转基因鱼的构建及检测

!OOOO外源基因的结构及克隆
低，以及存在安全性的忧虑。为了使转基因鱼能安全 食用，有些学者克隆了鱼类自身的高效启动子，如美
转移到受体鱼中的外源基因，其结构至少应包 括 ’ 个部分：!启动子（ ^1,6,0.1）；"编码序列
洲大绵鱼（尉 a7/1,i,71/.N 76.18/7-DN）抗冻蛋白基因 的启动子（ ,^ERj）f’JOBg。
33333收 稿 日 期 ：?@$%A%?5?B
万方数据
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农业生物技术学报
!""! 年
基因开始的。首例报道的转基因鱼是导入人生长激 !"#$$$获$得目的基因
素（ #$%）基因，启动子是 &’()*+。此后，有关这方
wenku.baidu.com首先从基因文库中得到一个含侧翼调控序列的
面的报道不断增加 ， ),-./"+ 有的导入牛生长激素基因 合适的目的基因。侧翼调控序列包括位于基因编码
（ /,;8-FON.<D.-/.N）；#转录终止信号（ 017-N/18^08,&
编 码 序 列 即 编 码 特 定 蛋 白 质 的 核 苷 酸 序 列 ，它
-79O0.168-708,-ON8F-79）。在这三部分中，转录终止信 能使转基因鱼产生新的表现型。由于鱼类是人类的
号对转基因的影响较小，到目前为止，还没有文献报 蛋白质来源之一，用基因转移技术获得生长快、产量
（ 0$%），也有 导 入 了 羊 生 长 激 素 基 因（ 1$%）)//2,/!+。 序列上游的启动子及位于编码序列上游或下游的组
随着转基因研究发展，从安全性和人们的心理承受 织特异性增强子。在转基因研究中，为了使外源基因
能力角度考虑，国内外学者一致强调构建“ 全鱼基 在受体中能更好地表达，导入的目的基因最好来自
研究的方向之一，但目前人们对这些基因的了解还 移此核到另一个去核卵中，或与卵融合，这样的卵也
很少。
可发育成转基因鱼。
!,,,,,转基因鱼的构建
在注射外源基因时，必须注意以下两方面（： /） 注射线状基因为好。因为含有质粒载体的完整环状
!T3U3H6,V>,CE;L:;7J:6;,V>,T#:;,(,(>,:J,34R,T41;6;9,J#:,9H1NJ#,#1H&1;:,9:;:,5H1&,J#:,7:30H:3&,567#,WXG3HE7
大量的研究。我们也曾对鱼类转基因研究现状和存 究 早 期 ， 使 用 的 启 动 子 大 多 为 小 鼠 金 属 硫 蛋 白
在的问题进行了探讨，并提出了一些解决的办法f%g。 （ 6aQ）基因或病毒如猴空泡病毒（ ZhB$）和鸟类
本文进一步综述转基因鱼的构建和检测方法。
肿瘤病毒（ YZh）等，这些启动子的缺点是表达效率
激素基因，以及大麻哈鱼的催乳素基因)/@+。国内朱作 PQB，用 合 适 的 限 制 性 内 切 酶 酶 切 ，分 离 出 插 入 载
言等)/A+克隆了鲤和草鱼生长激素基因，杨学成 克 )!"，!/+ 体的外源基因。
隆了大麻哈鱼和虹鳟生长激素 基 因 ，宋 诗 铎)!!+克 隆 !"%$$$受$体鱼（ 受精卵）的获得
黄 盖 鲽（ D7:EF1G4:EH1;:IJ:7 K1L1#3&3:）)!-+ 和 瓦 氏 白酶的溶液中处理 <.*,&6;，消化去膜，将裸卵移至
雅罗鱼（ M:EI67IE7 N34:IL66）)!?>,!@+分离并克隆了 BCD %14J5H:J:H 溶液中，在第一次卵裂前进行显微注射导
基因。另外，费云标)!A+将纽芬兰大洋条鳕 BCD 基因 入外源基因。注射量为每卵接受 /.!,;M 左右含 /"-
O017-NF.-8/O>8NHeO/,-N01D/08,-eO;.0./08,-
转基因技术已成为鱼类遗传育种的重要手段之 中成功表达的重要因素。在转基因鱼中，成功的启动
一，国内外学者对外源基因克隆、基因转移技术、转 子应当指导外源基因在适当的时间和特定的组织中
基因鱼构建和检测、转基因安全等各方面已进行了 进行表达，且表达的量要达到一定程度。在转基因研
