够，还需要对得到的杂种植物进行鉴定，确定其是否真正融合了两个亲本的遗传物质。
四、植物体细胞杂交技术的优点1、克服远缘杂交不亲和的障碍在传统的杂交育种中，亲缘关系较远的植物之间往往难以杂交成功。
而植物体细胞杂交技术可以打破这种限制，实现不同物种之间基因的交流和组合。
细胞工程学第三版知识点总结归纳
细胞工程学第三版知识点总结归纳一、细胞工程概述。
1. 定义。
- 细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。
2. 研究内容。
- 动植物细胞与组织培养，细胞融合（如植物体细胞杂交、动物细胞融合），细胞核移植，染色体工程，胚胎工程等。
3. 细胞工程的发展历程。
- 起步阶段：20世纪初，植物组织培养技术开始发展，Haberlandt提出细胞全能性概念，为细胞工程奠定了理论基础。
- 发展阶段：20世纪中叶后，植物细胞工程取得了一系列成果，如植物体细胞杂交等。
动物细胞工程也逐渐兴起，包括动物细胞培养技术的不断完善等。
- 现代细胞工程：随着基因工程等现代生物技术的发展，细胞工程与之相结合，在生物制药、动植物品种改良等多方面发挥着越来越重要的作用。
二、植物细胞工程。
1. 植物细胞的全能性。
- 概念：植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。
- 实现全能性的条件：细胞处于离体状态、提供适宜的营养物质（如大量元素、微量元素、有机物等）、植物激素（如生长素和细胞分裂素的比例合适）、适宜的环境条件（温度、光照、pH等）。
2. 植物组织培养。
- 基本过程。
- 外植体选取：通常选择植物的幼嫩组织或器官，如茎尖、根尖、叶片等。
- 消毒：对外植体进行严格的消毒处理，以防止微生物污染。
- 接种：将消毒后的外植体接种到含有营养物质和植物激素的培养基上。
- 脱分化：外植体在适宜条件下形成愈伤组织，愈伤组织细胞的特点是排列疏松、无规则，是一种高度液泡化的薄壁细胞。
- 再分化：愈伤组织在一定条件下重新分化形成根、芽等器官，进而发育成完整植株。
- 培养基的组成。
- 大量元素：包括N、P、K、Ca、Mg、S等，提供植物生长所需的基本营养。
- 微量元素：如Fe、Mn、Zn、Cu、B、Mo、Cl等，虽然需求量少，但对植物生长发育不可或缺。
酶制剂复习题
1、酶的比活力答：每毫克(毫升）酶蛋白中含有的酶活力单位数（U/mg）/（U/ml）。
2、提取分离法（产酶技术）答：提取分离法是采用各种提取、分离、纯化技术从天然的动植物的组织、器官、细胞或微生物细胞中将酶提取出来，再进行分离纯化的过程。
3、酶的抽提答：指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程，也称为酶的提取。
4、原生质体答：即脱去细胞壁的细胞，指在人工条件下用溶菌酶除尽原有细胞壁或用青霉素抑制细胞壁的合成后，所留下的仅由细胞膜裹着的圆球状渗透敏感细胞。
5、菌种活化答：保藏的菌种处于休眠状态，使用之前必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下进行培养以恢复细胞的生命活动。
6、酶的膜分离技术答：指借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的多组分的溶质或溶剂进行分离或浓缩的技术。
7、酶的固定化答：指借助物理或者化学的方法将酶固定于特殊的相，使得酶与整体流体分开，但是仍然能够进行底物和效应物分子交换并发挥其催化效能的一种技术。
8、电泳答：带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程。
