第五章 双水相萃取 应国清老师课件
合集下载
《双水相萃取技术》课件
影响因素
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2
萃取技术—双水相萃取技术(药物分离纯化课件)
内侧流 外侧 分配 萃取物
体 流体 系数
细胞色素 C 磷酸盐 PEG 0.18 肌红蛋白 磷酸盐 PEG 0.009 过氧化氢酶 磷酸盐 PEG 0.12 尿激酶 磷酸盐 PEG 0.65
内侧流 速,cm/s
16.3 4.0 16.3 16.3
外侧流 传质系 速,cm/s 数,cm/s
6.6 5.5?0 -6 5.0 7.5?0 -7 5.0 2.8?0 -5 5.0 2.0?0 -4
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
1.双水相萃取的应用
双水相分离条件 （1） 目的分子与细胞应分配在不同的相 （2） 分配系数应足够大 （3） 离心机容易分离
双水相萃取的应用
分离物质
举例
体系
NaDS-硫酸葡聚糖
酶 核酸 生长素 病毒 干扰素
细胞组织
过氧化氢酶的分离 分离有活性核酸DNA 人生长激素的纯化 脊髓病毒和线病毒纯化 分离β－干扰素
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
2.双水相萃取分离技术的发展方向 （1）廉价双水相体系的开发
优点： (1)蛋白质溶解度大。蛋白质在PPT浓度到15％以前没有沉淀，但在PEG浓度大于
5％时，溶解度显著地减小，在盐溶液中的溶解度更小。 (2)粘度小。PPT的粘度是粗dextran的1/2,传质好。 ⑶价格便宜。PPT几十$/kg,粗dex几百$/kg
系线
TMB：系线连接双节线上两点的 直线。
在临界点处，分配系数为1
临界点
药物分离与纯化技术课程
3．双水相相图
系线反映的信息:
(1)系线长度：衡量两相间相对差别的尺度。越长则两相间性质差 别越大，反之则越小；趋向于零时，（双节线上的点，临界点）， 两相差别消失，成为均一相。
第五章萃取技术.课件
有机溶剂中胶束 的表面活性剂分子的 疏水尾部向外，而亲 水头部向内，称为反 胶束。
当表面活性剂在有机溶剂中形成 反胶束时，水在有机溶剂中的溶解 度随表面活性剂浓度线性增大。
通过测定有机相中平衡水浓度的 变化，可以确定形成反胶束的最低 表面活性剂浓度。
反胶束的形成是表面活性剂分子 自发形成的纳米尺度的聚集体，是热 力学稳定的体系。
K a AH
（5-3）
其中，Ka为弱酸的解离常数；
[AH]和[A-]分别为游离酸和其酸根离 子的浓度。
如果在有机相中溶质不发生缔和， 仅以单分子形式存在，则游离的单分 子溶质符合分配定律，其分配常数为
Aa
AH
AH
（5-4）
其中，AH 表示有机相中游离酸的
浓度，Aa为游离酸的分配常数。
利用一般的分析方法测得的水 相浓度为游离酸和酸根离子的总 浓度，故为方便起见，用水相总
3．物理萃取和化学萃取
物理萃取
定义：溶质根据相似相溶原理在两相间 达到分配平衡，萃取剂与溶质间不发生 化学反应。
应用：广泛应用于抗生素及天然植物中 有效成分的提取。如利用乙酸丁酯萃取 青霉素。
化学萃取
定义：利用脂溶性萃取剂与溶质的化 学反应生成脂溶性复合分子，使溶质 向有机相分配。
应用：用于氨基酸、抗生素和有机酸 等生物产物的分离回收。
液体
双水相萃取
萃取剂
液固萃取（浸取）
固体原料 超临界流体
液体原料
2．反 萃 取
定义：调节水相条件，将目标产物从有机相 转入水相的操作。
作用：为了进一步纯化目标产物或便于后续 分离操作。
洗涤：常常加在萃取与反萃取操作之间，目 的是除去与目标产物同时萃取到有机相的杂 质，提高反萃取液中目标产物纯度。
当表面活性剂在有机溶剂中形成 反胶束时，水在有机溶剂中的溶解 度随表面活性剂浓度线性增大。
通过测定有机相中平衡水浓度的 变化，可以确定形成反胶束的最低 表面活性剂浓度。
反胶束的形成是表面活性剂分子 自发形成的纳米尺度的聚集体，是热 力学稳定的体系。
K a AH
（5-3）
其中，Ka为弱酸的解离常数；
[AH]和[A-]分别为游离酸和其酸根离 子的浓度。
如果在有机相中溶质不发生缔和， 仅以单分子形式存在，则游离的单分 子溶质符合分配定律，其分配常数为
Aa
AH
AH
（5-4）
其中，AH 表示有机相中游离酸的
浓度，Aa为游离酸的分配常数。
利用一般的分析方法测得的水 相浓度为游离酸和酸根离子的总 浓度，故为方便起见，用水相总
3．物理萃取和化学萃取
物理萃取