（ )） 斑 点 杂 交 提 取 实 验 鱼 #$%，消 化 样 品 ， 经变性后的 #$% 点于滤膜上，以同位素标记的外 源基因片段作探针，经杂交后进行放射自显影。由于 斑点杂交检测的是细胞中所有 #$% 序列，对于未 整合入受体鱼基因组而呈游离状态的外源基因也能 显示阳性信号（ 但这并不表明与基因组整合），所以 斑点杂交呈阳性的鱼不一定是真正的转基因鱼。为
的是通过转移抗冻蛋白基因以提高某些鱼类如罗非 裸卵移至手术杯中进行基因导入。
鱼、鲮和大西洋鲑等的抗寒能力，从而扩大这些鱼类 !"&$$$注$射基因
的养殖地域以及节省越冬期间的能量消耗。目前已
显微注射法是目前最常用和比较有效的基因导
从美洲拟鲽（ D7:EF1G4:EH1;:IJ:7 3&:H6I3;E7）)!<.!*+、 入方法。受精卵用镊子去膜或在含 "R!*S."R*S胰蛋
3EH343YR,B07JR,<HF,Z;J:H;3J61;34,XK&G176E&,15,$:;:J6I7,6;,B[E3IE4JEH:>,/A@@ >,Q1HN3KR
万方数据
第 !""期
杨 弘等：转基因鱼的构建及检测
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#$% 在细胞中对酶降解有较强的抵抗力，降低了外 源基因在受体基因组上的整合率，故注射前用内切 酶除去质粒载体，以线状基因注射到受体鱼卵中，可 提高整合率。已有实验表明线状 #$% 整合率比超 螺旋 #$% 高 & 倍’()*。其原因是线状 #$% 以首尾相 连的多拷贝形式插入受体基因组，能保持外源基因 原有的完整结构；而环状 #$% 是以镶嵌形式插入 受体基因组，即环状 #$% 是一段一段地整合入基 因组’+,*，这就可能使外源基因的完整性受到影响。另 外，采用线状 #$% 时 ，一 般 先 用 酶 切 除 载 体 序 列 ， 而环状 #$% 包含大量载体序列。虽然载体序列对 整合效率没有影响，但由于载体一般都为原核序列 （ 如质粒），会抑制导入的真核外源基因在转基因鱼 中的表达（。 ,）注射 #$% 的位置很重要。注射外源 基因到受体鱼的鱼卵时，必须将外源基因导入卵核
关 键 词 ：转 基 因 鱼 ；构 建 ；检 测
+,-N01D/08,-O7-;3P.0./08,-3,>3Q17-NF.-8/3R8NH
S7-F3T,-F3333UD3Q8-F08-F33333V873P.<D7-LL
WR1.NHX70.13R8NH.18.N3Y.N.71/H3+.-0.1J3+H8-.N.3E/7;.6I3,>3R8NH.1I3Z/8.-/.NJ3UD:83?%B$M%J3+H8-7[
因”（ 344,567#89:;:）的重要性与迫切性；更何况鱼类 基因组，而不是 IPQB，因为基因组序列包含有完整
生长激素的促进鱼类生长效应是 哺 乳 类 的 /"./"" 的内含子和侧翼调控序列。如果要使用其它启动子
倍)/<+，更应该考虑导入鱼类自身的生长激素基因。为 序列，最好用从鱼类基因组中分离出的启动子序列，
此，国内外很多实验室对鱼类生长激素基因进行了 并将其插入基因编码序列上游。
克隆。目前已克隆了多种鱼的生长激素基因及其它 !"!$$$基$因克隆
有 关 的 基 因 ，如 虹 鳟)/=+、鲷 鱼!、大 麻 哈 鱼)/*+、银 大 麻
获得的基因必须克隆到质粒或噬菌体中，并在
哈鱼)/->8/?+、大 鳞 大 麻 哈 鱼)/@+、鲤 鱼 和 草 鱼)/A+等 的 生 长 合 适 的 菌 株 中 扩 增 。 提 取 这 种 重 组 质 粒 或 噬 菌 体
等。日本青木宙)<"+已克隆了鲤珠蛋白基因，并正在将
最近衍生出另一种注射方法。把外源基因注入
该基因导入虹鳟，期望虹鳟能耐低溶氧，使虹鳟不仅 到卵母细胞核中，离体培养卵母细胞到成熟卵，然后
能在山泉流水中养殖，也能在静水池塘中养殖。另 与正常精子授精，使受精卵含有外源基因。还可把外
外，抗逆性基因，如抗病和抗污染基因等也是转基因 源基因注入到鱼类培养细胞或体细胞核中，然后转
道其在转基因研究中的重要性f?g。
高的优质“ 超级鱼”对学者们具有极大的诱惑力，因
选择适当的启动子是保证外源基因在转基因鱼 此，对鱼类基因转移的研究，也是从生长激素（ ]T）
! 基金项目"中国水产科学研究院科研基金项目资助（ #$$%&’&(）。