9、酶的修饰答：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程。
10、酶的保鲜技术答：利用酶的催化作用，防止或消除各种外界因素对食品产生的不良影响，从而保持食品原有的优良品质和风味特色的技术。
11、酶的浓缩答：经发酵或细胞破碎、抽提等步骤后，所得发酵液或提取液中酶蛋白浓度很低，须进一步从低浓度的酶溶液中除去部分的水或其他有机溶剂而成为高浓度溶液的过程。
12、酶的层析分离技术答：也叫色谱分离，是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子的大小、形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数等）的不同使各组分在两相（固定相与流动相）中的分布程度不同而使各组分得以分离的方法。
1、具有酶催化活性的蛋白质按其组成可分为和两类。
单纯蛋白质、结合蛋白质2、根据酶催化的化学反应性质，分为六大类：氧化还原酶、、、、、。
真菌原生质体制备技术
真菌原生质体制备技术
1．灭菌物品：
（1）大滤纸:
（2）灭菌针筒（含脱脂棉和玻璃钎维）
（3）脱脂棉
（4）离心管
（5）无菌ddH2O
（6） 0.6M MgSO4
（7）培养基：
A. 等渗培养基（RCM）：麦芽汁1%，酵母膏1%，蛋白胨0.4%，葡萄糖0.4%，pH自然，用0.6M蔗糖配制。
B. 破膜培养基：麦芽汁1%，酵母膏1%，蛋白胨0.4%，葡萄糖0.4%，pH自然，用水配制。
也可以采用含有0.6M蔗糖的PDA作为等渗培养基，破膜培养基不加0.6M蔗糖即可。
（8）溶壁酶酶液：1.5%，用0.6MMgSO4配制，过滤除菌；
（9）培养皿：根据样品个数
2．制备方法：
（1）称取离心管重量并记录；
（2）用接种针挑出菌丝，并用灭菌双蒸水冲洗一次，然后用无菌的0.6M MgSO4冲洗两次，用灭菌的滤纸吸干，放入已知重量的离心管，称重并记录；
（3）计算得到菌丝重量，按0.2（g）：1(mL)加入灭菌酶液，震荡均匀；
（4） 28℃，3~4小时，摇床震荡（轻微），酶解，同时每30min镜检观察原生质体数量；
（5）灭菌注射器（含脱脂棉和玻璃钎维）过滤；
（6）离心：2500rpm,2min
（7）用0.6M MgSO4洗涤沉淀3次；
（8）用用0.6M MgSO4定容至最初的加酶量；
（9）镜检计数；记录；
（10）涂板后再生培养，第7天后每隔1天计数一次。
给学生微生物遗传育种学复习思考题1
给学⽣微⽣物遗传育种学复习思考题1《微⽣物遗传育种》复习思考题01 绪论1、⼯业微⽣物菌种应具有哪些基本特征？⾮致病性；适合⼤规模培养⼯艺要求；利于规模化产品加⼯⼯艺；具有相对稳定的遗传性能和⽣产性状；形成具有商业价值的产品或具有商业应⽤价值。
2、简述⼯业微⽣物遗传育种的分类。
天然菌种（native strain）：通过⾃然筛选和分离获得的⼯业菌种；诱变菌种（mutagenized strain）：通过物理、化学等诱变剂在实验室⼈⼯诱变⾃然筛选与分离的菌株所获得产量或/和性状改善的⼯业菌种；重组菌种（recombinant strain）是通过遗传重组技术对菌种进⾏定向遗传改良获得的⼯业菌种；遗传修饰⽣物体（genetic modification organisms, GMOs）：经外源基因导⼊并因此发⽣遗传整合和性状改变的⽣物体。
3、试从微⽣物遗传学的不同⾓度阐述你对微⽣物多样性的认识。