定义：溶质根据相似相溶原理在两相间 达到分配平衡，萃取剂与溶质间不发生 化学反应。
应用：广泛应用于抗生素及天然植物中 有效成分的提取。如利用乙酸丁酯萃取 青霉素。
化学萃取
定义：利用脂溶性萃取剂与溶质的化 学反应生成脂溶性复合分子，使溶质 向有机相分配。
应用：用于氨基酸、抗生素和有机酸 等生物产物的分离回收。
液体
双水相萃取
萃取剂
液固萃取（浸取）
固体原料 超临界流体
液体原料
2．反 萃 取
定义：调节水相条件，将目标产物从有机相 转入水相的操作。
作用：为了进一步纯化目标产物或便于后续 分离操作。
洗涤：常常加在萃取与反萃取操作之间，目 的是除去与目标产物同时萃取到有机相的杂 质，提高反萃取液中目标产物纯度。
双水相萃取的原理及应用ppt课件
聚合物分子量的影响：
如以Dextran 500(MW 500 000) 代替Dextran 40（MW 40 000）, 即增大下相高聚物的分子量，被 萃取的低分子量物质如细胞色素C 分配系数增加并不显著。然而， 被萃取的大分子量物质，如过氧 化氢酶的分配系数可增大到原来 的6~7倍。
精选ppt
ATPE 的基本原理
精选ppt
1
组员:
刘文荣 王嘉犀 范倩 何亚玲
精选ppt
NF-κB信号通路
2内容 Content1、双水相萃取的历史 2.双水相萃取的基本原理 3.双水相萃取的特点
4.双水相萃取的应用
精选ppt
英英释义
3
ATPE 的历史：
Beijerinck （？？-）
早在1896年,Beijerinck发现,当 明胶与琼脂或明胶与可溶性淀 粉溶液相混时,得到一个混浊不 透明的溶液，随之分为两相,上 相富含明胶,下相富含琼脂(或 淀粉), 这种现象被称为聚合物 的不相溶性，从而产生了双水 相体系(Aqueous two phase system,ATPS)。
精选ppt
ATPE 的历史：
7
ATPE 的基本原理:
萃取：利用物质在两种互不混溶的溶剂中的分配 差异进行分离的技术。 有机溶剂萃取：以与水互不相溶的有机溶剂作萃 取剂从水相中萃取目的产物，广泛应用于抗生素、 有机酸、维生素等发酵产品生产。用于蛋白质、核 酸、酶等生物大分子的分离很少成功。 反萃取：使用水溶液从有机溶剂中萃取水溶性的 物质。
精选ppt
ATPE 的基本原理
12
ATPE 的基本原理:
双水相萃取与 水-有机相萃取的 原理相似,都是依 据物质在两相间 的选择性分配。
精选ppt
如以Dextran 500(MW 500 000) 代替Dextran 40（MW 40 000）, 即增大下相高聚物的分子量，被 萃取的低分子量物质如细胞色素C 分配系数增加并不显著。然而， 被萃取的大分子量物质，如过氧 化氢酶的分配系数可增大到原来 的6~7倍。
精选ppt
ATPE 的基本原理
精选ppt
1
组员:
刘文荣 王嘉犀 范倩 何亚玲
精选ppt
NF-κB信号通路
2内容 Content1、双水相萃取的历史 2.双水相萃取的基本原理 3.双水相萃取的特点
4.双水相萃取的应用
精选ppt
英英释义
3
ATPE 的历史：
Beijerinck （？？-）
早在1896年,Beijerinck发现,当 明胶与琼脂或明胶与可溶性淀 粉溶液相混时,得到一个混浊不 透明的溶液，随之分为两相,上 相富含明胶,下相富含琼脂(或 淀粉), 这种现象被称为聚合物 的不相溶性，从而产生了双水 相体系(Aqueous two phase system,ATPS)。
精选ppt
ATPE 的历史：
7
ATPE 的基本原理:
萃取：利用物质在两种互不混溶的溶剂中的分配 差异进行分离的技术。 有机溶剂萃取：以与水互不相溶的有机溶剂作萃 取剂从水相中萃取目的产物，广泛应用于抗生素、 有机酸、维生素等发酵产品生产。用于蛋白质、核 酸、酶等生物大分子的分离很少成功。 反萃取：使用水溶液从有机溶剂中萃取水溶性的 物质。
精选ppt
ATPE 的基本原理
12
ATPE 的基本原理:
双水相萃取与 水-有机相萃取的 原理相似,都是依 据物质在两相间 的选择性分配。
精选ppt
生物分离工程-第五章-萃取技术PPT课件
mCl
[R Cl - ] [Cl - ]
则
mAKeC mlCl1[H K 2][K H 1 K ]2 21
43
-化学萃取平衡之分配平衡（2）
二（2－乙基己基）磷酸萃取氨基酸为例，其所对应的离 子交换反应
A2(H2RA ) R(3H H R )
KeH[A[AR]([(HH3R]R[2)H])]
氨基酸的表观分配系数为
6
生物产品萃取根据分子量大小划分
小分子类 化合物相对分子量约小于1000，如氨基酸、 抗生素、维生素、有机酸等，采用有机溶 剂萃取