杨 弘：男，%)** 年生，副研究员。
!! 联系作者。 +,--./0.12333456789〈"3 :87;<=>>1/27/2/-〉2
步筛选出整合了外源基因的实验鱼；再用 12345678 杂交法确认真正整合的转基因鱼；最后采用 $27459 678 杂交法证实转录 :0$% 的鱼，并用放射免疫法 确定其表达情况。 %"&$$整$ 合了外源基因受体鱼的筛选
从注射了外源基因的受体鱼中筛选出整合了外 源基因的鱼，为以后进一步检测外源基因的整合和 表达缩小检测鱼的数量。具体操作如下：
用常规微量注射法注入金鱼受精卵内，获得转抗冻 以上外源基因拷贝的外源生长激素基因。显微注射
蛋白基因金鱼。但从目前的研究来看，转基因鱼中 后，受体卵在 %14J5H:J:H 溶液中发育，胚胎发育至原
BCD 的量还不足以产生抗冻的效果，因此在今后的 肠期后，将培养液逐渐用曝气的冷开水稀释，直至心
研究中要提高启动子的增强效应，或者增加基因导 跳期之后胚胎完全在曝过气的冷开水中培育成鱼
入量。
苗。鱼苗摄食 *,F 后，一部分移入水族箱饲养观察，
除了生长激素基因和抗冻蛋白基因之外，还有 另一部分养殖在小池塘备用。来自同一亲本的对照
其 它 一 些 基 因 引 起 了 人 们 的 注 意 ， 如 珠 蛋 白 组，除了不接受外源基因注射之外，其它处理程序与
（ 94106;）基 因 和 生 长 激 素 释 放 因 子（ $%OC）基 因 实验组相同。
].-.3017-N>.13,>3>8NH38N3,-.3,>386^,107-0O6.0H,;NO,>O>8NHO\1..;8-F2O_-O0H8NO1.‘8.XJO/9,-8-FO,>O>,1.8F-OF.-.JO/,-N01D/08,-O 7-;O;.0./08,-O,>O017-NF.-8/O >8NHO71.O;8N/DNN.;O 8-O;.07892O a.7-XH89.JO N.‘.179O^1,\9.6NO0H70O-..;O 0,O\.O /,-N8;.1.;O71.O 8-;8/70.;O,-O N0D;8.NO,>O017-NF.-8/O>8NH2OQH.O7^^1,^1870.O^1,6,0.1O8NON,O86^,107-0O0H70O>,1.8F-OF.-.O/7-O\.O.:^1.NN.;O6,1.O.>>8/8.-09I2Ob,XO/9,-8-FO 7-;O/,-N01D/08-FO,“>O 799O>8NH”F.-.O71.OF.008-FO6,1.O7-;O6,1.O700.-08,-2Oa8/1,8-c./08,-O8NON0899O678-O0./H-8<D.O,-ON0D;8.NO,>O017-NF.-8/O >8NH2OQ17-NF.-8/O6,N78/NO6DN0O\.O/,-N8;.1.;O8-O;.0./08,-2
农业生物技术学报 C,D1-793,>3EF18/D90D1793G8,0./H-,9,FI3333?@@?J%$3（3 B）： ’$(K’%%
转基因鱼的构建及检测 L
杨 弘 吴婷婷 夏德全 LL
（ 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，无锡 ?%B$M%）
33·3 专家论坛·
摘 要 ：转 基 因 鱼 技 术 是 鱼 类 育 种 的 重 要 方 法 之 一 。 介 绍 了 外 源 基 因 的 克 隆 、转 基 因 鱼 的 构 建 及 其 检 测 ，并 指 出 在 进 行 鱼 类 转基因研究中需注意的一些问题：克隆合适的启动子是保证外源基因在转基因鱼中有效表达的重要因素；构建“ 全鱼”基因则 是今后发展的方向，受到越来越多的关注；显微操作技术仍是构建转基因鱼的主要方 法 ；在 转 基 因 鱼 的 检 测 中 ，应 注 意 转 基 因 嵌合体的问题。
了大鳞大麻哈鱼等的生长激素基因。
鱼 类 繁 殖 季 节 ，选 取 成 熟 的 雌 、雄 鱼 ，注 射 垂 体
继生长激素基因之后，抗冻蛋白基因（ BCD）转 或激素催产，分别收集精液和卵子，干法授精。受精
移已成为鱼类基因转移研究的第二个热点)!<+。其目 卵去膜，将裸卵移至 %14J5H:J:H 溶液中，选取质好的