⼀、微⽣物物种的多样性; ⼆、微⽣物遗传的多样性;三、微⽣物代谢的多样性 ;四、微⽣物的⽣态多样性;五、微⽣物利⽤的⼴泛性02 第四章⼯业微⽣物育种诱变剂1、什么是诱变剂？可分为哪⼏种类型？诱变剂：凡能诱发⽣物基因突变，并且突变频率远远超过⾃发突变率的物理因⼦或化学物质.可以分为三类：物理诱变剂；化学诱变剂：⼀类能对DNA起作⽤，改变DNA结构，并引起遗传变异的化学物质；⽣物诱变剂：采⽤某些噬菌体来筛选抗噬菌体突变菌株时，常常发现伴随着出现抗⽣素产量明显提⾼的抗性突变株。
因此，可以认为这些溶源性噬菌体是⼀种⽣物诱变剂。
2、什么是突变？突变的表现型有哪些？基因突变的特点有哪些？突变，从⼴义上讲，除了转化、转导、接合等遗传物质的传递和重组引起⽣物变异以外，任何表型上可遗传的突变都属突变范围，如染⾊体整倍性和⾮整倍性的变化及染⾊体结构上的畸变等都包括在内。
1、形态突变型，是⼀种可见突变，它包括微⽣物菌落形态变化，如菌落形状⼤⼩、颜⾊、表⾯结构等；2、⽣化突变型，；3、条件致死突变型；4、致死突变型；5、抗性突变型；6、营养缺陷型；普遍性；随机性（基因突变可以发⽣在⽣物个体发育的任何时期和⽣物体的任何细胞。
药用植物组织培养
药用植物组织培养一、名词解释：1、初代培养:从植物体上分离下来的第一次培养叫初代培养，或叫第一代培养。
2、继代培养：以后将培养物转移到新的培养基上进行培养称为继代培养，也可细分为第二代培养，第三代培养。
3、药用植物组织培养: 是以现代生命科学理论为基础，结合化学学科的科学原理，采用先进的生物工程技术手段，以药用植物为研究对象，进行其组织器官的发生、培养和细胞融合、转化以及次生代谢产物和药材组培苗工厂化生产研究的一门新兴的综合性应用学科。
4、外植体：是指由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织和器官。
5、培养基：根据植物营养原理和植物组织离体培养要求而人工配制的营养基质。
它通常含有无机元素、维生素、氨基酸、糖类、植物生长调节物质、固化物、活性炭、天然提取的营养物、水组成。
是植物组织生长的物质基础，也是植物组织培养能否成功的重要因素之一。
6、愈伤组织：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞。
在组织培养中，则指在人工培养基上由外植体上长出来的一团无序生长的薄壁细胞。
7、胚状体：指的是在植物组织培养中起源于一个非合子细胞（合子细胞：两性配子相融合形成的新细胞），经过胚胎发生和胚胎发育的过程形成双极性的胚状结构。
8、细胞分化:是细胞功能特化的过程9、细胞脱分化：是指一个成熟细胞回复到分生状态或胚性细胞状态的现象。
即失去已分化细胞的典型特征。
10、细胞再分化：是脱分化的分生细胞重新恢复细胞分化能力，沿着正常的发育途径，形成具有特定结构和功能的细胞。
11、外植体：是指用于无菌培养的离体植物材料。
即泛指第一次接种所用的植物组织、器官等一切材料。
选择合适的植物材料是进行组织培养关键的一步。
12、愈伤组织的继代培养：愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，次生代谢产物的积累，原有的培养基已不适宜愈伤组织的生长，必须转移到新鲜培养基上培养,这个过程叫做愈伤组织的继代培养。
13、植物离体快速繁殖:是指利用植物组织培养技术进行的一种营养繁殖方法，又称微体快繁。
植物生物技术名词解释
生物技术:也称生物工程, 是指以现代生命科学为基础,结合先进的工程技术手段和其他基础科学的科学原理, 按照预先的设计改造生物体或加工生物原料, 为人类生产出所需要的产品或达到某种目的的一系列技术。
重组DNA技术：采用分子生物学操作方法，在体外将外源DNA与载体DNA构建成具有自我复制能力的DNA分子，通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有该外源DNA的转化细胞，在进行增殖。