大分子类 相对分子量大于1000，如酶，抗体，蛋白 质等，有机溶剂不适用，可选用反胶团萃 取、双水相萃取等
7
工业上生产青霉素
大多采用醋酸丁酯为萃取剂，pH=1.8～2.2， 相比VO/VW=1/2～1/2.5，温度5℃，反萃取过 程采用碳酸氢钾或碳酸钾水溶液为反萃取剂。
A
A+
A+
AA+
A AClA
有机相
R+Cl-
RR++CA-l-
R+Cl-
R+Cl-
R+Cl-
42
化学萃取平衡之分配平衡
季胺盐萃取氨基酸为例，其所对应的离子交换反应
R C lA R A -C l
[RA-][Cl- ] KeCl [RCl- ][A- ]
氨基酸和氯离子对应的表观分配系数分别为
[R A- ] mA cA
51
2、双水相形成
当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作 用时，即一种分子周围将聚集同种分子而 排斥异种分子，则在达到平衡时，就形成 分别富含不同聚合物的两相 。
《双水相萃取技术g》PPT课件
精选ppt
11
1.2.2 疏水作用
PEG/Dx和PEG/无机盐等双水相系统的上相(PEG相)疏水 性较大，相间的疏水性差用疏水性因子HF (hydrophoblc factor)表示。HF可通过测定疏水性已知的氨基酸在其等电点 处的分配系数maa测算
l酸的相对疏水性(relative hydrophobicity)， 是通过测定氨基酸在水和乙醇中溶解度的差别确定的，并设 疏水性最小的甘氨酸的RH＝0。所以上式中 B为
聚丙二醇、聚乙二醇 甲基纤维素
羧甲基纤维素钠盐
磷酸钾、硫酸铵、硫酸钠 硫酸镁、酒石酸钾钠
精选ppt
5
a 系线 两相区
双节线 均相区
b
两相区 系线
双节线 均相区
临界点
图分别为PEG/葡萄糖(Dx)和精P选EpGpt/磷酸钾(KPi)系统的典型相图 6
在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分 成组成相同而体积不同的两相。两相的体积近似 服从杠杆规则，即
可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二 醇(polyethylene glycol,略作PEG)/葡聚糖 (dextran，略作Dx)，聚丙二醇(polypropylene glycol) / 聚乙二醇和甲基纤维素 (methylcellulose)/葡聚糖等。双水相萃取中常采 用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相的上相富 含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合 物与无机盐的混合溶液也可形成双水相。
双水相萃取技术
1.1 双水相系统 1.2 双水相中的分配平衡 1.3 影响物质分配平衡的因素 1. 4 双水相系统的应用
精选ppt
1
1.1 双水相系统
• 基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需 经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的 变化给固－液分离带来了困难，同时这类产品的 活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素 特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并 且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采 用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法 可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。
双水相萃取ppt
天然植物药用有效成分的分离与提取
中草药是我国医药宝库中的瑰宝 ,已有数千 年的历史 ,但由于天然植物中所含的化合物 众多 ,特别是中草药有效成分的确定和提取 技术发展缓慢 ,使我国传统中药难以进军国 际市场。因此 ,采用具有较高选择性和专一 性的双水相萃取技术对中草药有效成分的 提取是一项很有意义的工作。利用双水相 萃取中草药有效成分具有代表性的工作是 对黄岑甙和黄岑素的分离。
抗生素的分离与提取