细胞工程:指应用细胞生物学和分子生物学的方法，在细胞水平进行的遗传操作。
愈伤组织:植物外植体脱分化、经过细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。
体细胞胚:又叫胚状体，是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。
人工种子:是将植物离体培养产生的体细胚包埋在含有营养成分和保护功能的物质中，在适宜的条件下发芽出苗。
茎尖培养:取植物茎尖组织放入培养液中进行的无菌培养。
植物组织培养:在含有营养物质及植物生长物质的培养液中，培养离体植物组织（器官或细胞）并诱导使其长成完整植株的技术。
细胞全能性:广义的细胞全能性指一个细胞发育成一个完整有机个体的潜能和特性。
植物细胞的全能性指具有完整细胞核的细胞，在适宜的条件下能够分化发育成完整植株的潜在能力。
无病毒苗：未被病毒感染，或经人工处理去除病毒的植物苗株。
外植体:从植株上切离、用于培养的部分或器官称为外植体。
植物胚胎培养：在无菌条件下对植物的胚、子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植株的技术。
单细胞培养:指从植物器官、愈伤组织或悬浮培养物中游离出单个细胞，在无菌条件下，进行外培养，使其生长、发育的过程。
细胞悬浮培养:指将植物的细胞和小的细胞聚集体悬浮在液体培养基中进行培养，使之在体外生长、发育，并在培养过程中保持很好的分散性。
体细胞无性系变异：指植物体细胞在组织培养过程发生变异，进而导致再生植株发生遗传改变的现象。
细胞突变体:指将植物细胞培养在附加一定化学物质的培养基上，用生物化学的方法诱导细胞遗传物质的改变，从细胞水平上大量筛选拟定目标突变体。
实验三 原生质体
. 重复上一步。 重复上一步。
. 从此，室温进行，每管沉淀用 从此，室温进行，每管沉淀用450µl MMG 重悬
5. 取25~50µg质粒于1.5ml离心管中，加100µl上一 质粒于1.5ml离心管中 离心管中， 质粒于 上一 步重悬过的细胞， 剪头200µl枪头轻轻吹匀。 枪头轻轻吹匀 步重悬过的细胞，用剪头 枪头轻轻吹匀。
.柱子加入空 管，向膜中加入 柱子加入空EP管 向膜中加入30µl Elution Buffer,室 柱子加入空 室 置2min
观察原生质体•源自下午观察上午制备的原生质体细胞， 下午观察上午制备的原生质体细胞， 用去头的枪头吸取静置后下层的细胞， 静置后下层的细胞 用去头的枪头吸取静置后下层的细胞， 制片， 制片，观察
1. 原生质体的制备
实验材料：继代7~8天的水稻悬浮细胞 天的水稻悬浮细胞, 实验材料：继代7~8天的水稻悬浮细胞, 20ml 实验试剂： 实验试剂：20ml
100ml 0.147g 纤维素酶RS NaOAc 甘露醇 pH 5.7 0.098g 离析酶R－10 11g 20ml 0.24g 0.12g
第二天，周六，3.17，地点实验楼，626 第二天，周六， ，地点实验楼， 1- 5 组观察 上午 9:00 10:00 6-10 组观察 10
实验目的 • 掌握水稻原生质体的制备方法； 掌握水稻原生质体的制备方法； • 掌握基因瞬时转化方法； 掌握基因瞬时转化方法； • 了解 了解GFP的发光原理； 的发光原理； 的发光原理 • 了解质膜蛋白的分选途径。 了解质膜蛋白的分选途径。
尽管450～490nm(蓝光)是 是GFP的副吸收峰,但由于长波 能量低,细胞忍受能力强, ,因此更适合于活体检测.
3、水稻悬浮细胞原生质体转化 水稻悬浮细胞原生质体转化
高中生物选修3(浙科版)知识点总结
高中生物选修3(浙科版)知识点总结第一章基因工程一、工具酶的发现和基因工程的诞生1.基因工程的概念基因工程是将一种生物的基因转移至另一种生物体中，使其产生需要的基因产物或获得新的遗传性状。
基因工程的核心是构建重组DNA分子。
2.基因工程的基本工具限制性核酸内切酶（限制酶）是“分子手术刀”，能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并切割使其断开，具有专一性。
DNA连接酶是“分子缝合针”，将具有末端碱基互补的DNA片段连接在一起形成重组DNA分子。
载体是“分子运输车”，具有自我复制能力的双链环状DNA分子，能在受体细胞中复制并稳定保存，供外源DNA片段插入和重组DNA鉴定和选择。
二、基因工程的原理和技术基因工程的基本原理是让目的基因在宿主细胞中稳定和高效地表达。
为了实现基因工程，需要准备多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等基本要素，并按照一定的程序进行操作：目的基因的获得、重组DNA的形成、重组DNA导入受体细胞（宿主细胞），筛选含有目的基因的受体细胞、基因表达。
目的基因的获得有两种方法：一种是目的基因的序列已知，可以用化学方法合成目的基因，或者用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因；另一种是目的基因的序列未知，需要建立一个包括目的基因在内的基因文库，从中寻找目的基因。
形成重组DNA分子的方法是使用相同的限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体DNA，然后用DNA连接酶将它们连接在一起，形成重组DNA分子。
将重组DNA分子导入受体细胞的方法是使用适当的方法将形成的重组DNA分子转移到合适的受体细胞中，常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等。
筛选含有目的基因的受体细胞需要使用选择性培养基进行筛选，因为并不是所有细胞都能接纳重组DNA分子。
最后，目的基因在宿主细胞中表达，能产生人们需要的功能物质。
基因工程的核心是构建重组DNA分子，而DNA的遗传信息传递方式的认定、限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒载体的发现与应用为基因工程提供了技术上的保障。
原生质体融合技术简介
2 原生质体的制备
获得有活力、去壁较为完全的原生质体是原生质 体融合育种技术的先决条件。 在细菌和放线菌中，制备原生质体主要采用溶菌 酶；制备葡萄球菌的原生质体，则需用溶葡萄球 菌素处理；制备酵母菌的原生质体时， 一般可用 蜗牛酶；制备丝状真菌的原生质体时，可用蜗牛 酶，在丝状真菌的原生质体制备中很少单独使用 一种酶，而是采用两种或三种酶混合处理。 另外，影响原生质体制备的因素有许多，主要是 菌体的性质 ，酶的性质以及反应环境
(1)直接法 原生质体融合后直接分离到MM或SM上，即可 (1)直接法 原生质体融合后直接分离到MM或SM上，即可 直接检出融合细胞。其优点是只需一步就可得到重组体， 而大多数重组体是稳定的，缺点是难以检出那些表型延 迟而基因已重组的融合体。 (2)间接法 把融合产物分离到CM上，使原生质体再生， (2)间接法 把融合产物分离到CM上，使原生质体再生， 融合和非融合的原生质体都能生长，再分离到SM上。其 融合和非融合的原生质体都能生长，再分离到SM上。其 优点是能促使细胞更好地再生，表型延迟重组体容易检 出。缺点是需要两步才能检出重组体，需要相当大的人 力和物力，而且得到的重组体不大稳定。 直接法和间接法都要用营养缺陷性标记，所得重组体不 一定能提高目的产物的产量。 (3)钝化选择法 (3)钝化选择法 钝化选择法是指灭活原生质体和具活性原 生质体融合，把亲株中的一方（野生型）原生质体在 50° 热处理2 50°C热处理2-3小时，使融合前原生质体代谢途径中的 某些酶钝化不能再生，再与另一方（双缺陷性）原生质 体融合，并分离到mm上，灭活除用加热方法外，还可以 体融合，并分离到mm上，灭活除用加热方法外，还可以 用紫外或药物处理。
3 原生质体的再生