数抗生素都存在于发酵液中 ,提取工艺路线复杂 ,能耗 高 ,提取过程易变性失活。而双水相萃取在抗生素中具 有较大的应用价值 ,萃取提取涉及到各类抗生素。β 内酰胺类抗生素是抗生素家族中应用最多的一类 ,主要 由青霉素类和头孢菌素类构成。对青霉素进行工业化意 义的双水相萃取是结合传统工艺溶媒萃取法进行的。先 以 PEG2000/ (NH4) 2SO4系统将青霉素从发酵液中提取 到 PEG相 ,后用醋酸丁酯(BA)进行反萃 ,再结晶 ,处理 1000ml 青霉素发酵液 ,得青霉素晶体 7. 228g ,纯度 84. 15 % ,三步操作总收率 76. 56 %。
酶工程药物的分离与提取
酶在医药方面的应用一是作为药用酶 ,二是用作化学合 成药物中的酶催化剂。迄今 ,双水相萃取技术已广泛应 用于生物大分子、细胞、细胞器、蛋白质、核酸、病毒、 细菌、蓝藻、叶绿素、线粒体、 菌体等的分离与提取 , 几乎所有的酶均可用此技术仅通过调节 pH、合物和盐的 种类或浓度 ,选择合适的分离条件就可进行理想的分离 纯化。目前双水相萃取技术已成功应用于已较大规模提 取纯化的酶有几十种 。其中成功地实现从微生物细胞碎 片中提取纯化甲酸脱氢酶 ,其分离经 4 次连续萃取 ,已 达处理 50kg 湿细胞规模 ,处理的酶蛋白含量已高达 150g ,收率为 90 %～100 % ,由于工艺简单 ,原材料成 本较低 ,产品的价格也有大幅度降低。
生物工艺下游技术双水相萃取课件PPT
利用上式可确定不同ATPS的HF值.如 在pH = pI的ATPS中, pro的m0与HF值之 间呈线性关系, 则直线的斜率定义为该蛋 白质的HFS
图为蛋白质的m0与HF的实测关系图。 图的结果示：pro的HFS随NaCl浓度的增 大而增大。将盐对pro的HF影响上式得：
其中HFSsalt为盐增加而引起的HFS值增量。 因此，m的一般形式
系线： HF可通过测定疏水性已知的aa在其pI处的maa测算:
双节线上两点的直线。
双节线 均相区
临界点
两相区 系线
系线反映的信息
A 杠杆规则：系线上各点均 为分成组成相同，而体积 不同的两相。两相体积近 似服从杠杆规则
两水相萃取
杠杆定律 图中W0与NaCl浓度关系为:
这种现象在处理含细胞和固体微粒的料液时尤为严重,细胞或固体微粒容易集中在界面上,给萃取操作带来因难,但对于可溶性蛋白质.
RH-aa相对疏水性 是通过测定aa在水和已醇中溶解度的差别 确定的,并设疏水性最小的Gly的RH=0.所 以,上式中的B为:
mGAly 为TPGSl中y 分的配分系配系数数. 与所其以R, Hp值H=呈p线L 时性a关a系在, 直线的斜率就是该双水相系统的HF值.图 为测定实例.
Pro表面疏水性(HFS,
因此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模 生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。
其中双水相萃取技术又称水溶液两相分配技术是近年来 出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。
双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可 以连续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质2～5 倍，与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率 上还是成本上都要优越得多。
19.4 影响蛋白质m的综合因素
图为蛋白质的m0与HF的实测关系图。 图的结果示：pro的HFS随NaCl浓度的增 大而增大。将盐对pro的HF影响上式得：
其中HFSsalt为盐增加而引起的HFS值增量。 因此，m的一般形式
系线： HF可通过测定疏水性已知的aa在其pI处的maa测算:
双节线上两点的直线。
双节线 均相区
临界点
两相区 系线
系线反映的信息
A 杠杆规则：系线上各点均 为分成组成相同，而体积 不同的两相。两相体积近 似服从杠杆规则
两水相萃取
杠杆定律 图中W0与NaCl浓度关系为:
这种现象在处理含细胞和固体微粒的料液时尤为严重,细胞或固体微粒容易集中在界面上,给萃取操作带来因难,但对于可溶性蛋白质.
RH-aa相对疏水性 是通过测定aa在水和已醇中溶解度的差别 确定的,并设疏水性最小的Gly的RH=0.所 以,上式中的B为:
mGAly 为TPGSl中y 分的配分系配系数数. 与所其以R, Hp值H=呈p线L 时性a关a系在, 直线的斜率就是该双水相系统的HF值.图 为测定实例.