酶解去壁后得到的原生质体应具有再生能力，即能 重建细胞壁，恢复细胞完整形态并能生长、分裂， 这是原生质体融合育种的必要条件。仅有细胞质膜 的原生质体对渗透压很敏感、很容易破裂，致使原 生质外流而使细胞死亡。所以，再生培养基必须与 原生质体内的渗透压相等。这就要在再生培养基中 加入具有一定渗透压的基质，即渗透压稳定剂 原生质体的再生是一个非常复杂的过程．一些学者 研究认为，若原生质体的细胞壁剥去得不太彻底， 则有助于细胞壁的再生，残留的细胞壁尤如结晶时 的“晶种”一样。大量实验也证明，破壁太彻底往 晶种” 往会引起原牛质体再生率的大大率较高 由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融 合时加入融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂 合时加入融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂 交频率都明显高于常规杂交方法。 2 受接合型或致育性的限制较小 由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用， 因此有利不同种属间微生物的杂交。另外，出于原生质 体融合是和致育性没有关系的细胞杂交，所以其受接合 型或致育性的限制就比较小。 3 重组体种类较多 由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发 生相互接触．有机会发生多次交换，可以产生各种各样 的基因组合而得到多种类型的重组体
原生质体转染法法操作步骤
原生质体转染法法操作步骤
嘿，朋友们！今天咱来聊聊原生质体转染法的操作步骤，这可真是个有趣又有点挑战性的事儿呢！
先来说说准备工作吧，就好比你要去打仗，不得先把武器弹药准备好呀！得挑好合适的细胞，这细胞就像是你的小兵，得精壮有力才行。
然后呢，把各种试剂都准备齐全咯，可别到时候缺这少那的。
接下来就是处理细胞啦！这就像给小兵们来个特训，让它们变得更厉害。
把细胞小心地培养起来，给它们一个舒适的环境，让它们茁壮成长。
然后呢，要进行原生质体的制备啦！这可是个关键步骤，就好像要打造一把锋利的宝剑。
得仔细操作，不能马虎。
把细胞弄破，让原生质体跑出来，这可得有点技巧哦，不然一不小心就搞砸啦。
制备好了原生质体，就该进行转染啦！这就像是给小兵们装备上厉害的武器。
把要转染的东西和原生质体放在一起，让它们亲密接触，希望它们能完美结合。
转染的过程中可得注意观察呀，就像你看着自己的宝贝一样，生怕出点啥问题。
看看有没有异常情况，要是有，得赶紧想办法解决。
转染完了也别松懈，还得好好培养这些细胞呢，给它们足够的时间和营养，让它们好好发展。
你说这原生质体转染法像不像一场战斗？每一个步骤都很关键，都不能掉以轻心。
要是有一个环节出了错，那可就前功尽弃啦！所以啊，咱得认真对待，就像对待一件特别重要的事情一样。
你想想，要是最后成功了，那得多有成就感呀！看着那些经过转染的细胞茁壮成长，就好像看着自己培养的花朵绽放一样开心。
而且这技术用处可大啦，可以帮助我们研究好多东西呢！
所以呀，朋友们，别害怕，大胆去尝试原生质体转染法吧！只要你用心，肯定能成功的。
加油哦！。
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2、 原生质体的分离
渗透压稳定剂
在配制酶液时，必须加入适量的渗透压稳定 剂，以代替细胞壁对原生质体所起的保护作用。 因为细胞壁一旦去除，裸露的原生质体若处于低 渗透压的溶液中，就会立即破裂死亡。 甘露醇和山梨醇等糖醇是最常用的渗透压稳 定剂，有时也用葡萄糖。糖醇一般用于游离叶肉 等材料的原生质体。葡萄糖则常用于游离悬浮细 胞的原生质体。渗透压稳定剂的浓度因植物材料 不同而异，一般为0.3～0.7mol/L。
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2、 原生质体的分离
试管苗的子叶、胚轴以及培养的悬 浮细胞具有无菌、不受生长季节影响等 特点。 许多试验结果指出，利用试管苗作 为供体材料时，苗龄对分离原生质体及 其后培养的效果影响较大。另外，培养 的悬浮细胞，如果经过多次的继代培养， 常常会出现再生植株能力减退和遗传上 的不稳定性等现象。
1.原生质体的研究概况
原生质体
核质体
植物细胞
胞质体
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1.原生质体的研究概况
1.2 原生质体的研究进展
1、1863年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast) 一词。 2、1892年，Klercker用刀片细切植物组织机械分离 出原生质体。 3、1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质 体获得成功。 4、1971年，Takebe et al.首次得到烟草叶肉原生质 体培养的再生植株。 5、1985年，Fujimura et al.第一例禾谷类作物－水 稻原生质体培养再生植株。 6、1986年，Spangenberg et al.单个原生质体培养 再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。
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2、 原生质体的分离
无机盐类或其它化合物
在一些研究中，酶液中还加进一些无机盐 类或其它化合物。如氯化钙、磷酸二氢钾、葡 聚硫酸钾等。由于它们可能对保护细胞膜有一 定的作用，可提高原生质体的稳定性和活力， 防止其破裂。