Pro表面疏水性(HFS,
因此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模 生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。
其中双水相萃取技术又称水溶液两相分配技术是近年来 出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。
双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可 以连续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质2～5 倍，与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率 上还是成本上都要优越得多。
19.4 影响蛋白质m的综合因素
双水相萃取(精选双水相萃取PPT,超级有用)概论
基本流程
将含无机盐相冷却，结晶，然后用离心机 分离收集。除此之外还有电渗析法、膜分 离法回收盐类或除去PEG相的盐。
基本流程
3.4 双水相萃取的应用
双水相萃取主要有以下几个方面的应用： 1 在生物工程中的应用 2 在药物分析中的应用 3 在金属分离中的应用 4 双水相萃取分析 5 在其他方面的应用
[3]Kula M R, Krone K H, Hustedt H. Advances in biochemical Engineering, edited by Fiechte A, Berlin, Heideberg, New York 1982,24:73~118 [4] Hustedt H, Krone K H, Menge U, et al. Protein recovery using aqueous twophasw system[J]. Trends in Biotechnol, 1985,31(6):139
基本流程
ATPE工艺流程图如下所示：
PEG+盐
PEG
匀浆液
ATPE
上相（产物） 下相（废料）
循 环
上相（PEG、杂蛋白） 下相（目的产物）
分离 器+盐
ATPE
图1 双水相萃取原则流程图
ATPE的工艺流程图
基本流程
图2 连续错流（2步）萃取回收酶的流程图 图3 三步双水相系统萃取酶的xxx
发展
展望
原理
双水相萃取
流程
设备
一、双水相萃取发展历程
发展历程
1896年，荷兰生物学家Beijerinck发现，当明胶与 琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混合时，得到一 个混浊不透明的溶液，随之分为两相。上相富含 明胶，下相富琼脂(或淀粉)，且两相的大部分是 水，这种现象被称为聚合物的不相溶性，双水相 体系的形成主要是由于聚合物之间的不相溶性 (incomPatibility)[1]。
《两水相萃取法》PPT课件
精选ppt
17
当系线向下移动时，长度逐渐减小，这说明两相的差别 减小，当达到K点时，系线的长度为0，两相间差别消失， 点K称为临界点或褶点。
精选ppt
18
双节线的位置形状与聚合物的分子量有关。分子量越高， 相分离所需的浓度越低；两种聚合物的分子量相差越大，双 节线的形状越不对称。
精选ppt
19
三、分配理论
精选ppt
46
如果产品是蛋白质，并且分配在盐相，则盐可以在错流 过程操作方法下，用超滤或渗析的膜过滤回收。
膜分离是分离和浓缩被纯化的蛋白质并同步去除聚合物 的最佳方法。
精选ppt
47
如果蛋白质积聚在聚乙二醇中，可以通过加入盐来精 制，加入的盐导致蛋白质在盐相中重新分配。
PEG的分离同样可以用膜分离来实现，即用选择性孔 径较大的半透膜来截留蛋白质，同时排除PEG进行回收。
精选ppt
30
如上所述，影响分配系数的因素很多，而且这些 因素相互间又有影响，因此，目前尚不可能定量地关 联分配系数与能独立测定的蛋白质的一些分子性质之 间的关系。适宜的操作条件，只能通过实验得到。
实验可很方便地在10 ml有刻度的离心试管中进 行。如检定工作跟得上，则在几天内就可求得所需的 萃取条件。但有时液体粘度比较大，用吸管操作时容 易引起误差，需要注意。
精选ppt
43
（五）、温度
温度影响相图，特别在临界点附近，尤为显著，因而 也影响分配系数。但是在离临界点较远时，这种影响较小。
大生产中，总采用常温，可节约冷冻费用，这是由于 聚合物对蛋白质有稳定作用，不会引起损失。同时，温度 高时，粘度较低，有利于相的分离操作。
精选ppt
44
（六）、荷电PEG作为成相聚合物
生物分离工程-双水相萃取 66页PPT文档
醇沉法: 通过乙醇沉降发酵浓缩液，去除其中生物大分子 缺点：乙醇用量较大，且沉降过程中1,3-丙二醇损失
硫酸铵沉降法: 通过硫酸铵沉降去除发酵液中生物大分子 缺点：盐用量较多，1,3-丙二醇沉降过程中有损失
醇沉+硫酸铵沉降= 新型双水相萃取
萃取1,3-PD的双水相系统
实验材料： 有机溶剂：甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇等 无 机 盐：磷酸钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、氯化钠、 碳酸钠等
2 双水相体系的系线和相图的制作
在双水相体系组成成分确定以后,首先要配制双水相
体系, 而双水相体系的配制依据是体系的相图, 所以, 在配制双水相体系以前应先把该体系的相图(包括系线) 制作出来 以 PEG/(NH4)2SO4 体系为例: 从 PEG/(NH4)2SO4 的量可得出体系组成的质量分数,混合分相后,测出上相 和下相中PEG、(NH4)2SO4的含量, 由此可得到3个点即加 料点、上相点和下相点,然后调整PEG或(NH4)2SO4的量,重 将得到的所有的上相点和下相点在坐标图上用光滑曲线 连接起来组成双节曲线,而每1次的加料点、上相点和下 相点的连线则为系线。
85.1
3 9.99 10.26 0.031 322.3
93.1
93.8
95.1
99.8
85.9
表4. 2 在3000 g体系中双水相直接萃取发酵液
No. K2,3-BD Kacetoin Kglucose
KS
Y2,3-BD(%) Yacetoin(%) Rglucose(%) Rcells(%) R protein(%)
28.3和98.1% 乙醇/碳酸钠体系 发酵液中2,3-丁二醇的分配系数和回收率分别可达
15.1和94.3% 异丙醇/硫酸铵体系 发酵液中2,3-丁二醇的分配系数和回收率分别可达
硫酸铵沉降法: 通过硫酸铵沉降去除发酵液中生物大分子 缺点：盐用量较多，1,3-丙二醇沉降过程中有损失
醇沉+硫酸铵沉降= 新型双水相萃取
萃取1,3-PD的双水相系统
实验材料： 有机溶剂：甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇等 无 机 盐：磷酸钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、氯化钠、 碳酸钠等
2 双水相体系的系线和相图的制作
在双水相体系组成成分确定以后,首先要配制双水相
体系, 而双水相体系的配制依据是体系的相图, 所以, 在配制双水相体系以前应先把该体系的相图(包括系线) 制作出来 以 PEG/(NH4)2SO4 体系为例: 从 PEG/(NH4)2SO4 的量可得出体系组成的质量分数,混合分相后,测出上相 和下相中PEG、(NH4)2SO4的含量, 由此可得到3个点即加 料点、上相点和下相点,然后调整PEG或(NH4)2SO4的量,重 将得到的所有的上相点和下相点在坐标图上用光滑曲线 连接起来组成双节曲线,而每1次的加料点、上相点和下 相点的连线则为系线。
85.1
3 9.99 10.26 0.031 322.3
93.1
93.8
95.1
99.8
85.9
表4. 2 在3000 g体系中双水相直接萃取发酵液
No. K2,3-BD Kacetoin Kglucose
KS
Y2,3-BD(%) Yacetoin(%) Rglucose(%) Rcells(%) R protein(%)
28.3和98.1% 乙醇/碳酸钠体系 发酵液中2,3-丁二醇的分配系数和回收率分别可达
15.1和94.3% 异丙醇/硫酸铵体系 发酵液中2,3-丁二醇的分配系数和回收率分别可达
双水相萃取详细资料(ppt 44页)
双水相萃取
方盼 赵梅
目录
（一）两水相的形成 （二）相图 （三）分配理论 （四）影响分配的参数 （五）应用
Question
• 常用的溶液萃取法能用来提 取生物大分子如蛋白质吗？
Reason
➢大部分萃取采用一个是水相，另一个是有机相 ➢蛋白质遇到有机溶剂，易变形失活 ➢有些蛋白质有极强地亲水性，不能溶于有机溶剂。
使蛋白质易分配于富含该PEG的相中，使分配系数 增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降 低，这是一条普遍规律
这是因为成相聚合物的疏水性对酶等亲 水性物质的分配产生较大的影响。
同一聚合物的疏水性随分子量的增大而 增大，当PEG的分子量增加是，在质量浓 度不变的情况下，其两端羟基数减少，疏 水性增加，亲水性的蛋白质不再向富含 PEG相中聚集，而转向另一相。 那么，分子量降低时，蛋白质就易分配 于富含PEG的相了
结论：加入适当的 盐类，会大大促进 带相反电荷的生物 大分子的分离。
pH
pH值对分配的影响源于两个方面的原因： （一）pH值会影响蛋白质中可以解离基团
的解离度，因而改变蛋白质所带的电荷和 分配系数。
lnKlnK0R FT Z
（二）pH值会影响磷酸盐的解离程度， 改变H2PO4-和HPO42-之间的比例， 而影响分配系数。
双水相系统
PEG = 聚已二醇 Kpi = 磷酸钾 DX = 葡聚糖
双水相萃取:
利用生物大分子在两种水相之间的分配比 例不同而达到分离纯化生物大分子的目的。
（二）相图
两种高聚物的水溶液，当它们以不同的比例 混合时，可形成均相或两相，这种水性两相 的形成条件和定量关系，常用相图来表示， 它是一条双节线。
K=C1/C2 C1代表上相浓度，C2代表下相浓度。当相
方盼 赵梅
目录
（一）两水相的形成 （二）相图 （三）分配理论 （四）影响分配的参数 （五）应用