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1.原生质体的研究概况
据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原
生质体培养得到了再生植株（1993）。其趋势仍以农作物和
经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植
物向低等植物扩展。 在果树上，主要集中在柑橘上，在这方面华中农业大学园 林学院作了比较多的工作，获得了种间、属间的体细胞杂种。 但这些体细胞杂种再生植株在生产上还没有得到应用。
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2、 原生质体的分离
目的：获得大量完好、有活力的原生质体。
机械分离法 原生质体分离方法 机械分离法 酶解分离法
先将细胞放在高渗糖溶液 中预处理，待细胞发生轻微 质壁分离，原生质体收缩成 球形后，再用机械法磨碎组 织，从伤口处可释放出完整 的原生质体。用这种方法曾 成功地分离出藻类原生体 （Klercker,1892）。
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2、 原生质体的分离
2.4 原生质体活力测定
目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定 原生质体活力。 FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，不能 自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即 发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因 而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细 胞活性。
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2、 原生质体的分离
2.2 材料的预处理与分离
材料预处理——对于某些植物非常重要。
分离得到的原生质体，其活力和分裂频率高低是影响原生 质体培养成功的2个决定性的因素。
在游离原生质体前对供体材料进行预处理及预培养，可以 提高某些材料原生质体的活力和分裂频率。 用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高 某些材料原生质体的产量和活力。不同植物及材料类型预处 理方法不同。 例如 龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理，甘蔗植株必 须先在黑暗条件下培养12h后分离的原生质体才能分裂。
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2、 原生质体的分离
叶片——经典材料。
自从1971年Takebe等利用烟草叶肉组织成功 分离出原生质体并使其再生植株以来，利用叶片分 离原生质体已被广泛应用。
一般可能认为选取细胞分裂旺盛的生长点附 近的嫩叶较为合适，但是，许多试验结果表明，选 用充分展开的成熟叶片或生理活性稍稍衰退的过熟 叶片，有利于原生质体的分离及其后的培养。 处理：在叶片取材之前，通常先对供体植株进 行适当的干旱处理使其处于轻度的萎蔫状态。也可 以对离体叶片的切块先进行质壁分离，这样分离原 生质体的效果更好。
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2、 原生质体的分离
界面法：
酶解产物 +原生质 体培养基 (0.45mol/L 甘露醇)
400g，离心5min
碎片带（轻）
原生体带
0.45mol/L蔗糖
0.45mol/L蔗糖
原理：采用两种比重不同的溶液，使原生质体处于两相 的界面中。 优点：可以收到数量较大的纯净原生质体，同时避免收 集过程中原生质体相互挤压而破碎。
伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损 坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否 确定活性。
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常用的商品化酶制剂
目前，国内国际市场上常用的商品化酶制剂主要有 以下几种，它们各具特点，可根据植物材料的性质 单独使用或搭配使用。 (一)果胶酶 用于降解植物细胞之间的果胶质。常 用的有离析软化酶（Pectolyase Y-23）和离析酶 （Macerozyme）。Pectolyase Y-23的活性较高， 通常用量为0.1%～0.5%。 Macerozyme 的活性稍 低，通常用量为1%～5%.