Question
• 常用的溶液萃取法能用来提 取生物大分子如蛋白质吗？
Reason
➢大部分萃取采用一个是水相，另一个是有机相 ➢蛋白质遇到有机溶剂，易变形失活 ➢有些蛋白质有极强地亲水性，不能溶于有机溶剂。
使蛋白质易分配于富含该PEG的相中，使分配系数 增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降 低，这是一条普遍规律
这是因为成相聚合物的疏水性对酶等亲 水性物质的分配产生较大的影响。
同一聚合物的疏水性随分子量的增大而 增大，当PEG的分子量增加是，在质量浓 度不变的情况下，其两端羟基数减少，疏 水性增加，亲水性的蛋白质不再向富含 PEG相中聚集，而转向另一相。 那么，分子量降低时，蛋白质就易分配 于富含PEG的相了
结论：加入适当的 盐类，会大大促进 带相反电荷的生物 大分子的分离。
pH
pH值对分配的影响源于两个方面的原因： （一）pH值会影响蛋白质中可以解离基团
的解离度，因而改变蛋白质所带的电荷和 分配系数。
lnKlnK0R FT Z
（二）pH值会影响磷酸盐的解离程度， 改变H2PO4-和HPO42-之间的比例， 而影响分配系数。
双水相系统
PEG = 聚已二醇 Kpi = 磷酸钾 DX = 葡聚糖
双水相萃取:
利用生物大分子在两种水相之间的分配比 例不同而达到分离纯化生物大分子的目的。
（二）相图
两种高聚物的水溶液，当它们以不同的比例 混合时，可形成均相或两相，这种水性两相 的形成条件和定量关系，常用相图来表示， 它是一条双节线。
K=C1/C2 C1代表上相浓度，C2代表下相浓度。当相
(生化工程课件)两水相萃取
双水相萃取应用得最多的是胞内酶的提取。 这种温和的萃取不仅有利于保护目的物的生物活 性，而且目的蛋白得率高，纯度高，但目的物还含 有少量的核酸和多糖，进一步提高目的蛋白的纯度， 可从双水相体系和萃取操作方式两方面进行改进。 PEG衍生物：在PEG上引入亲和基团或离子基团； 采用多级萃取。
在两水相系统中进行转化翻译功能，如 酶促反应，可以把产物移入另一相中， 消除产物抑制，因而提高了产率。这实 际上是一种反应和分离耦合的过程，有 时也称为萃取生物转化；如果发生的是 一种发酵过程，则也称为萃取发酵，因 而此时也可以把两水相系统称为两水相 反应器。
相 图
相图
双结线， 上相（T，轻相） 下相（B，重相） 结点 临界点 系线
杠杆定律
19.3 双水相萃取过程的理论基础
表面自由能的影响 表面电荷的影响
表面积
电荷
3、物质在两相中的分配
和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数 K表示。
CT K= ——
CB Ct、CB——分别代表上相、下相中溶质的浓度 K—与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。 1）表面自由能的影响(大分子物质表面性质对K影响很大) 2）表面电荷的影响(盐效应：两相系统中如存在盐,对K影响较大) 3）综合考虑（影响因素很多，单因素定量很困难，最佳操作条件靠实验） 4）影响分配平衡的参数 (1)聚合物的影响； (2)体系中无机盐离子的影响； (3)体系PH的影响； (4)体系温度的影响； (5)体系中微生物的影响。
四、双水相萃取的应用
1. 双水相萃取法常用于胞内酶提取。 目前已知的胞内酶约2500种，但投入生产的很少。 原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步系将细胞 破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞 碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离 的方法，但非常困难。双水相系统可用于细胞碎片以 及酶的进一步精制。
在两水相系统中进行转化翻译功能，如 酶促反应，可以把产物移入另一相中， 消除产物抑制，因而提高了产率。这实 际上是一种反应和分离耦合的过程，有 时也称为萃取生物转化；如果发生的是 一种发酵过程，则也称为萃取发酵，因 而此时也可以把两水相系统称为两水相 反应器。
相 图
相图
双结线， 上相（T，轻相） 下相（B，重相） 结点 临界点 系线
杠杆定律
19.3 双水相萃取过程的理论基础
表面自由能的影响 表面电荷的影响
表面积
电荷
3、物质在两相中的分配
和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数 K表示。
CT K= ——
CB Ct、CB——分别代表上相、下相中溶质的浓度 K—与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。 1）表面自由能的影响(大分子物质表面性质对K影响很大) 2）表面电荷的影响(盐效应：两相系统中如存在盐,对K影响较大) 3）综合考虑（影响因素很多，单因素定量很困难，最佳操作条件靠实验） 4）影响分配平衡的参数 (1)聚合物的影响； (2)体系中无机盐离子的影响； (3)体系PH的影响； (4)体系温度的影响； (5)体系中微生物的影响。
四、双水相萃取的应用
1. 双水相萃取法常用于胞内酶提取。 目前已知的胞内酶约2500种，但投入生产的很少。 原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步系将细胞 破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞 碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离 的方法，但非常困难。双水相系统可用于细胞碎片以 及酶的进一步精制。
双水相萃取与应用课件
• 溶剂对目标组分选择性强，大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程简化，易于工业放大和连续操作。
• 分相时间短，常温常压下自然分相时间一般为5-10min。
• 目标产物的分配系数一般大于3，大部分情况下目标产物的收率较高。
• 聚合物的浓度、无机盐的种类和浓度，以及体系的pH值等多种因素都可以对被萃取物质在两相的分配产生影响，因此 可以利用多种手段来使反应达到最佳条件。
双节线
葡聚糖（%） PEG/葡聚糖系统相图
相图中TCB连线为一双节线，双节线下方为单相区； 双节线上方为两相区。如果系统组成处于该区，如M点时， 系统分为两相，而上相和下相的组成分别为通过M点与双 节线相交的T和B点相对应的组成。上相主要含有PEG，下 相主要含有葡聚糖或盐。两相平衡时，符合杠杆规则。 当用υ T代表上相体积，υ B代表下相体积时，则
A
聚乙二醇(PEG)
几种典型双水相系统
B C
硫酸葡聚糖酸钠 羧甲基葡聚糖酸钠 羧甲基葡聚糖酸钠
D
聚乙二醇
A, B, C, D, E,
聚乙二醇 葡聚糖 两者均为非离子性聚合物, 一种非离子性聚合物，另一种为带电荷的聚电解质 两者均为聚电解质, 一种聚合物，另一种为盐。 一种聚合物，另一种为有机小分子
E
某些水溶性聚合物溶液与某些盐溶液混合，两者浓度达到一定值时， 也会分为两相，形成聚合物-盐双水相系统。机理不清楚。一种解释为“ 盐析”作用。 无机盐和简单的有机盐均可，其成相相对能力与其盐析能力次序基 本一致。阴离子作用比阳离子重要，多原子离子比单原子离子更有效， 成相浓度低。大而电荷密度低的单原子阴离子容易与PEG分子中 的氧 偶极子发生作用，成相浓度高，无法使用。但它们可以作为中性盐添加 组分加入聚合物/聚合物和聚合物/盐系统中，用于改变分配系数。 对于聚合物/盐系统，因盐比葡聚糖便宜得多，使得聚乙二醇(PEG)/ 盐系统具有工业上应用优势。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
二、双水相系统的相图
三、双水相萃取的分配平衡公式
c1 λ 1 A + Z（U 1 − U 2） = exp c2 KT
四、影响双水相萃取分配平衡的因素
• 高聚物的种类与浓度 • 高聚物的分子量
一般规律： 一般规律：对于给定的双水相萃取系统，如果其中一种高 聚物被较低分子量同种高聚物所代替，则被萃取的生物大 分子物质将有利于在低分子量高聚物的一相富集。
6.
• 作用力为斥力：形成双水相体系 • 作用力为引力：形成两相，其中一相为两高聚物相，一相 为水相 • 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形成均一相
2)双水相体系的种类
– – – – 两种都是非离子型高聚物（PEG / DEX、聚丙二醇/ DEX等） 其中一种是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX） 两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素/羧甲基葡聚糖钠ห้องสมุดไป่ตู้ 其中一种是无机盐（磷酸盐、硫酸盐等）
第五章 双水相萃取
（Aqueous Two-phase Extraction） ）
一、概述 1、定义——利用生物物质在 ——
互不相溶的两水相间分配系数的 差异进行分离的过程
PEG——聚乙二醇 Dextran(DEX)——葡聚糖
图1 PEG/DEX形成的双水相的组成
2、双水相体系
1) 双水相体系的形成——高聚物分子间的作用力
思考题
1. 2. 3. 4. 5. 何谓双水相萃取？ 双水相体系可分为那几类？目前常用的体系有那两 种？ 为什么说双水相萃取适用于生物活性大分子物质分 离？ 影响双水相萃取的因素有那些？当电解质存在，pH 是如何影响双水相萃取的？ 用双水相萃取细胞破碎（匀浆）液时，一般是把目 标产物分布在上相，而细胞碎片、杂蛋白等杂质分 布在下相，为什么？ 何谓双水相亲和萃取？
• 盐离子 • pH值 • 温度
五、双水相萃取工艺流程
六、双水相萃取应用
1）蛋白酶的提取、纯化 2）核酸的提取、纯化 3）细胞调节生长因子的提取：β—干扰素、EPO等 4）病毒的提取、纯化 5）生物活性物质的分析检测
七、双水相萃取的研究进展
1. 2. 廉价双水相体系的研究开发 双水相萃取与其它分离技术的结合