缺点：完整的原生质体的 得率低，适应的植物种类 有限。（基本不用）
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2、 原生质体的分离
酶解分离法
用相关酶，降解细胞之间的果胶质，使细胞分离开 来，然后再降解细胞壁（纤维素和半纤维素），获得 原生质（Cocking,1960）。 常用的酶制剂有：果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶 优点：获得大量的原生质体，不受植物种类的限制。 缺点：这些酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物 酶及酚类物质。用酶降解细胞壁，会影响所获原生质 体的活力。 是目前获得原生质体的主要方法。
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2、 原生质体的分离
酶法分离原生质体的步骤
起始材料 混合酶液 酶解（一步法）
叶片为例：
除菌后的叶片 撕去下表皮 切块放入混合酶液中
不时轻摇
25-30℃ 混合酶液转绿 2-4 h
反应液转绿是酶解成功的重要指标，说明已有不少原生质体游离 出来。经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受 到更多的损害。
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概念：酶解液中，有完整的 原生质体、破碎的原生质体、 2.3 原生质体的收集与纯化 未去壁的细胞、细胞器及其 它碎片。同时，还含有酶及 其它不利于原生质体培养、 再生的试剂。 完整的原生质体 这些在原生质体培养中会 破碎的原生质体、未去壁的 引起干扰作用，必须清除， 细胞、细胞器及其它碎片 这一过程称为纯化。 酶及其它试剂。 即从酶解液中获得纯净原生 质体的过程。 酶解液 方法：先滤除组织碎片和残 渣，再以新的渗透压稳定剂 或原生质体培养基离心洗涤 2-4次。 主要方法： 漂浮法、界面法 中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 和沉降法等。 21
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2、 原生质体的分离
(二)纤维素酶 用于降解植物细胞壁中的纤维素。常用的 有Cellulase Onozuka R-10和Cellulase Onozuka RS。 Cellulase Onozuka R-10几乎为所有的游离原生质体的研 究所采用，而Cellulase Onozuka RS的活性约等于 Cellulase Onozuka R-10的10倍。一般来说，酶的活性越 高，它对植物细胞的毒害也越大，所以，用酶溶液处理的 时间必须相对缩短。 (三) 半纤维素酶 用于降解植物细胞壁中的半纤维素。常 用的有Rhozyme HP-150，为加拿大和美国产，此酶主要 用在那些细胞壁中具有半纤维素的植物种类。 (四) 崩溃酶（Driselase），是一种粗制酶，主要含纤维素 酶，也含果胶酶，还混有蛋白酶和核酸酶。使用时应注意 浓度和处理时间。
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1.原生质体的研究概况
1.3 原生质体的研究意义
再生能力
意义： 1、理论研究－膜的 结构与功能。 2、体细胞融合－克 服远缘杂交障碍， 创造新物种。 3、理想受体－导入 外源DNA。
细胞分化
器官发生
个体（胚胎） 发生
体细 胞遗 传学
原生质体系 统
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2、 原生质体的分离
酶混合液： 酶制剂 + 渗透压稳定剂 + 无机盐类 + 一些其 它化合物
调pH值至5.6左右 过滤除菌（0.22～0.45µm）
酶混合液的用量约为10mL/g。
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2、 原生质体的分离
2、 原生质体的分离